專利名稱：抗菌肽葛佬素的基因構(gòu)建、制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及葛佬素的cDNA序列、通過葛佬素的cDNA序列制備葛佬素cDNA的方法，通過葛佬素的cDNA序列制備重組抗菌肽葛佬素的方法，屬基因工程領(lǐng)域。
革蘭氏陰性(G-)桿菌膿毒癥和休克是導(dǎo)致臨床病人死亡的主要原因之一，尋找有效的治療措施一直是臨床醫(yī)學(xué)關(guān)注的焦點。
存在于G-桿菌外膜上的內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS)目前認(rèn)為是G-桿菌引起膿毒癥的主要原因。近年的研究表明LPS在全身性炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和代償性抗炎癥綜合征(Compensatory anti-inflammatory responsesyndrome，CARS)中起著重要作用，LPS在體內(nèi)可直接刺激機體單核-吞噬細胞系統(tǒng)分泌包括TNF-α、I1-1和IL-6等細胞因子，這些因子的過度釋放導(dǎo)致機體多器官衰竭甚至死亡。
葛佬素(Gloverin)是存在于蠶蛹中的一種分子量為13.8KD的帶正電荷的陽性蛋白質(zhì)，它含有130個氨基酸，具有殺滅G-桿菌及中和內(nèi)毒素的作用。其最大的特點為其具有高度的穩(wěn)定性，在100℃下10分鐘及強酸強堿的嚴(yán)酷情況下仍可保持活性，克服了蛋白類藥物不穩(wěn)定和不易保存的缺點。
針對葛佬素的報告僅有一篇，其重點是從蠶蛹中直接分離純化葛佬素的方法以及對其進行生物活性的初步研究，尚未見到有關(guān)葛佬素cDNA序列的研究報告。
葛佬素具有殺菌及中和內(nèi)毒素作用，但從蠶蛹中直接分離純化葛佬素的數(shù)量非常有限，遠遠不能滿足臨床和實驗室的要求，因此獲取能夠滿足科研及臨床應(yīng)用的大量的葛佬素必須依賴現(xiàn)代基因工程的方法獲得---即制備重組的葛佬素。而獲得重組葛佬素的基礎(chǔ)是必須知道葛佬素的cDNA序列，但由于葛佬素cDNA的序列目前尚未見報告。因此獲得葛佬素cDNA至關(guān)重要。
本發(fā)明的目的即為公開葛佬素的cDNA。
本發(fā)明的另一目的在于根據(jù)葛佬素cDNA序列，采用化學(xué)合成法及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成得到葛佬素的cDNA，為采用基因工程的方法制備重組的葛佬素奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明的再一目的在于采用基因工程的方法制備具有生物學(xué)活性的抗菌肽葛佬素，用于可殺滅G-桿菌及中和內(nèi)毒素。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為對同種已知蛋白質(zhì)Attacin A cDNA中氨基酸密碼子的出現(xiàn)頻度進行分析，采用出現(xiàn)頻度高的密碼子帶入葛佬素蛋白質(zhì)序列中進行葛佬素的cDNA序列設(shè)計，采用化學(xué)合成法及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)進行葛佬素的cDNA的合成構(gòu)建；另外，本發(fā)明利用葛佬素的cDNA，采用基因工程的方法制備抗菌肽葛佬素，并測定了所得抗菌肽葛佬素的活性。
Attacin A為來自蠶蛹的抗菌抗內(nèi)毒素的蛋白質(zhì)，其cDNA和葛佬素蛋白質(zhì)序列已在文獻中公開發(fā)表，見Kang，D.，Lundstrom，A.andSteiner，H.Trichoplusia ni attacin A，a differentially displayedinsect gene coding for an antibacterial protein.Gene 1996，174(2)，245-249和Axen，A.，Carlsson，A.，Engstrom，A.and Bennich，H.Gloverin，an antibacterial protein from the immune hemolymph ofHyalophora pupae.Eur.J.Biochem.1997；247(2)，614-619。
獲得蛋白質(zhì)cDNA的方法有兩種一是采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)從組織中擴增獲得，該方法的優(yōu)點在于適合序列較長的蛋白質(zhì)和序列未知的蛋白質(zhì)，缺點為實驗過程復(fù)雜，實驗要求高，花費大；二是采用化學(xué)合成法根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列合成得到，該方法的優(yōu)勢在于實驗簡單、快速，實驗要求低，花費少，適用于序列短的、氨基酸序列已知的蛋白質(zhì)的cDNA構(gòu)建。
獲取葛佬素的cDNA的方法有兩種，可以采用RT-PCR法從組織中擴增獲得葛佬素的cDNA，也可以采用化學(xué)合成的方法合成寡核苷酸引物后采用PCR重疊延伸法擴增獲取目的基因。RT-PCR法包括在內(nèi)毒素刺激蠶蛹后，抽提蠶蛹細胞總RNA；以總RNA為模板，采用Oligo dT和隨機引物進行RT-PCR獲取cDNA；以cDNA為模板，采用1對葛佬素引物，采用PCR方法獲取葛佬素全長cDNA，進行序列測定、鑒定。采用化學(xué)合成的方法合成，即以單核苷酸為原料，由自動化的儀器自行完成寡核苷酸引物的合成，采用PCR重疊延伸法擴增獲取目的基因。
本發(fā)明中所構(gòu)建的葛佬素的cDNA序列即采用化學(xué)合成法合成寡核苷酸引物，采用PCR重疊延伸法擴增獲取目的基因。
采用DNA序列測序的方法，可以鑒定所得到的DNA即為設(shè)計的序列。
具體地說，由于Attacin A是來自蠶蛹的抗菌蛋白質(zhì)，其cDNA序列已知且與葛佬素的cDNA為同種族的已知蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，首先對同種族已知蛋白質(zhì)Attacin A cDNA序列中氨基酸各種密碼子的出現(xiàn)頻度進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Attacin A cDNA中出現(xiàn)頻度高的密碼子，采用出現(xiàn)頻度高的密碼子，如苯丙氨酸Phe采用的密碼子為TTC，亮氨酸采用的密碼子為TTG進行葛佬素的cDNA序列構(gòu)建，通過6條寡核苷酸引物，采用PCR重疊延伸法得到目的基因，即葛佬素的cDNA。將PCR產(chǎn)物即目的基因與克隆載體pUC T載體相連，經(jīng)測序鑒定表明該序列與設(shè)計的完全一致；將目的基因，即葛佬素的cDNA與組織型纖溶酶原激活劑的信號肽序列連接后，克隆入真核細胞載體，將此真核細胞載體轉(zhuǎn)染真核細胞，真核細胞表達葛佬素，得到本發(fā)明的葛佬素并測定了其活性。
本發(fā)明的重組抗菌肽葛佬素可以用于治療內(nèi)毒素血癥、膿毒癥等疾病。
本發(fā)明的優(yōu)點在于采用對同種族已知蛋白質(zhì)cDNA序列中氨基酸各種密碼子的出現(xiàn)頻度進行分析，即可對僅知道蛋白質(zhì)氨基酸序列的葛佬素的cDNA序列進行構(gòu)建，不需進行繁瑣的RT-PCR，用PCR重疊延伸法制備葛佬素的cDNA，進一步通過基因重組的方法制備抗菌肽葛佬素，其過程簡單，花費少，時間短，效率高。
下面結(jié)合附圖和具體實施例詳細描述本發(fā)明。


圖1.葛佬素的蛋白質(zhì)序列；圖2.Attacin A cDNA序列；圖3. 6條寡核苷酸引物；圖4.設(shè)計并合成的葛佬素基因；圖5.本發(fā)明合成的葛佬素的cDNA的儀器測序結(jié)果；圖6.是圖5的葛佬素的cDNA的序列表示；圖7.葛佬素的cDNA與克隆載體pUC T載體相連，提取質(zhì)粒進行Hind III和Aat II雙酶切鑒定；圖8.是產(chǎn)物3載體片段的電泳圖；以下是本發(fā)明的具體實施例，所述的實施例是用于描述辦發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實施例1.對同種族已知蛋白質(zhì)Attacin A cDNA序列中氨基酸各種密碼子，附圖2的出現(xiàn)頻度進行分析，結(jié)果見表1；附圖1為葛佬素的蛋白質(zhì)序列。表1.編碼Attacin A氨基酸密碼子的出現(xiàn)頻度氨基酸 密碼子出現(xiàn)頻度Phe(苯丙氨酸) TTT＝8；TTC＝9；Leu(亮氨酸)TTA＝3；TTG＝9；CTT＝4；CTC＝3；CTA＝1；CTG＝3Ile(異亮氨酸) ATT＝1；ATC＝2；ATA＝0Met(蛋氨酸)ATG＝8；Val(纈氨酸)GTT＝5；GTC＝9；GTA＝8；GTG＝3Ser(絲氨酸)AGT＝7Pro(脯氨酸)CCT＝5；CCC＝4；CCA＝4；CCG＝0Thr(蘇氨酸)ACT＝3；ACC＝5；ACA＝2；ACG＝1Ala(丙氨酸)GCT＝6；GCC＝5；GCA＝4；GCG＝2Tyr(酪氨酸)TAT＝3；TAC＝4His(組氨酸)CAT＝1；CAC＝2Gln(谷氨酰胺) CAA＝4；CAG＝2Asn(天冬酰胺) AAT＝12；AAC＝0Lys(賴氨酸)AAA＝5；AAG＝9Asp(天冬氨酸) GAT＝5；GAC＝10Glu(谷氨酸)GAA＝8；GAG＝3Cys(半胱氨酸) TGT＝0；TGC＝0Trp(色氨酸)TGG＝2Arg(精氨酸)CGT＝4；CGC＝2；CGA＝0；CGG＝1；AGA＝1；AGG＝3Gly(甘氨酸)GGT＝7；GGC＝10；GGA＝8；GGG＝1Stop(終止密碼子) TAG＝12.采用出現(xiàn)頻度高的密碼子，表2，如苯丙氨酸Phe采用TTC進行葛佬素的cDNA序列構(gòu)建，得到附圖4所示的葛佬素的cDNA；表2.構(gòu)建葛佬素cDNA使用的密碼子氨基酸 使用的密碼子Phe(苯丙氨酸)TTCLeu(亮氨酸) TTGIle(異亮氨酸)ATCMet(蛋氨酸) ATGVal(纈氨酸) AGTSer(絲氨酸) TCTPro脯氨酸CCTThr(蘇氨酸) ACCAla(丙氨酸) GCTTyr(酪氨酸) TATHis(組氨酸) CACGln(谷氨酰胺)CAAAsn(天冬酰胺)AATLys(賴氨酸) AAGAsp(天冬氨酸)GACGlu(谷氨酸) GAATrp(色氨酸) TGGArg(精氨酸) CGTGly(甘氨酸) GGAStop(終止密碼子) TAG3.根據(jù)附圖3所示的6條寡核苷酸引物，采用PCR重疊延伸法合成得到附圖4所示的目的基因，即葛佬素的cDNA；具體方法是(1)在PCR反應(yīng)體系加入寡核苷酸引物2和4、dNTP、pfu Taq酶，按下列條件進行94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，4個循環(huán)后，加入寡核苷酸引物1和5，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，30個循環(huán)，純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物(PCR產(chǎn)物1)；(2)在PCR反應(yīng)體系加入寡核苷酸引物3和5、dNTP、pfu Taq酶，按下列條件進行94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，4個循環(huán)后，加入寡核苷酸引物2和6，94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，30個循環(huán)后，純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物(PCR產(chǎn)物2)；(3)在PCR反應(yīng)體系加入dNTP、pfu Taq酶、前述PCR產(chǎn)物1和PCR產(chǎn)物2，進行94℃PCR反應(yīng)預(yù)變性4分鐘后，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，4個循環(huán)后；加入寡核苷酸引物1和6，進行PCR反應(yīng)預(yù)變性4分鐘后，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，30個循環(huán)后，純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物。
4.將PCR產(chǎn)物即目的基因與克隆載體pUC T載體相連，提取質(zhì)粒進行Hind III和Aat II雙酶切鑒定完全正確；見附圖7，其中APCR標(biāo)記物，從下到上237bp，377bp，515bp，697bp，994bp，1543bp；B，C，D，E，F(xiàn)不同克隆質(zhì)粒/Hind III+Aat II雙酶切。
5.重組抗菌肽葛佬素的制備將目的基因與組織型纖溶酶原激活劑的信號肽序列連接后，克隆入真核細胞載體；具體步驟如下第一步、設(shè)計2條引物，5’端引物含有限制性內(nèi)切酶Hind III位點，3’端引物含有限制性內(nèi)切酶Aat II位點。5’端引物5’CCCAAGCTTACTATGGATGCAATGAAGAGAGG 3。
3’端引物5’TCTCGACGTCTCTGGCTCCTCTTCTG 3’。以含有組織型纖溶酶原激活劑全長序列的質(zhì)粒pMM5065為模板，采用PCR方法擴增組織型纖溶酶原激活劑的信號肽序列ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGT CTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGAGCCAGA GACGTCGAGA，純化PCR產(chǎn)物，采用Hind III和Aat II雙酶切PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后再次純化，得到產(chǎn)物1，表示如下5’端AGCTTACTATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAA ATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGAGCCAGAGACGT 3’端；第二步、對含有葛佬素基因的克隆載體pUC T載體進行Hind III和Sal I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，純化約400bp的DNA片段得到產(chǎn)物25’端CACTTGGGACAAGAACATCGGTAACGGTAAGGTTTTCGGTACTTTGGGTCAAAACGACGACGGTTTGTTCGGTAAGGCTGGTTTCAAGCAACAATTCTTCAACGACGACAGA GGTAAGTTCGAAGGTCAAGCCTACGGTACTAGAGTTTTGGGTCCAGCTGGTGGTACTACTAACTTCGGTGGTAGATTGGACTGGTCTGACAAGAACGCTAACGCTGCTTTGGACATCTCTAAGCAAATCGGTGGTAGACCAAACTTGTCTGCTTCTGGTGCTGGTGTTTGGGACTTCGACAAGAACACTAGATTGTCTGCTGGTGGTTCTTTGTCTACTATGGGTAGAGGTAAGCCAGACGTTGGTGTTCACGCTCAATTCCAACACGACTTCTGAG 3’端)；第三步、對含有組織型纖溶酶原激活劑全長序列的真核表達載體，質(zhì)粒pCDS I進行Hind III和Sal I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，純化約8000bp的DNA片段，得到產(chǎn)物3，為載體片段，見附圖8所示的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中雙酶切結(jié)果圖中A為λDNA/HindIII+EcoRI分子量標(biāo)準(zhǔn)，B為pCDS I/HindIII+Sal I；第四步、將產(chǎn)物1與產(chǎn)物2在T4DNA連接酶的作用下16℃連接4小時后，加入產(chǎn)物3再連接12小時；第五步、采用CaCl2法，將第四步的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，對在100μg/ml氨芐青霉素平板上生長的克隆，提取質(zhì)粒進行Hind III和Sal I雙酶切鑒定，對酶切產(chǎn)物含有530bp片段的質(zhì)粒再次進行測序鑒定，經(jīng)測序鑒定表明該序列與所構(gòu)建的完全一致；大量抽取該質(zhì)粒，得到抗菌肽葛佬素。
6.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染COS-7細胞，在轉(zhuǎn)染后72小時收集細胞上清測定其殺滅大腸桿菌J5菌及中和內(nèi)毒素的能力。結(jié)果表明COS-7細胞轉(zhuǎn)染上清具有殺滅大腸桿菌J5菌及中和內(nèi)毒素的能力，而質(zhì)?？蛰d體轉(zhuǎn)染COS-7細胞轉(zhuǎn)染上清則不具有殺滅大腸桿菌J5菌及中和內(nèi)毒素的能力。
本發(fā)明的重組抗菌肽葛佬素可以用于治療內(nèi)毒素血癥、G-桿菌感染以及膿毒癥、肝硬化等疾病。也可以與其他的藥物復(fù)配成組合物用于治療內(nèi)毒素血癥、G-桿菌感染以及膿毒癥、肝硬化等疾病。
本發(fā)明的重組抗菌肽葛佬素可以輔以藥用上可以接受的任何載體或稀釋劑用于治療內(nèi)毒素血癥、G-桿菌感染以及膿毒癥、肝硬化等疾病。
本發(fā)明的重組抗菌肽葛佬素或其組合物可以制成片劑、膠囊、注射液或其他的制劑形式。
本發(fā)明的重組抗菌肽葛佬素或其組合物可以以口服、口含、噴霧、靜脈或肌肉注射的方式給藥。
權(quán)利要求
1.抗菌肽葛佬素的cDNA，序列結(jié)構(gòu)為5’-GACGTCACTTGGGACAAGAACATCGGTAACGGTAAGGTTTTCGGTACTTTGGGTCAAAACGACGACGGTTTGTTCGGTAAGGCTGGTTTCAAGCAACAATTCTTCAACGACGACAGAGGTAAGTTCGAAGGTCAAGCCTACGGTACTAGAGTTTTGGGTCCAGCTGGTGGTACTACTAACTTCGGTGGTAGATTGGACTGGTCTGACAAGAACGCTAACGCTGCTTTGGACATCTCTAAGCAAATCGGTGGTAGACCAAACTTGTCTGCTTCTGGTGCTGGTGTTTGGGACTTCGACAAGAACACTAGATTGTCTGCTGGTGGTTCTTTGTCTACTATGGGTAGAGGTAAGCCAGACGTTGGTGTTCACGCTCAATTCCAACACGACTTCTGAGTCGAC-3’。
2.權(quán)利要求1所述抗菌肽葛佬素的cDNA的合成方法，包括a.對同種族已知蛋白質(zhì)Attacin A cDNA序列中氨基酸各種密碼子的出現(xiàn)頻度進行分析，采用出現(xiàn)頻度高的密碼子進行葛佬素的cDNA序列構(gòu)建，所用密碼子為苯丙氨酸Phe采用TTC，亮氨酸Leu采用TTG，異亮氨酸Ile采用ATC，蛋氨酸Met采用ATG，纈氨酸Val采用AGT，絲氨酸Ser采用TCT，脯氨酸Pro采用CCT，蘇氨酸Thr采用ACC，丙氨酸Ala采用GCT，酪氨酸Tyr采用TAT，組氨酸His采用CAC，谷氨酰胺Gln采用CAA，天冬酰胺Asn采用AAT，賴氨酸Lys采用AAG，天冬氨酸Asp采用GAC，谷氨酸Glu采用GAA，色氨酸Trp采用TGG，精氨酸Arg采用CGT，甘氨酸Gly采用GGA，終止密碼子采用TAG；b.根據(jù)如下的6條寡核苷酸引物，采用化學(xué)合成及PCR重疊延伸法合成得到葛佬素的cDNA；1).5’-GACGTCACTTGGGACAAGAACATCGGTAACGGTAAGGTTTTCGGTACTTTGGGTCAAAACGACGACGGTTTGTTCGGTAAGGCT-3’2).5’-GAAGGTCAAGCCTACGGTACTAGAGTTTTGGGTCCAGCTGGTGGTACTACTAACTTCGGTGGTAGATTGGACTGGTCTGACAAGAAC-3’3).5’-AAACTTGTCTGCTTCTGGTGCTGGTGTTTGGGACTTCGACAAGAACACTAGATTGTCTGCTGGTGGTTCTTTGTCTACTATGGGTAG-3’4).5’-GTACCCTTGACCTTCGAACTTACCTCAGTCGTGTTGAAGAATTGTTGCTTGAATCCAGCCTTACCGAACAAACCGTC-3’5).5’-ACCAGAAGCAGACAAGTTTGATTGGACTGGTCTGACAAGAACGGTCTACCACCGATTTGCTTAGAGATGTCCAAAGCAGCGTTAGC-3’6).5’-GTCGACTCAGAAGTCGTGTTGGAATTGAGCGTGAACACCAACGTCTGGCTTACCTCTACCCATAGTAGACAAAGAACCACC-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述抗菌肽葛佬素的cDNA的合成方法，其中PCR重疊延伸法包括(1)在PCR反應(yīng)體系加入寡核苷酸引物2和4、dNTP、pfu Taq酶，按下列條件進行94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，4個循環(huán)后，加入寡核苷酸引物1和5，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，30個循環(huán)，純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物(PCR產(chǎn)物1)；(2)在PCR反應(yīng)體系加入寡核苷酸引物3和5、dNTP、pfu Taq酶，按下列條件進行94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，4個循環(huán)后，加入寡核苷酸引物2和6，94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，30個循環(huán)后，純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物(PCR產(chǎn)物2)；(3)在PCR反應(yīng)體系加入dNTP、pfu Taq酶、前述PCR產(chǎn)物1和PCR產(chǎn)物2，進行94℃PCR反應(yīng)預(yù)變性4分鐘后，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，4個循環(huán)后；加入寡核苷酸引物1和6，進行PCR反應(yīng)預(yù)變性4分鐘后，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，30個循環(huán)后，純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物。
4.抗菌肽葛佬素的基因，表達如下1 TGATTACGCC AGCTTGCATG CCTGCAGGTC GACTCTAGAC TCGAGGGATC 5051 CAGATCTCCA GTCTTGACGT CACTTGGGAC AAGAACATCG GTAACGGTAA 100101 GGTTTTCGGT ACTTTGGGTC AAAACGACGA CGGTTTGTTC GGTAAGGCTG 150151 GTTTCAAGCA ACAATTCTTC AACGACGACA GAGGTAAGTT CGAAGGTCAA 200201 GCCTACGGTA CTAGAGTTTT GGGTCCAGCT GGTGGTACTA CTAACTTCGG 250251 TGGTAGATTG GACTGGTCTG ACAAGAACGC TAACGCTGCT TTGGACATCT 300301 CTAAGCAAAT CGGTGGTAGA CCAAACTTGT CTGCTTCTGG TGCTGGTGTT 350351 TGGGACTTCG ACAAGAACAC TAGATTGTCT GCTGGTGGTT CTTTGTCTAC 400401 TATGGGTAGA GGTAAGCCAG ACGTTGGTGT TCACGCTCAA TTCCAACACG 450451 ACTTCTGAGT CGACAGACCT GGTCTGCAGG CGGCCGCCCA TGGGATATCA 500501 TCGATCATAT GTCGCCCTAT AGTGAGTCGT ATTACGGTAC CGAGCTCGAA 550551 TTCACTGGCC GTCGTTTTAC AACGTCCGTG ACTGGGAAAA CCCTGGCGTT 600601 ACCCAACTTA ATCNCCTTGC ANNACATCCN NCTTTCGCCA GCTGGCGTAA 650651 TAACCAAAAA GCCCGNACCG ATCNCCTTTC CAACAGTTGC NCAGNCTGAA 700701 TGGCGAATGG CGCCTGATGC CGGTATTTTT TTCTTACNCA TCTGNGCGGT 750751 ATTTCACACC GGATATGGNG CACTNTTAAN CAATTTGGTN TTGATGCCCG 800801 ATAGTTAAGC CAGNCCCGAA NCCCGNCAAA ACCNGTTGAC CCCCCTTGAC 850851 GGGCTTGTTT GTTCCGCATT CNCTTANCAA ACAANTTNNG ACCTTTCGGG 900901 ACTTNTT950。
5.權(quán)利要求4所述重組抗菌肽葛佬素的制備方法，包括將目的基因葛佬素cDNA與組織型纖溶酶原激活劑的信號肽序列連接后，克隆入真核細胞載體；具體步驟如下1)通過2條引物，5’端引物含有限制性內(nèi)切酶Hind III位點，3’端引物含有限制性內(nèi)切酶Aat II位點；5’端引物5’CCCAAGCTTACTATGGATGCAATGAAGAGAGG 3；3’端引物5’TCTCGACGTCTCTGGCTCCTCTTCTG 3’；以含有組織型纖溶酶原激活劑全長序列的質(zhì)粒pMM5065為模板，采用PCR方法擴增組織型纖溶酶原激活劑的信號肽序列ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGT CTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGAGCCAGA GACGTCGAGA，純化PCR產(chǎn)物，采用Hind III和Aat II雙酶切PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后再次純化，得到產(chǎn)物1，表示如下5’端AGCTTACTATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAA ATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGAGCCAGAGACGT 3’端；2)對含有葛佬素基因的克隆載體pUC T載體進行Hind III和Sal I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，純化約400bp的DNA片段得到產(chǎn)物25’端CACTTGGGACAAGAACATCGGTAACGGTAAGGTTTTCGGTACTTTGGGTCAAAACGACGACGGTTTGTTCGGTAAGGCTGGTTTCAAGCAACAATTCTTCAACGACGACAGA GGTAAGTTCGAAGGTCAAGCCTACGGTACTAGAGTTTTGGGTCCAGCTGGTGGTACTACTAACTTCGGTGGTAGATTGGACTGGTCTGACAAGAACGCTAACGCTGCTTTGGACATCTCTAAGCAAATCGGTGGTAGACCAAACTTGTCTGCTTCTGGTGCTGGTGTTTGGGACTTCGACAAGAACACTAGATTGTCTGCTGGTGGTTCTTTGTCTACTATGGGTAGAGGTAAGCCAGACGTTGGTGTTCACGCTCAATTCCAACACGACTTCTGAG 3’端)；3)對含有組織型纖溶酶原激活劑全長序列的真核表達載體，質(zhì)粒pCDS I進行Hind III和Sal I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，純化約8000bp的DNA片段，得到產(chǎn)物3，為載體片段；4)將產(chǎn)物1與產(chǎn)物2在T4DNA連接酶的作用下16℃連接4小時后，加入產(chǎn)物3再連接12小時；5)采用CaCl2法，將第四步的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，對在100μg/ml氨芐青霉素平板上生長的克隆，提取質(zhì)粒進行Hind III和Sal I雙酶切鑒定，對酶切產(chǎn)物含有530bp片段的質(zhì)粒再次進行測序鑒定，經(jīng)測序鑒定表明該序列與所構(gòu)建的完全一致；大量抽取該質(zhì)粒，得到抗菌肽葛佬素。
6.權(quán)利要求3所述抗菌肽葛佬素用于治療內(nèi)毒素血癥。
7.權(quán)利要求3所述抗菌肽葛佬素用于治療G-桿菌感染以及膿毒癥。
8.權(quán)利要求3所述抗菌肽葛佬素用于治療肝硬化。
全文摘要
本發(fā)明公開了葛佬素的cDNA序列,葛佬素cDNA的制備方法以及重組抗菌肽葛佬素的制備方法;通過對同種已知蛋白質(zhì)Attacin A cDNA中氨基酸密碼子的出現(xiàn)頻度進行分析,采用出現(xiàn)頻度高的密碼子帶入葛佬素蛋白質(zhì)序列中進行葛佬素的cDNA序列構(gòu)建,用化學(xué)合成法及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進行目的基因的合成,另外,采用基因重組法制備抗菌肽葛佬素,并測定了其活性。本發(fā)明的制備過程簡單,花費少,時間短,效率高。
文檔編號C07K14/435GK1381465SQ01110740
公開日2002年11月27日 申請日期2001年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月18日
發(fā)明者鄭江, 周紅 申請人:鄭江, 周紅