專利名稱：腫瘤壞死因子抑制肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤壞死因子抑制劑及其應(yīng)用，具體涉及能夠與腫瘤壞死因子特異結(jié)合并抑制其活性的腫瘤壞死因子抑制肽及其應(yīng)用。
腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種有多種生物學(xué)活性的免疫和炎癥介質(zhì)，其在體內(nèi)的過量表達可造成嚴重的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血栓、低血壓、休克、組織損傷甚至死亡。腫瘤壞死因子-α的非正常表達還與一些常見的自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化癥、節(jié)段性回腸炎(Crohn’s)等有關(guān)。因此以抑制腫瘤壞死因子-α為目的的治療藥物，受到人們的廣泛關(guān)注(Andreas等，Immunology Today 18487(1997))。
通過抑制腫瘤壞死因子-α與受體的結(jié)合是一種比較好的抑制腫瘤壞死因子-α活性的方法。目前抑制腫瘤壞死因子-α與受體的結(jié)合有三種方式腫瘤壞死因子-α抗體，可溶性腫瘤壞死因子受體，以及腫瘤壞死因子-α受體模擬肽。最初研究表明，抗腫瘤壞死因子-α抗體可中和腫瘤壞死因子-α的活性，提示腫瘤壞死因子-α抗體可望作為藥物用于炎癥治療。在隨后的研究中，許多公司致力于開發(fā)針對腫瘤壞死因子-α誘發(fā)炎癥的抗體藥物。Centorcor公司生產(chǎn)的抗腫瘤壞死因子-α抗體REMICADE(infliximab)于1998年8月獲FDA批準用于Crohn’s的治療(van Deventer等，Aliment Pharmacl Ther 13 Suppl 43(1999)；Scand JImmunol 5118(2000))，該藥于1999年11月再次獲FDA批準用于RA的治療。這是第一種用于RA治療的抗體類藥物。另外，英國BASF公司在成功實驗了人-鼠雜合抗腫瘤壞死因子-α抗體cA2對RA的治療之后，目前正在開展新抗體D2E7治療RA的三期臨床實驗(Baert等，Int J Colorectal Dis 1447(1999))。研究還表明除了抗腫瘤壞死因子-α的抗體可以中和腫瘤壞死因子-α的活性外，可溶性腫瘤壞死因子-α受體也同樣具有比較好的效果。美國的Immunex公司于1993年就開始研究使用人腫瘤壞死因子R2胞外區(qū)與IgGlFc段融合的重組蛋白(商品名ENBREL)治療RA，并于1998年5月獲得FDA批準，用于RA的臨床治療(Moreland等，Rheum Dis Clin North Am 24579(1998))。1999年5月再次獲準用于青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(JRA)的治療。目前該公司正在實驗用ENBREL治療充血性心力衰竭。
雖然抗腫瘤壞死因子-α抗體、可溶性腫瘤壞死因子-α受體已經(jīng)取得了較好的臨床效果，但還存在一些問題。由于腫瘤壞死因子-α拮抗劑的適用癥主要是一些急性或慢性炎癥，因此實際臨床應(yīng)用時對這些拮抗劑的要求是可以大劑量、長期使用，而且毒副作用小。然而，目前臨床上使用的這些大分子物質(zhì)在來源、穩(wěn)定性、成本(例如Enbrel的分子量為150kDa，一個成年人的用量是50mg/周)以及潛在的副作用等方面存在諸多問題，為了取得更好的治療效果，并降低成本，人們開始把研究的注意力逐步轉(zhuǎn)移到開發(fā)小分子拮抗劑，腫瘤壞死因子R模擬肽就是這樣一種嘗試。
腫瘤壞死因子-α受體小分子模擬肽的研究經(jīng)歷了三個階段，最初人們嘗試根據(jù)抗-腫瘤壞死因子-抗體或可溶性腫瘤壞死因子R上與配體結(jié)合有關(guān)的氨基酸一級結(jié)構(gòu)進行多肽合成和藥物篩選。但由于氨基酸的一級結(jié)構(gòu)不能完全反映蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，因此很難達到理想的拮抗效果(Lie等，Biochemical andBiophysical Research Communication 188503-509(1992))。后來由于腫瘤壞死因子-腫瘤壞死因子R復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，Takasaki等借助計算機的模擬，確定受體-配體結(jié)合位點的關(guān)鍵氨基酸，并合成了一系列肽模擬物(Takasaki等，Nature Biotech，151266(1997))。他們發(fā)現(xiàn)其中一些肽模擬物無論是在受體結(jié)合還是生物學(xué)活性方面，都具有拮抗腫瘤壞死因子-α的作用，其中最好的拮抗劑的IC50可達5μM。但開展這項研究首先要對細胞因子及其受體空間結(jié)構(gòu)，以及對細胞因子的功能部位有深入研究，而且即使是象腫瘤壞死因子-腫瘤壞死因子R這樣晶體結(jié)構(gòu)已知的體系，由于單純從配體結(jié)構(gòu)分析入手得到的信息是十分有限的，尤其是腫瘤壞死因子-腫瘤壞死因子R間作用位點幾乎分布在整個三聚體表面，因此仍然很難明確究竟哪個位點是最重要的，必須合成一系列的多肽，這樣就存在一定的風(fēng)險。目前這一條路線的成功率還很低。
隨著80年代后期崛起的一種研究蛋白質(zhì)間相互作用的有力工具—噬菌體展示技術(shù)的成熟和發(fā)展，對腫瘤壞死因子-α受體模擬肽的直接篩選工作終于成為可能。由于噬菌體展示技術(shù)的簡單、直接以及豐富的庫容量所賦予的極大的可能性，已成為藥物篩選的首選工具。并且在腫瘤壞死因子-α拮抗劑的篩選中也已得到應(yīng)用。1998年，Chirinos-Rojas等利用隨機14肽庫對腫瘤壞死因子-α進行篩選，得到了一種具有生物活性的結(jié)合肽(Chirinos-Rojas等，Journal ofImmuology 1615621(1998)；Immunology 96109(1999))。但由于他們得到的是單一序列，無法對序列中每個氨基酸的作用進行評價，因此不能做進一步的優(yōu)化，限制了繼續(xù)篩選高親和力的肽配體。
本發(fā)明的目的是提供能夠與腫瘤壞死因子專一結(jié)合，并能夠抑制腫瘤壞死因子活性的腫瘤壞死因子抑制肽。
本發(fā)明的另一目的是提供腫瘤壞死因子抑制肽的用途。
本發(fā)明的腫瘤壞死因子抑制肽，是具有以下通式的12肽H1-X2-4-H1-X0-2-H1-X3-6，其中，H代表組氨酸殘基，X代表任何天然L-氨基酸殘基或其D-異構(gòu)體，腳注數(shù)字代表氨基酸殘基的個數(shù)。
具有上述結(jié)構(gòu)模式的多肽可與腫瘤壞死因子專一結(jié)合，并阻斷腫瘤壞死因子與受體的結(jié)合，從而抑制腫瘤壞死因子的生物學(xué)活性，包括腫瘤壞死因子的細胞毒性以及腫瘤壞死因子誘導(dǎo)細胞凋亡的活性。此類結(jié)構(gòu)模式即可以多肽形式單獨存在，也可與其它蛋白或多肽融合，或插入蛋白質(zhì)表面的特定部位，如凸環(huán)區(qū)，或與其它物質(zhì)連接。無論以什么形式存在，含此結(jié)構(gòu)模式的物質(zhì)都可能表現(xiàn)出與腫瘤壞死因子結(jié)合并抑制腫瘤壞死因子活性的作用。
目前雖有腫瘤壞死因子結(jié)合肽的報道，但未能找到在結(jié)合過程中起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基。本發(fā)明通過對一組與腫瘤壞死因子結(jié)合的多肽的結(jié)構(gòu)分析，確定了與腫瘤壞死因子結(jié)合所必須的氨基酸序列模式或稱結(jié)構(gòu)模式，這對于設(shè)計和研制新型抗腫瘤壞死因子的藥物具有重要意義。
研究結(jié)果表明，本發(fā)明篩選到的多肽不僅能夠競爭性地阻斷腫瘤壞死因子與受體的結(jié)合，也能抑制腫瘤壞死因子對細胞的細胞毒性，因而可望成為新的抗腫瘤壞死因子藥物或藥物前體，為各種炎癥或相關(guān)免疫性疾病的治療提供了一條新的途徑。本發(fā)明的腫瘤壞死因子抑制肽在制造抗腫瘤壞死因子的藥物中具有廣泛的應(yīng)用價值及廣闊的市場前景。
另外，腫瘤壞死因子結(jié)合肽作為生物制劑也有著潛在的應(yīng)用價值，如作為配體用于腫瘤壞死因子的親和純化、作為探針用于腫瘤壞死因子的檢測等等。
根據(jù)腫瘤壞死因子結(jié)合肽序列模式的多種存在形式，可以有多種獲取含此序列模式物質(zhì)的方法，如固相方法，溶液中合成，用基因工程方法生產(chǎn)重組蛋白，以及通過其他化學(xué)方法合成。含此序列模式的物質(zhì)可有各種應(yīng)用方式，主要包括在體外和體內(nèi)抑制腫瘤壞死因子的活性，以各種給藥方式實現(xiàn)以抑制腫瘤壞死因子活性為目的的疾病治療，以及腫瘤壞死因子的檢測或純化等。
含本發(fā)明序列模式的物質(zhì)在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用還包括1、通過合成或基因重組的方式，將含此序列模式的肽段與其他蛋白或肽融合，用于以抑制腫瘤壞死因子活性為目的的各種感染性疾病、自免疫疾病以及其他相關(guān)疾病的治療。
2、將其與瓊脂糖偶聯(lián)后，用于腫瘤壞死因子的親和分離。
3、將其與指示標簽偶聯(lián)后，用于腫瘤壞死因子的鑒定。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明。


圖1為ELISA方法檢測噬菌體展示多肽與TNF-α結(jié)合的結(jié)果圖2-A為TNF-α競爭性受體結(jié)合抑制實驗的結(jié)果曲線圖2-B為TNF-α競爭性受體結(jié)合抑制實驗的結(jié)果曲線圖3為TNF-α對TNF-α細胞毒活性抑制實驗的結(jié)果曲線實施例1、具有代表性的腫瘤壞死因子抑制肽本發(fā)明選用以下6個具有代表性的肽進行說明。
1號肽HPTHLTHTSPKH2號肽HKMHSHPRLTSP3號肽HSLHVHKGLSEL4號肽HLKHHPPYKDAT5號肽HTPKLHSHTHSS6號肽HKYHNHTTALSP實施例2、六個具有代表性肽的合成本發(fā)明具有代表性的6種肽是用下列固相方法合成的。
稱取KR樹脂1g置于反應(yīng)器中，加入二甲基甲酰胺(DMF)溶漲30min，濾除DMF，將Fmoc氨基酸、HBTU、HOBT各0.4mmol和NMM 0.6mmol溶于適量DMF中，將其加入到反應(yīng)器中，于40℃左右振搖2hr，濾除反應(yīng)液，以甲醇、DMF、交替洗滌樹脂各2次，用無水乙醚洗一次。用20％哌啶/DMF溶液脫除Fmoc基。反應(yīng)10min，濾除反應(yīng)液甲醇、DMF交替洗滌樹脂各2次。進行下一個氨基酸殘基的偶聯(lián)。如此依次由C端第一個氨基酸向N端延伸，直到肽鏈組裝完成。合成好的多肽經(jīng)過G10脫鹽柱純化，冷凍干燥保存。
實施例3、ELISA方法檢測噬菌體展示多肽與TNF-α結(jié)合用含濃度為50μg/ml的TNF-α、0.1M NaHCO3，pH8.6的溶液包被酶聯(lián)板，作為樣品孔，如圖1所示的第1、3、5、7、9、11號孔；以不包被TNF-α，加入同樣緩沖液的為對照孔，如圖1所示的第2、4、6、8、10、12號孔。4℃過夜，1％BSA37℃封閉1小時。依次加入展示實施例1的1-6號肽的等量噬菌體克隆(106pfu)，室溫孵育1小時。用50mM Tris-HCI，pH7.5，含150mM NaCI和0.1％土溫20(Tween20)的緩沖液洗3次，以HRP一標記的鼠抗M13噬菌體單克隆抗體孵育，充分結(jié)合后洗滌，再加入OPD顯色。結(jié)果如圖1所示，樣品孔1、3、5、7、9、11均呈現(xiàn)黃色顯色，對照孔2、4、6、8、10、12均沒有顯色，說明六種噬菌體克隆對TNF-α均有較強的親和力。其原理是，用TNF-α包被的樣品孔中的噬菌體與TNF-α結(jié)合后，附著在酶聯(lián)板上，并與用HRP-標記的鼠抗M13噬菌體單克隆抗體結(jié)合而顯色；沒有用TNF-α包被的對照孔中的噬菌體，不會與酶聯(lián)板結(jié)合，在沖洗過程中被洗去，因而用HRP-標記的鼠抗M13噬菌體單克隆抗體也不會附著在酶聯(lián)板上，所以不會顯色。如圖1所示，本實驗進行了A、B、C三次重復(fù)，結(jié)果相同。
實施例4、腫瘤壞死因子結(jié)合肽的競爭性受體結(jié)合抑制實驗先將重組表達并純化的腫瘤壞死因子R1和腫瘤壞死因子R2受體分別包被到酶聯(lián)板上，然后用含BSA的封閉液(含有1％BSA的PBS)封閉。將實施例1中的1-3號肽的合成肽樣品進行系列倍比稀釋后，與等體積的125I-腫瘤壞死因子混勻，再分別加入受體包被的平板上，室溫反應(yīng)4hr。用封閉液充分洗滌后，在γ計數(shù)器中測定放射強度。每個樣品做三個平行孔，以BSA作為對照。抑制百分數(shù)的計算[(cpmBSA-cpm樣品)/cpmBSA]×100％。以抑制百分數(shù)對肽濃度作圖，結(jié)果見圖2-A、圖2-B，其中，橫坐標為肽濃度(μM)，縱坐標為抑制率，三條曲線分別為1、2、3號肽。從圖中可以看出，1-3號肽都可以特異性地抑制腫瘤壞死因子-α與腫瘤壞死因子R1(圖2-A)、腫瘤壞死因子R2(圖2-B)的結(jié)合，IC50值均約為50μM。
由這個結(jié)果推測，篩選到的特異性結(jié)合肽能夠特異性地與腫瘤壞死因子-α受體結(jié)合部位結(jié)合，并抑制腫瘤壞死因子-α與兩種受體的作用。
實施例5、腫瘤壞死因子結(jié)合肽對腫瘤壞死因子-α細胞毒活性的抑制將傳代培養(yǎng)的L929細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔4×103細胞，37℃培養(yǎng)24小時。將不同濃度的實施例1的1-3號合成肽與腫瘤壞死因子-α(濃度為54ng/ml)混合，37℃放置2小時后加入到培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)12小時。棄去培養(yǎng)液，結(jié)晶紫固定及染色，測定595nm的吸光度值。每個樣品濃度做3個平行孔，以只加腫瘤壞死因子孔作為陰性對照，以只加緩沖液孔為陽性對照，抑制百分數(shù)的計算[(OD樣品-OD陰性)/(OD陽性-OD陰性)]×100％。以抑制百分數(shù)對肽濃度作圖，結(jié)果見圖3，其中，橫坐標為肽濃度(μM)，縱坐標為抑制率，三條曲線分別為1、2、3號肽。由圖3可見，3合成肽均能明顯地抑制腫瘤壞死因子-α對L929細胞的殺傷活性。其中在腫瘤壞死因子-α的濃度為54ng/ml(對細胞的殺傷率達到75％)時，2號肽IC50的值為60.3μM。而1號、3號肽的IC50的值均約為100μM。
權(quán)利要求
1.腫瘤壞死因子抑制肽，是具有以下通式的12肽H1-X2-4-H1-X0-2-H1-X3-6，其中，H代表組氨酸殘基，X代表任何天然L-氨基酸殘基或其D-異構(gòu)體，腳注數(shù)字代表氨基酸殘基的個數(shù)。
2.如權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死因子抑制肽，其肽氨基酸殘基的序列為HPTHLTHTSPKH。
3.如權(quán)利要求l所述的腫瘤壞死因子抑制肽，其肽氨基酸殘基的序列為HKMHSHPRLTSP。
4.如權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死因子抑制肽，其肽氨基酸殘基的序列為HSLHVHKGLSEL。
5.如權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死因子抑制肽，其肽氨基酸殘基的序列為HLKHHPPYKDAT。
6.如權(quán)利要求l所述的腫瘤壞死因子抑制肽，其肽氨基酸殘基的序列為HTPKLHSHTHSS。
7.如權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死因子抑制肽，其肽氨基酸殘基的序列為HKYHNHTTALSP。
8.權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死因子抑制肽在制造抗腫瘤壞死因子的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腫瘤壞死因子抑制肽,它是具有以下通式的12肽:H
文檔編號C07K7/08GK1381501SQ01110780
公開日2002年11月27日 申請日期2001年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月20日
發(fā)明者薛沿寧, 鄭莉, 張 杰, 王會信 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所