專利名稱：：用于處理食物的乳酸細(xì)菌的制作方法用于處理食物的乳酸細(xì)菌本發(fā)明是提交于2004年6月18日的美國系列號(hào)10/870,032和作為提交于2003年6月20日的加拿大專利申請?zhí)?,432,907的繼續(xù)申請的、提交于2004年6月18日的國際申請?zhí)朠CT/CA2004/000909的部分繼續(xù)申請；和提交于2003年6月27日的國際申請?zhí)朠CT/CA03/00986的部分繼續(xù)申請。I.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有抗微生物活性的細(xì)菌素分子的CamWacto^wma/toram如'cMm的新菌株。本發(fā)明的細(xì)菌和由所述細(xì)菌或其它細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素可以用于處理食物并作為食物防腐劑。在本發(fā)明的具體應(yīng)用中，將細(xì)菌素和產(chǎn)生所述細(xì)菌素的細(xì)菌菌株用于控制病原菌，而不會(huì)損害肉的貯存期限，所述病原菌包括但不限于肉產(chǎn)品中的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌II.發(fā)明背景Camo^cfen'wwma/torama"cww是多種細(xì)菌中的一個(gè)種屬，其被分類為乳酸細(xì)菌(LAB)。數(shù)個(gè)世紀(jì)以來，已經(jīng)將LAB用在食物和產(chǎn)生發(fā)酵食物的奶制品工業(yè)中。在這種生產(chǎn)中重要的是它們產(chǎn)生提高芳香味和風(fēng)味的化合物的能力(Stiles和Holzapfd，1997;Carr等.，2002)。由它們從發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的多種異構(gòu)體的能力對LAB迸行了表征。非典型的肉桿菌是獨(dú)特的，因?yàn)楸M管能夠從葡萄糖產(chǎn)生實(shí)際上純的L(+)-乳酸，它們不能在pH5.6時(shí)生長在乙酸鹽瓊脂上，并且因?yàn)樗鼈兡軌虬l(fā)酵甘油和甘露醇，在乳酸細(xì)菌中獨(dú)特的性質(zhì)(Holzapfel和Gerber，1983;Shaw和Harding,1984)。C.m/torawflWc"m可以抑制可能的病原菌的一種方法是通過產(chǎn)生細(xì)菌素。細(xì)菌素是通過核糖體合成的能夠殺死緊密相關(guān)的細(xì)菌的低分子量的抗菌蛋白質(zhì)性的物質(zhì)(Klaenhammer,1993)。細(xì)菌素已經(jīng)從牛肉，腐敗的火腿，以及從法式霉菌熟化的軟奶酪中分離(Jack等，1996;Herbin等，1997)。因?yàn)榧?xì)菌素從通常包含LAB的食物諸如肉和奶制品中分離，LAB和細(xì)菌素二者都己經(jīng)被消費(fèi)了數(shù)個(gè)世紀(jì)。從C.ww/tow仿a"CMm產(chǎn)生的細(xì)菌素已經(jīng)顯示對于蛋白水解酶是敏感的。來自C.w"/torawa"cMwLV17的細(xì)菌素在62"C熱處理，煮沸30分鐘過程中以及在121。C髙壓滅菌15分鐘后是穩(wěn)定的。胰蛋白酶，I、IV、VIII、XIV型蛋白酶，a-胰凝乳蛋白酶，e-胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶使細(xì)菌素失活，而非蛋白水解酶則不會(huì)(Ahn和Stiles,1990b)。Piscicolin126，一種由C.ma/taTOma"cwwJG126產(chǎn)生的細(xì)菌素被a-和P-胰凝乳蛋白酶，蛋白酶(I,XIV，XXIII型和胰蛋白酶)失活，但是過氧化氫酶，脂肪酶或溶菌酶沒有這種效果(Jack等，1996)。類似地，由Cw"/torow幼'cwwLV61產(chǎn)生的細(xì)菌素抗熱(10(TC，20分鐘)，但是被a-胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶和蛋白酶K所鈍化。用過氧化氫酶，a-淀粉酶，脂肪酶，磷脂酶C，DNaseI和溶菌酶處理沒有影響抗菌活性(Schillinger等，1993)。該證據(jù)顯示細(xì)菌素的攝入不會(huì)對有益的腸道微生物造成影響。已經(jīng)顯示胰蛋白酶使細(xì)菌素，乳鏈菌肽失活(Hara等，1962)。對于具有新的和有用特性的新的食物防腐劑存在持續(xù)的需要。此外，對于用有效的"天然"防腐劑，尤其是抑制病原微生物的那些取代常用的"化學(xué)"食物防腐劑存在越來越濃厚的興趣。在這方面，已經(jīng)對已知為細(xì)菌素的細(xì)菌蛋白質(zhì)進(jìn)行了相當(dāng)多的研究，其通常具有熱穩(wěn)定性并具有抗微生物活性。近年來，在開發(fā)針對與食物相關(guān)的腐敗和病原性微生物具有拮抗活性的微生物代謝物方面取得了很大進(jìn)展。目前存在許多細(xì)菌素，但是僅有少數(shù)被充分表征并針對食物應(yīng)用進(jìn)行了評估。此外，消費(fèi)者目前強(qiáng)調(diào)最低程度進(jìn)行處理的食物，其是天然的并且無防腐劑。由此，對于應(yīng)用化學(xué)添加劑作為食物防腐劑存在相當(dāng)大的阻力。目前正在研究將由微生物產(chǎn)生的其它生物抑制劑用在食物中。特別感興趣的是抗菌物質(zhì)諸如由乳酸細(xì)菌("LAB")產(chǎn)生的細(xì)菌素。細(xì)菌素是由LAB作為它們代謝的正常副產(chǎn)物產(chǎn)生的抗菌肽和蛋白質(zhì)，其可能是非常有吸引力的天然防腐劑。許多LAB是被充分了解的，在工業(yè)上重要的細(xì)菌，其包括乳球菌屬(iLa"ococc"》，鏈球菌屬(5^印tococcM),片球菌屬(尸eAococcw),明串珠菌屬(Z^Mco"otoc),乳桿菌屬(丄actokzc/〃w力和肉桿菌屬(CamM"cter/聽)。己經(jīng)將它們用于在數(shù)千年間被安全消費(fèi)的發(fā)酵食物的生產(chǎn)中。因?yàn)樗鼈円呀?jīng)達(dá)到作為"安全"微生物的狀態(tài)，它們是天然抗微生物物質(zhì)，諸如細(xì)菌素的特別適合的來源，并且用于食物中。細(xì)菌素可以具有寬泛或窄小的抗菌活性譜，并且不會(huì)致死產(chǎn)生它們的細(xì)胞。細(xì)菌通過產(chǎn)生免疫蛋白質(zhì)來保護(hù)它們免于它們本身的細(xì)菌素的致死效應(yīng)。C.,"Wtoram如'cMm是革蘭氏陽性，非運(yùn)動(dòng)性，非形成孢子的桿形細(xì)菌，最近已經(jīng)將其由乳桿菌屬重新定義到肉桿菌屬。已經(jīng)指出C.m"/tora/m^'cMw是大且多樣的產(chǎn)乳酸細(xì)菌群的其中一種，其代謝葡萄糖產(chǎn)乳酸和抑制一些病原菌生長的其它酸。C.ma/torama"cww首先在鮭魚上發(fā)現(xiàn)，但是自此在從肉類和魚到水果和蔬菜的各種食品中發(fā)現(xiàn)，以超過lX107dU/g的水平通過目前的農(nóng)業(yè)實(shí)踐生產(chǎn)和貯存。已經(jīng)將乳酸細(xì)菌用于食品(例如，酸奶，香腸，蔬菜，面包，酒，奶酪和牛奶)的發(fā)酵和防腐達(dá)數(shù)個(gè)世紀(jì)。在法國已經(jīng)將C.wa/torom油'c用作香腸發(fā)酵中的起始細(xì)菌培養(yǎng)物的部分。盡管應(yīng)用了上述天然防腐劑，仍舊存在對能夠在特定食品中控制病原性和腐敗菌的乳酸細(xì)菌和它們的細(xì)菌素的需要。III.發(fā)明概述本發(fā)明涉及產(chǎn)細(xì)菌素的Cm""o6acfen."mAM"/toramG!"ci/m("C.的新菌株，其以前已知為棲魚肉桿菌(a^朋Z)a"en'Mmp^co/fl)("C./^d/a")，具有優(yōu)越的抗微生物活性。本發(fā)明的新菌株CB1,CB2,和CB3產(chǎn)生多種細(xì)菌素，包括肉桿菌素(Camobacteriocin)BM1禾口piscicolin126。這些細(xì)菌素具有寬泛的抗李斯特菌屬細(xì)菌的活性譜，并且生產(chǎn)菌株生長在冷凍溫度并且不會(huì)導(dǎo)致與其它類似相關(guān)的腐敗微生物相關(guān)的或在食物的典型貯存期限內(nèi)的食物腐敗。本發(fā)明的實(shí)施方案包括在即食(RTE)和新鮮冷裝，加工的肉產(chǎn)品中，優(yōu)選以1x104菌落形成單位(cfU)/g的最大接種濃度用作防腐劑的Ga^7zoZ)(3!cfen'Mmw7a/faroma/7'cww菌株CB1，CB2，CB3，LV17,UAL26，ATCC35586和ATCC43225。本發(fā)明的實(shí)施方案包括通過將Cwa/torawa"ciW7，其經(jīng)過巴氏滅菌或未經(jīng)巴氏滅菌的發(fā)酵物，或其組合應(yīng)用到食物中來處理新鮮食物的方法。在本發(fā)明的這些實(shí)施方案中，細(xì)菌和其經(jīng)過巴氏滅菌或未經(jīng)巴氏滅菌的發(fā)酵物產(chǎn)生可預(yù)測的或受控制的貯藏期限。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，用天然細(xì)菌和其經(jīng)過巴氏滅菌或未經(jīng)巴氏滅菌的發(fā)酵物，或由不同的細(xì)菌產(chǎn)生的一種或多種細(xì)菌素發(fā)酵物的組合處理食物。在本發(fā)明的最優(yōu)選的實(shí)施方案中，用選定的天然細(xì)菌和選定的天然細(xì)菌培養(yǎng)物的經(jīng)過巴氏滅菌或未經(jīng)巴氏滅菌的發(fā)酵物的組合來處理食物。本發(fā)明的實(shí)施方案包括使用本發(fā)明的組合物來進(jìn)一步保護(hù)食品不會(huì)生長革蘭氏陽性病原菌，其包括但不限于，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。本發(fā)明的組合物對于抵抗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌血清型l/2a，1/2b,3a和4b的菌株是有效的。本發(fā)明的方法包括使用一種或多種天然細(xì)菌培養(yǎng)物，同源的經(jīng)過巴氏滅菌或未經(jīng)巴氏滅菌的發(fā)酵物，異源的經(jīng)過巴氏滅菌或未經(jīng)巴氏滅菌的發(fā)酵物，或其組合。本發(fā)明的天然細(xì)菌培養(yǎng)物在上面進(jìn)行了描述。同源發(fā)酵物指典型地根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)制備技術(shù)制備的單一細(xì)菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)物上清液。異源發(fā)酵物指來自典型地根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)制備技術(shù)制備的不同的細(xì)菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)物上清液。同源或異源發(fā)酵物可以是i)經(jīng)過巴氏滅菌的或未經(jīng)過巴氏滅菌的；ii)凍干的；或iii)以別的方式干燥的。兩種或多種細(xì)菌培養(yǎng)物可以是混合的或單獨(dú)添加的。兩種或多種發(fā)酵物可以是混合的或單獨(dú)添加的。與一種或多種發(fā)酵物組合的細(xì)菌培養(yǎng)物可以是混合的或順序添加的。在另一個(gè)示范性實(shí)施方案中，本發(fā)明包括細(xì)菌菌株CB1的培養(yǎng)物。CB1于2003年7月9日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(10801UniversityBoulevard,Manassas,VirginiaUSA20118)，并且收到的登記號(hào)為PTA-5313。在另一個(gè)示范性實(shí)施方案中，本發(fā)明包括細(xì)菌菌株CB2的培養(yǎng)物。CB2于2003年7月9日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(10801UniversityBoulevard,Manassas,VirginiaUSA20118)，并且收到的編號(hào)為PTA-5314。在另一個(gè)示范性實(shí)施方案中，本發(fā)明包括細(xì)菌菌株CB3的培養(yǎng)物。CB3于2003年7月9日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(10801UniversityBoulevard,Manassas,VirginiaUSA20118)，并且收到的編號(hào)為PTA-5315。在另一個(gè)示范性實(shí)施方案中，本發(fā)明包括使用CB1,CB2，和/或CB3，或其組合來處理食物，處理食物上的腐敗菌，處理食物上的病原菌，禾口/或確定可預(yù)測的食物或食品的貯藏期限。菌株CB1，CB2，禾Q/或CB3可以單獨(dú)或組合使用；可以與或不與它們各自的細(xì)菌素一起使用；可以與或不與包含它們各自的細(xì)菌素的發(fā)酵物一起使用；可以與包括、但不限于乳酸細(xì)菌的一種或多種產(chǎn)細(xì)菌素的細(xì)菌組合使用；和/或可以與由不同的細(xì)菌產(chǎn)生的一種或多種細(xì)菌素一起使用；和/或可以與或不與包含產(chǎn)生自不同的細(xì)菌素的一種或多種細(xì)菌素的發(fā)酵物一起使用。在另一個(gè)示范性實(shí)施方案中，本發(fā)明包括保存食物或飲料的方法，所述方法包括將有效量的本發(fā)明的細(xì)菌培養(yǎng)物，單獨(dú)或與發(fā)酵物組合來加入食物或飲料。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)每克或每ct^中102或更少的菌落形成單位("cfo")的量典型地不足以與存在的外來微生物種群競爭。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)比開始的背景微生物區(qū)系IO倍大，典型地每克或每cr^約103cfli或更大足以克服現(xiàn)存的外來細(xì)菌(例如，背景微生物區(qū)系)種群的生長。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到在食品中的外來細(xì)菌的量是可變的。根據(jù)本發(fā)明，所述組合物的量應(yīng)該是外來腐敗菌的量的約io倍或更大。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括處理新鮮的肉。在本發(fā)明的最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括處理或保存新鮮的香腸或真空包裝的維也納香腸。本發(fā)明還涉及使用細(xì)菌組合物和/或由所述組合物產(chǎn)生的細(xì)菌素來處理李斯特氏菌屬(Z^^^^;^.)以抑制肉類中李斯特氏菌屬的生長。本發(fā)明還涉及包含由菌株CB1,CB2，禾Q/或CB3產(chǎn)生的一種或多種細(xì)菌素的發(fā)酵物。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)酵物包括piscicolin126，肉桿菌素BM1，和可鑒定但是仍未進(jìn)行表征的具有抗菌活性的蛋白質(zhì)化合物。在包括細(xì)菌素的本發(fā)明的實(shí)施方案中，細(xì)菌素可以分離自天然來源，可以由一種或多種本發(fā)明的菌株產(chǎn)生，可以由另一個(gè)細(xì)菌菌株產(chǎn)生，或可以通過遺傳修飾，例如使用重組表達(dá)載體產(chǎn)生。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是從未發(fā)現(xiàn)的抗-李斯特氏菌的活性。這樣寬泛的抗-李斯特氏菌譜是杰出的。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是殺菌和抑菌潛能。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是這些細(xì)菌在低至0"C的溫度下生長，這說明它們在對于肉類防腐所必要的冷凍溫度下生長和有效。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是這些菌株本身不導(dǎo)致肉類明顯的腐敗。附圖顯示本發(fā)明的例示性實(shí)施方案，通過它們，這些和其它目的，新的特征和優(yōu)點(diǎn)將容易變得顯而易見。IV.附圖簡述圖1是本發(fā)明的組合物的抗李斯特氏菌活性的曲線圖，圖示了在以每克豬肉香腸樣品接種103禾口104cfu的C.ma/toram油'cMmCB1的情況下，細(xì)菌數(shù)量的減少和對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的四株菌株的混合物的抑制，所述樣品在5'C貯存超過香腸的預(yù)測的15天冷凍貯存期限。圖2是三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的第一個(gè)的曲線圖，圖示了在真空包裝的維也納香腸的表面上，在每cm2存在104cfli的C.wa/toram加'cwwCB1或CB3的情況下，細(xì)菌數(shù)量的減少和對以每cm2102到10、fti接種的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的四株菌株的混合物的抑制，所述維也納香腸在5'C貯存超過產(chǎn)品的12周的冷凍貯存期限。圖3是三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的第二個(gè)的曲線圖，圖示了在真空包裝的維也納香腸的表面上，在每cm2存在104cfo的Cma/torama"cwmCB1或CB3的情況下，細(xì)菌數(shù)量的減少和對以每cm2102到10、fli接種的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的四株菌株的混合物的抑制，所述維也納香腸在5T:貯存超過產(chǎn)品的12周的冷凍貯存期限。圖4是是三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的第三個(gè)的曲線圖，圖示了在真空包裝的維也納香腸的表面上，在每cm2存在104cfo的C.ma/toram加'cMmCB1或CB3的情況下，細(xì)菌數(shù)量的減少和對以每cm2102到10、fii接種的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的四株菌株的混合物的抑制，所述維也納香腸在5。C貯存超過產(chǎn)品的12周的冷凍貯存期限。V.本發(fā)明的具體描述本發(fā)明的組合物包括G3mo6a"en'wwwa/tora附"/cww的菌株，并且每個(gè)產(chǎn)生至少一種，典型地三種細(xì)菌素，C.ma/torom加'cMmCBl產(chǎn)生細(xì)菌素piscicolin126，肉桿菌素BM1，和另一種未鑒定的顯示抗菌活性的細(xì)菌素。C.wfl//。"owa"ci/wCB2產(chǎn)生piscicolin126,肉桿菌素BM1，并且可以產(chǎn)生一種或多種另外的未鑒定的細(xì)菌素。Cma/toram加'cwwCB3產(chǎn)生piscicolin126,肉桿菌素BM1并且可以產(chǎn)生一種或多種另外的未鑒定的細(xì)菌素。本發(fā)明的組合物和方法包括使用一種或多種天然細(xì)菌培養(yǎng)物，同源的經(jīng)過巴氏滅菌的或未經(jīng)過巴氏滅菌的發(fā)酵物，異源的經(jīng)過巴氏滅菌的或未經(jīng)過巴氏滅菌的發(fā)酵物或其組合。上面描述了本發(fā)明的天然細(xì)菌培養(yǎng)物。同源的發(fā)酵物指根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)制備技術(shù)制備的單一細(xì)菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)物上清液。異源發(fā)酵物指根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)制備技術(shù)制備的源自不同的細(xì)菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)物上清液。同源的或異源的發(fā)酵物可以是i)經(jīng)過巴氏滅菌的或未經(jīng)過巴氏滅菌的；ii)凍干的；或iii)以別的方式干燥的。兩種或多種細(xì)菌培養(yǎng)物可以進(jìn)行混合或分別添加。兩種或多種發(fā)酵物可以進(jìn)行混合或分別添加。結(jié)合了一種或多種發(fā)酵物的細(xì)菌培養(yǎng)物可以混合，或連續(xù)添加。本發(fā)明的一個(gè)重要方面包括細(xì)菌發(fā)酵物在新鮮肉類的防腐和處理中的用途。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，由菌株CB1，CB2，或CB3產(chǎn)生的細(xì)菌素似乎協(xié)同作用從而提供比單獨(dú)使用單個(gè)細(xì)菌素更大的保護(hù)和效力。本文所用的新鮮肉產(chǎn)品指生肉或未烹煮過的肉(在冷凍條件下貯藏)，其可以包含或不包含另外的調(diào)味品混合物，并包括完整的或研磨過的肉。加工過的肉產(chǎn)品指這樣的肉類，其已經(jīng)i)調(diào)制和烹煮過的；ii)經(jīng)腌制的;或iii)未經(jīng)腌制以生產(chǎn)可市售產(chǎn)品。希望以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通意義來使用"新鮮的"和"加工過的"。典型的肉類包括，但不限于，維也納香腸，香腸，魚，和家禽。本發(fā)明的組合物和方法還可以用來處理其它食品，包括，但不限于，氣調(diào)(modifiedatmosphere)包裝的蔬菜，真空包裝的意大利面和新鮮包裝的產(chǎn)品。本文所用的預(yù)計(jì)的貯藏期指控制腐敗持續(xù)一段單獨(dú)時(shí)期的能力，到那時(shí)腐敗變得明顯。例如，可以將細(xì)菌應(yīng)用于食品以達(dá)到大約10周或更長的貯藏期，到那時(shí)腐敗可以檢測出來。在10-周貯藏期內(nèi)，本發(fā)明的組合物通過下列途徑中的一種或多種來控制腐敗i)通過應(yīng)用具有已知腐敗時(shí)間的細(xì)菌；ii)通過應(yīng)用產(chǎn)生一種或多種蛋白質(zhì)或細(xì)菌素的細(xì)菌，所述蛋白質(zhì)或細(xì)菌素殺死或控制腐敗菌；或iii)通過它們的組合。本文所用的提高的安全性指潛在病原菌生長的抑制和/或數(shù)目的減少，范圍從殺菌到抑菌。本文所用的顏色保持指食品保持其所需著色的時(shí)間延長。這一概念是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。實(shí)施例實(shí)施例1.Collins等(1987)報(bào)道丄./^c/co/a，丄.<i/vergera禾口丄.cwm's合成主要作為油酸的C18:1異構(gòu)體(A9,10)，表明不同的不飽和脂肪酸合成酶途徑。遺傳同源性分類和化學(xué)以及物理特性也將Z.;^c/co/",和丄.A'v^ge"s置于相同的DNA同源性組中。此外，生化和化學(xué)數(shù)據(jù)表明丄.p&"'co/a禾m.cam"'應(yīng)當(dāng)被(并且已經(jīng)被)簡化成同一屬Z.;^cz'co/a。隨后L./^"'co/a,禾口丄.z'vergera，被重新分類至——個(gè)§]:屬，G3r"o6a"en'wm(L.gen.N.carm's,屬于肉；Gr.dim.n.6aAren》",小棒狀；M.L.neut.W.Cotoen'wm,肉棒)，見Collins等(1987)。當(dāng)16SrRNA序列分析表明肉桿菌屬構(gòu)成乳酸細(xì)菌內(nèi)獨(dú)特的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化枝4時(shí)，這一點(diǎn)得到進(jìn)一步證實(shí)，并包括湖底肉桿菌(C./ww/"Mm),類湖底肉桿菌(C,ater>"Wmm),雞肉桿菌(C.ga〃/"a/^w)和活動(dòng)肉桿菌(C.moMe)(表1)，將La"o6a函sma/tarama"c^進(jìn)一步定義為棲魚肉桿菌的客觀同義詞(Miller等，1974;Collins等,1991;Lai和Manchester,2000;Lai等，2004)。此夕卜，盡管肉桿菌屬最初分類成乳酸桿菌，但在系統(tǒng)進(jìn)化上，該屬相對于腸球菌屬0E"&racoccwO和漫游球菌屬(&gococci^)親緣關(guān)系更近(Hiu等，1984)隨后，麥芽香乳桿菌(Lacto6a"/MSma/toram/cw)菌株DSM20342T，DSM20344和JCM1154的表型和遺傳表征確定了這些菌株也屬于肉桿菌屬。進(jìn)一步與棲魚肉桿菌比較得出結(jié)論這兩個(gè)屬應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為相同。作為結(jié)果，豐西魚肉桿菌韋皮重新分類成Cwwo^3"er/www7o//an^MO^cwmcomb.nov.(Collins等，1991;Mora等，2003)。所以，關(guān)于本發(fā)明的屬將使用G(3rwo^3cen'Mwm"http://aromaWcMm的通用名。表1.肉桿菌屬，它們與先前描述的細(xì)菌的關(guān)系及其生境(Collins等,1987;Collins等，1991;Mora等，2003)。當(dāng)前命名以往命名生境丄.c/z'ver^ra肉類，家禽，熟化霉菌干酪表面家禽家禽肉類，家禽或鮭魚暴使南極湖氺提i義為C.附a/farawZcM^(Collins等,1991)禾卩C.mfl/torcw""'ci/w(Mora等20C.=肉桿菌；L.-乳桿菌。實(shí)施例2.天然存在的C.wfl/torama"③附在歷史上屬于LAB群，其異型發(fā)酵代謝葡萄糖以便由糖生產(chǎn)等摩爾量的乳酸，二氧化碳和乙醇或乙酸，其先前被包括在乳桿菌屬a禱k^〃M)中(Stanier等，1957;Hiu等，1984)。盡管一些研究已經(jīng)表明肉桿菌屬對于L-乳酸鹽是同型發(fā)酵的[產(chǎn)生醋酸鹽、甲酸鹽和co2作為丙酮酸鹽的一些次級(jí)脫羧作用/異化反應(yīng)的終產(chǎn)物(Hiu等，1984;DeBmyn等，1988)]，C.wa/toraw加'cwn的最近描述和表征指出L(+)-乳酸，乙醇和醋酸鹽是異型發(fā)酵產(chǎn)生的(Mora等,2003)。所以，對于本實(shí)施例來說，C.wa/tora願(yuàn)"c應(yīng)已被表征為具有異型發(fā)酵特征。經(jīng)常在遭受某種形式的脅迫的魚中發(fā)現(xiàn)C.wa/toram加'c騰，所述脅迫如發(fā)生在產(chǎn)卵時(shí)或伴隨著運(yùn)輸而發(fā)生的脅迫(Hiu等，1984;Baya等，1991)。Ringo等(2000)還發(fā)現(xiàn)C.wa/torawa"cMm與大西洋鮭魚(Sa/woL.)的消化道相關(guān)聯(lián)。肉桿菌已經(jīng)從冷凍的真空包裝的魚和未經(jīng)加工的牛肉和羔羊肉中分離，在這些生境中它屬于肉類上占優(yōu)勢的LAB(Ahn和Stiles,1990a;Baya等，1991;Bamkat等，2000;Carr等，2002;Paludan-Muller等，1998;Sakala等，2002;Yamazaki等，2003)。在這些研究中使用的方法并未富集或選擇任何具體的細(xì)菌類別或?qū)?。在廣布肉桿菌(C.AVergera)和C.ma/torawa"cww之間的生化和生理學(xué)比較于(表2)中給出。將C."w/toraw加'c顧菌株B270T描述了具有下列特性(Hiu等，1984;Collins等，1987):.革蘭氏陽性，非運(yùn)動(dòng)型，非孢子形成型桿狀，單獨(dú)出現(xiàn)或以短鏈出現(xiàn)；.在許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基上生長良好，所述培養(yǎng)基包括TSA(胰胨豆胨瓊脂糖培養(yǎng)基)和腦心浸液瓊脂糖培養(yǎng)基，和在deMan,Rogosa和Sharpe(MRS)肉湯以及巰基乙酸培養(yǎng)基中；.當(dāng)于25"生長在TSA上24h時(shí)，克隆是細(xì)小的，凸起的，白色，圓形和無色素的；.生長的溫度范圍是6。C-4(TC;最佳溫度是大約3(TC;.最佳pH范圍是從6.0到7.0;.兼性厭氧。通過同型發(fā)酵產(chǎn)生D,L-乳酸鹽，但該屬在某些條件下可以呈現(xiàn)異型發(fā)酵特性；在厭氧生長條件下乳酸生產(chǎn)得以增加；.生長需要葉酸，核黃素，泛酸鹽和煙酸；維生素B12,生物素，維生素Bl和吡哆醛并非必需；.不產(chǎn)生過氧化氫酶和氧化酶；.硝酸鹽未還原成亞硝酸鹽；.氣體產(chǎn)生不定(取決于底物)并且經(jīng)常是陰性的；由精氨酸-MRS肉湯中的葡萄糖產(chǎn)生氣體；.由甘油，核糖，半乳糖，葡糖酸鹽，葡萄糖，果糖，甘露糖，甘露醇，l乙?；咸前?，苦杏仁苷，熊果苷，水楊苷，纖維二糖，蔗糖和海藻糖產(chǎn)生酸;由阿拉伯糖，木糖，山梨糖，鼠李糖，半乳糖醇，肌醇，甲基-D-甘露糖苷，菊粉或松三糖不產(chǎn)生酸；.精氨酸和七葉甙被水解；.在TSITripleSugarIron瓊脂糖)斜面中未檢測到H2S;.耐受0.4和0.6%陰離子去垢劑(Teepol);.細(xì)胞壁肽聚糖包含二氨基庚二酸；.DNAG+C含量為33.7-36.4mol%;.主要細(xì)胞脂肪酸是直鏈飽和和單不飽和型，其中肉豆蔻酸，棕櫚酸，棕櫚油酸和A9,10-油酸占優(yōu)勢；.典型菌株為B270T(ATCC35586),1970年分離自受脅迫的成年山鱒，其飼養(yǎng)于俄勒岡州Coos縣的Bandon鱒魚孵化所。表2.肉桿菌屬的生化和生理學(xué)比較1特征廣布肉桿菌C.附a/torawaWcww由下列物質(zhì)產(chǎn)生酸3Amidon--苦杏仁苷++半乳糖-+13-龍膽二糖++葡糖酸鹽+(-)4+菊粉-+甘露醇-+蜜二糖-+松三糖+(-)+(_)a-甲基-D-葡糖甙-+a-甲基-D-甘露糖甙-+D-塔格糖-+(-)D-松二糖--D-木糖--Voges-Proskauer5++運(yùn)動(dòng)性--△9,10-亞甲基十八烷酸6+-1改寫自(Collins等，1987)。2以往命名為居魚乳桿菌(丄acto6a"7/w;^cz'co/a)和棲魚肉桿菌；3在七天進(jìn)行的讀取。4+(-)=偶發(fā)的菌株陰性；5在API10E系統(tǒng)上進(jìn)行的葡萄糖代謝測試；二菌株都產(chǎn)生精氨酸二水解酶和e-半乳糖苷酶；二菌株對于賴氨酸脫羧酶，色氨酸脫酰胺酶，脲酶，鳥氨酸脫羧酶,吲哚和H2S都是陰性的；6大于15%的總細(xì)胞脂肪酸。堿性pH(高達(dá)pH9.5)促進(jìn)肉桿菌菌落的生長，同時(shí)抑制其它乳桿菌屬?？梢酝ㄟ^改變生長底物來實(shí)現(xiàn)將Cma/torom加'cwm與其它細(xì)菌區(qū)分開來。Cm"/toram",/c"w與腸球菌的區(qū)分包括在顯微鏡下區(qū)分棒狀和球狀，并且生長在包含2%菊粉而非蔗糖的CresolRedThallousAcetateSucrose(CTAS)培養(yǎng)基上。腸球菌不能發(fā)酵菊粉，而當(dāng)C.m"/torawa"cww發(fā)酵菊粉，形成帶有金屬銅光澤的淺黃色至粉紅色的菌落，培養(yǎng)基的黃色改變并且沉淀清除。當(dāng)在CTAS瓊脂糖中以肌苷取代蔗糖時(shí)，C.ma/to/wwcm'cww形成凸起的或e型的菌落。腸球菌也產(chǎn)生培養(yǎng)基的黃化和沉淀的清除，但不具有金屬光澤(Carr等，2002)。C.wa/torowo"c"w的不同菌株顯示產(chǎn)生抑制乳桿菌屬，李斯特氏菌屬和其它肉桿菌屬生長的細(xì)菌素(核糖體合成的，低分子量，抗菌性蛋白質(zhì)物質(zhì)，其能夠抑制緊鄰細(xì)菌的生長或殺死它們)(McMullen和Stiles，1996;Duffes等，1999c;Schillinger等，1993)。實(shí)施例3.已經(jīng)對在此GRAS文獻(xiàn)中列舉的菌株(例如，Camo6acfen'"mma/taram加'cwm菌株CB1,CB2，CB3,LV17,UAL26,ATCC35586和ATCC43225)測試其對于27種抗生素的抗性(表3;GriffithsLabs，2004)?？傮w上，測試的C.ma/toroma&Mw菌株對羥氨芐青霉素+克拉維酸，氯霉素,環(huán)丙沙星，紅霉素，慶大霉素，亞胺培南，萘替米星，利福平，四環(huán)素和妥布霉素敏感。參考抗生素抗性模式(表3),肉桿菌菌株對于與革蘭氏陽性共生菌中的可轉(zhuǎn)移遺傳元件通常關(guān)聯(lián)的那些主要抗生素；具體地，紅霉素,氯霉素和四環(huán)素敏感。Borridlo等(2003)提議當(dāng)用作益生菌劑時(shí)，選定的菌株應(yīng)當(dāng)對兩種以上主要抗生素易感。由Baya等(1991)，Duffes等，(1999b)或Euzeby(2004)所用的抗生素比較表明C.wa/tow/7^^cww菌株(CB1,CB2，CB3，LV17，UAL26,ATCC35586禾BATCC43225)對各種抗生素的敏感性與在分離自天然魚來源的C."w/tora附""'cww菌株中發(fā)現(xiàn)的抗生素抗性充分一致，如表3中所注。在此GRAS檔案中列舉的CWG/tonwrn/Zcwm菌株的抗生素抗性模式與己經(jīng)添加到食物中的或在食物中天然發(fā)現(xiàn)的乳桿菌菌屬的抗生素抗性模式充分一致。這表明將這些cw"/torowa"cwm菌株添加到食物中將不會(huì)添加任何新的或顯著的抗生素抗性決定子，所述決定子在正常情況下于共生或益生菌劑乳酸細(xì)菌中未發(fā)現(xiàn)。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例4.乳酸細(xì)菌在食物中的存在和使用利用直接接種的方法鑒定來自肉和肉產(chǎn)品，奶和奶制品，蔬菜，水果和海產(chǎn)品的產(chǎn)細(xì)菌素的LAB分離株，對來自72份食物樣品(32份奶和奶制品，40份肉)的總共663,533個(gè)菌落檢查了細(xì)菌素生產(chǎn)(Coventry等,1997)。這些食物樣品許多被斷定為已經(jīng)超過了可接受的保存期?？偣?5%的肉和肉產(chǎn)品產(chǎn)生產(chǎn)細(xì)菌素的肉桿菌屬。在被調(diào)査的72份食物樣品中,44%產(chǎn)生產(chǎn)細(xì)菌素的細(xì)菌。從總共663，533個(gè)測試的菌落中，發(fā)現(xiàn)80,992個(gè)菌落(12.2%)為肉桿菌屬，其中0.15%產(chǎn)細(xì)菌素。來自細(xì)菌素生產(chǎn)菌的選定菌株的濾器除菌的培養(yǎng)物上清液流體的抗細(xì)菌活性并不被過氧化氫酶，脂肪酶或溶菌酶所影響，但是卻被至少一種蛋白水解酶所完全或部分滅活，提示抗細(xì)菌活性與蛋白質(zhì)物質(zhì)相關(guān)聯(lián)。此研究還顯示人類一直在接觸肉桿菌屬和其它食物滋生的產(chǎn)生細(xì)菌素的細(xì)菌。Amezquita和Brashears(2002)報(bào)道了從可商購的即食(RTE)肉產(chǎn)品中分離出49種LAB菌株。在瓊脂糖斑點(diǎn)試驗(yàn)中對這些篩選其于5t:抑制單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長的能力。Pe^ococc^a"'&7ac"cz'，丄actokc/〃wscase/禾Q丄.paraca"/被鑒定為三種具有最高抑制活性的種屬。當(dāng)向RTE肉產(chǎn)品添力口戶e(^'ococcw5ac/c/z7ac"cz'，￡acto6<3c/〃wscase/禾口丄.的三種選定菌株時(shí)，在所有被評估的RTE肉產(chǎn)品(五份商購的煮火腿樣品和五份商購的法蘭克福香腸樣品)中都有對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長的顯著抑制(P<0.05)。此研究顯示LAB的選定菌株能夠分離自RTE肉產(chǎn)品并且這些菌株于5t:在28天貯藏過程中有效抑制法蘭克福香腸和煮火腿中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長。在貯藏期間，LAB的數(shù)目僅增長大約1個(gè)對數(shù)周期并且在產(chǎn)品表面上無明顯可見的腐敗跡象(例如，涉及外觀，如顏色變化，令人不快的香味和硬度或質(zhì)地變化的對于一些影響感官的不利影響)。由Sakala等(2002)實(shí)施的研究，調(diào)査了在冰箱貝亡藏的，真空包裝的牛肉上的嗜冷(能夠在冷凍溫度下生長，但在2(TC以上生長最佳的細(xì)菌)腐敗微生物區(qū)系。此研究于7。C的溫育溫度下利用較低選擇性的葡萄糖-血液-肝瓊脂糖和胰胨豆胨瓊脂糖培養(yǎng)基接種方法(允許最廣泛的細(xì)菌生長)。在六周的時(shí)間里鑒定并量化了在冷凍溫度下貯藏的真空包裝牛肉上的各種嗜冷屬，以測定細(xì)菌屬或細(xì)菌數(shù)量的變化。利用五份新鮮牛肉切削樣品(在屠宰后獲得并真空包裝大約48小時(shí))以測定在真空包裝牛肉中發(fā)現(xiàn)的各種細(xì)菌的類型和數(shù)量?？偣?493細(xì)菌菌株被鑒定為熱殺微桿菌(Sroc/zof/zn.xAermosp/z(3"a)(64),Cbn206ac/en'wmma/torom(3cww(27),廣布肉桿菌(79),Z^cto^ci〃wa/g/^s(637)，乳桿菌屬(4),魚乳球菌(丄arfococcws/&"'MW)(270),7令^fe日月串珠菌(Zvewcomwtocge/z.<iww)(375)，不云力桿菌(Jc/打eto6acfer)(3),氣單胞菌(Jewno"as)(l)，芽孢豐干菌(萬"".〃ws)(10)，棒桿菌(Coo^eZacfehww)(3),腸細(xì)菌(Enterobacteriaceae)(1),假單胞菌0P^^omo"M)(13)和嗜冷桿菌(iVc/zTO^cteO(6)。冷生明串珠菌，魚乳球菌和丄.a/g^w在貯藏的最初三周期間從大約5xl03cfti/g增長到大約lxl08cfo/g，并在六周研究的余下時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。C.ma/torow加'cwm被不一致地檢測出來，但是當(dāng)其存在時(shí)，在貯藏的最初三周期間增加到大約5xl07dWg，并在研究的最后三周保持于該水平上。真空或氣調(diào)(C02)包裝(C02-MAP)影響分離自肉的細(xì)菌屬(Labadie,l的9)。在低溫和限量氧氣下，LAB包含大約lxl(fcfo/cn^的C02-MAP包裝肉的優(yōu)勢細(xì)菌種群(Gi11和Newton，1978)。尚沒有研究直接比較在COrMAP條件下新鮮包裝肉上乳桿菌屬、明串珠菌屬(丄e"co"os/oc)禾BCa/7w&ten'ww的不同屬的具體數(shù)量。Nilsson等(1999)分別在購買時(shí)和在溫育32天后從冷熏鮭魚中分離出2xl()4和5xl07cfU/gLAB。實(shí)施例5.Cam^acteW"附附a/to/wnfl"c"附在肉，魚和干酪產(chǎn)品上的天然存在如表4中所總結(jié)的，已經(jīng)從真空包裝的肉，魚和法國軟酪中分離出肉桿菌屬(Ahn和Stiles,1990a;Buchanan和Klawitter，1992b;Stoffels等，1992;Pilet等，1995;Milliere禾口Lefebvre,1994a;Milliere等，1994b)。Lewus等的研究(1991)從來自零售肉產(chǎn)品的不同部分的肉上鑒定了兩種產(chǎn)細(xì)菌素的C.ma/tora/w""cww菌株。其它C.ma/farawadcww菌株分離自魚，肉和干酪(Milliere等，1994b;Nissen等，1994;Pilet等，1995;Schillinger等,1993;Shaw禾口Harding,1984)。Leisner等(1994)發(fā)現(xiàn)最初分離自真空包裝的大比目魚，鮭魚或鯖的80個(gè)細(xì)菌菌株中的18株是乳酸細(xì)菌。其中，28%被鑒定為C.wa/toraw^/c"w。Sakala等(2002)進(jìn)行了一種研究來調(diào)査在冷藏真空包裝牛肉上的嗜冷腐敗微生物區(qū)系，并確定在分離自五份新鮮牛肉切削樣品(每份都來自不同的肉店)的總共1493菌株中，27株被鑒定為C.ma/toroma"cwm。在貯藏的第0，1,3,5禾B6周對于兩份C.w"/to;ww^/cMW陽性樣品檢測所述細(xì)菌，平均數(shù)目分別為2xl03,2xl04,2.5x106，lxl(^和2.5xl07cfU/g，并且在六周貯藏期的最后三周期間維持在大約5xl07cfli/g的水平。C.wa/toraw加'o/w在經(jīng)發(fā)酵的肉中的生長已經(jīng)由Montd(1999)記載過他記載"在發(fā)酵期結(jié)束時(shí)，乳酸細(xì)菌一般是優(yōu)勢細(xì)菌區(qū)系。以下菌屬彎曲乳桿菌C^ctok^7/wcwrwm^)，清酒乳桿菌清酒亞種(Z^afe/)，植物乳桿菌(Z^/awto口m),綠色乳桿菌(Z.wW^feyce"力，廣布乳桿菌，C.脂/toram加'c謂和明串珠菌屬是天然存在的，但片球菌只在作為起始培養(yǎng)物接種時(shí)發(fā)現(xiàn)。它們的計(jì)數(shù)一般超過106cfu/g并且在整個(gè)熟化期間保持在這個(gè)水平上。Car"o6a"en'ww存在于發(fā)酵期間，但是3g后消失。"表4.從食品中分離C".mfl/^roma"cwm.<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*=給定的菌株，如果已知。冷熏鮭魚(css)是極容易腐爛的食品并且特別易受單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的污染。css腐敗主要是由于在冷凍貯藏期間的微生物活性造成的(Duffes，1999a)。對于CSS,據(jù)估計(jì)在包裝后即刻，細(xì)菌計(jì)數(shù)從lx103到lxlO4cfu/g，革蘭氏陰性細(xì)菌占優(yōu)勢(64%),諸如腐敗希瓦氏菌0S72ew3"e〃"/7"&ey^"'era)禾口氣單胞菌屬(Aeromonasspp)。發(fā)現(xiàn)存在LAB(32%),多數(shù)是肉桿菌屬(Donald禾口Gibson,1992;Huss等，1995)。在8°C下，細(xì)菌區(qū)系的水平在三周內(nèi)提高至lxlO7-lxlO8cfo/g,相關(guān)細(xì)菌種群有所變化，從而使得LAB占優(yōu)勢(60%)，主要為肉桿菌屬(47%)和乳桿菌屬(Z^cto6a"7/wwp.)(13%)。Paludan-Muller等(1998)報(bào)道了一系列研究，評估了Cwa/tora柳""cww在貯藏于5。C下真空和氣調(diào)包裝的冷熏鮭魚腐敗中的作用。通常在腐敗CSS上發(fā)現(xiàn)LAB和革蘭氏陰性細(xì)菌的混合物。細(xì)菌的起始數(shù)目低，總的嗜冷菌計(jì)數(shù)小于5xl03cfWg，具體地，LAB計(jì)數(shù)為10-lxl02cfu/g。此外，據(jù)測定(通過感官評估)真空包裝的冷熏鮭魚保存期于5'c下最高達(dá)四周。四周時(shí)的微生物區(qū)系由LAB(lxlO6-lxl07cfb/g)與不同水平的革蘭氏陰性微生物區(qū)系(lxlO5-lxlO"cfti/g)組成。氣調(diào)包裝減少革蘭氏陰性細(xì)菌的生長并特異性選擇LAB，盡管LAB的生長在五周的貯藏期間低于3xl05dWg(Paludan-Muller等，1998)。LAB微生物區(qū)系占優(yōu)勢的是C.ma/toram油'CMm,在鑒定過的255個(gè)LAB分離株中占87%。通過在貯藏于5"C下的CSS中每克接種大約lxl06cfbC.wa/taro附af/cw柳來進(jìn)一步石開究Cwa/toro附a"cww的腐敗、潛為(Paludan-Muller等，1998)。在接種了C.ma/toram加'cww菌株的真空包裝的鮭魚中，僅僅一周的貯藏后LAB計(jì)數(shù)達(dá)到lxl07cfli/g，并且該水平在余下的貯藏期中高于lx108cfu/g。不過，在四周的貯藏后,鮭魚未被感官體驗(yàn)組所排斥，而真空包裝的對照則在四到五周后被排斥。在接種過的氣調(diào)包裝的鮭魚中，兩周后LAB計(jì)數(shù)達(dá)到最終水平lxlO6-lxl07cfu/g，但是直到貯藏四到五周后鮭魚并未被感官排斥。據(jù)推斷即使在高數(shù)目(lx107-lxl()ScfU/g)之下，C.ma/torom如'cww生長幾周也不會(huì)加速包裝的冷熏鮭魚的腐敗進(jìn)程。對于由生牛奶制成的法式表面霉菌熟化的干軟酪的嗜冷和嗜溫微生物區(qū)系的細(xì)菌學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，C.ma/toram加'cwm是五種Brie干酪樣品上熟化結(jié)束時(shí)的優(yōu)勢細(xì)菌(Milliere禾卩Lefebvre,1994a)。C.ma/torama"c"w細(xì)菌還分離自Coulommiers,Camember,Pon-I、Eveue禾卩Munster干酪。在各種干酪樣品中，分離自這些干酪的肉桿菌菌落的數(shù)目范圍為5x105-8x108cfu/g。Milliere等(1994b)繼續(xù)鑒定分離自五種Brie干酪樣品的C.wa/towm加'cwm菌株。干酪的pH值為6.8禾B7.6之間并且沒有記錄到異味(off-odors)或感觀缺陷。肉桿菌屬在所述干酪樣品中占優(yōu)勢，在1x108和1x10VfU/g之間。DNA-DNA雜交的結(jié)果表明36種分離株中的33種是C.ma/toram加'c訓(xùn)菌屬，而余下的三種(都從相同的樣品中挑取)為廣布肉桿菌。總之，肉桿菌屬是在真空包裝的肉，家禽，魚和干酪產(chǎn)品上微生物區(qū)系的常見組分，在一些情況下，它們可以代表產(chǎn)品諸如熏魚、雞肉、牛肉和干酪上的優(yōu)勢組成種群，達(dá)到lxl08cfWg或更高的水平，而不會(huì)引起可檢測到的腐敗。實(shí)施伊j6.CVi,""6ffcfer/"/w附ff/似AV附W/c"附培養(yǎng)物的生產(chǎn)將Cma/toram加'cwm菌株在4。C下以凍干形式維持，或在-8(TC下作為在20%(v/v)甘油中的冷凍培養(yǎng)物維持。進(jìn)行API⑧條帶分析(一種鑒定細(xì)菌至屬水平的試劑盒)以確保存活力并且通過無細(xì)菌學(xué)污染和/或通過隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)和微生物分析來確認(rèn)菌株純度。對于每個(gè)菌株制備七個(gè)凍干的小瓶(主種)。由單瓶主種，在真空下制備15個(gè)凍干瓶，并貯藏于4r(次級(jí)種)。由每瓶次級(jí)種，制備足夠的冷凍小瓶用于一年的生產(chǎn)需要，并貯藏于-8(TC。每10小瓶中取一瓶進(jìn)行微生物測試以確認(rèn)菌株純度并且無細(xì)菌學(xué)污染。種子培養(yǎng)物和菌母培養(yǎng)物通過將一滿環(huán)的冷凍主種或一小瓶凍干的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到10mlAPT(通用Tween)中來制備種子培養(yǎng)物。接著，使種子生長過夜。通過將種子培養(yǎng)物(生長過夜)轉(zhuǎn)移到6LAPT培養(yǎng)基中并再次將其溫育過夜來從種子培養(yǎng)物制備菌母培養(yǎng)物。發(fā)酵和濃縮將菌母培養(yǎng)物在無菌條件下轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)發(fā)酵器中，所述發(fā)酵器包含生長培養(yǎng)基并維持在25°C。通過分光光度計(jì)(650nm)并通過接種到APT瓊脂上直到細(xì)胞密度達(dá)到大約10Vfu來監(jiān)測發(fā)酵。接著收集發(fā)酵的生長培養(yǎng)基(包含C.ma/tora廳"c謂)并將其凍干。凍干將凍干的物質(zhì)從碟中刮取，研磨并粉碎，在冷藏(4-8'C)之前將其置于聚乙烯袋中并裝入雙層袋內(nèi)。實(shí)施例7微生物分析對凍干的物質(zhì)進(jìn)行總?cè)樗峒?xì)菌，非乳酸細(xì)菌，酵母，霉菌，總的大腸菌類，金黃色葡萄球菌OStop/^/ococci^aw訓(xùn)s)，大腸桿菌(Esc/7eWc/2/aco")，和沙門氏菌屬GSa/wo"e〃aspp)的微生物分析(表5)。表5CVw7io6""m'M附附"/tora柳W/cM附凍干的細(xì)菌粉末的描述活性成分賦形劑麥芽糖糊精貯存期限>一年貯存條件室溫(22。C)物理方面說明方法外觀通過視覺觀察APT平板并與標(biāo)準(zhǔn)的平板的照片和描述進(jìn)行比較濃度介于3.2M0Vg禾口A.RH.A./USP3.2*107活細(xì)胞&之間殘余濕氣<5%O'H犯s微生物描述乳酸細(xì)菌介于3.2"0Vg和A,P.H.A./USP3.2*107cfti/g之間或介于1.3*109和1.4M0"cfu/包裝之間非乳酸細(xì)菌<100/gA.RH.A./USP酵母<100/gA.P.H.A./USP毒菌<100/gA.P.H.A./USP厭氧孢子形成細(xì)菌<10/gA.P.H.A./USPClostridium每50g缺乏A.RH.A./USPbotulinum總大腸菌類<10/gA.P.H.A./USP金黃色葡萄球菌<100/gA.P.H.A./USP大腸桿菌每25g缺乏A.P.H.A/USP沙門氏菌屬每g缺乏A.P.H.A/USPA.P.H.A^美國公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)；USP二美國藥典實(shí)施例8起始培養(yǎng)物的重構(gòu)將標(biāo)準(zhǔn)化的活細(xì)胞摻合物包裝到塑料箔薄膜包裝中，用氮?dú)鉀_洗并且按最終產(chǎn)品應(yīng)用的要求規(guī)定包裝重量從而使每克最終產(chǎn)品達(dá)到103和104之間的活C.wfl/toww^/cwm細(xì)胞。接著將所述包裝物貯存在室溫。對包裝的標(biāo)準(zhǔn)化活細(xì)胞摻合物進(jìn)行總?cè)樗峒?xì)菌，非乳酸細(xì)菌，酵母，霉菌，總的大腸菌類，金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，和沙門氏菌屬的微生物分析鑒定(表5)。在成分混合和進(jìn)一步研磨并裝入包裝物之前，還可以將一定劑量的包含菌株CB1,CB2，CB3,LV17,UAL26,ATCC35586或ATCC43225(大約lxl()3到lxl04cfu/g最終產(chǎn)品)中的一種或多種的重構(gòu)C.wa/torawa"cwn直接加入研磨的肉中。接著，將這些香腸在-5(TC快速冷凍直到在中心冷凍。接著，將這些香腸密封包裝在塑料包裹中并保持在冷凍狀態(tài)直到解凍進(jìn)行零售銷售。實(shí)施例9.真空包裝的維也納香腸上的Cfl/7l"flCteWw附附fl/to/WMfl"C"附的生長特性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的研究來在可與商業(yè)生產(chǎn)比較的條件下研究在真空包裝上的C.wa/torama"cMm的生長特性，所述維也納香腸用C.ma/組歸加'c謂接種。此外，研究對感官特性諸如芳香和風(fēng)味模式的影響。該研究的方法和結(jié)果如下選擇C.m^arawa"c調(diào)的兩株菌株進(jìn)行研究LV17(UAL8的同物異名)開始分離自真空包裝的，冷凍的新鮮豬肉并由Shaw和Harding(1984)描述，和菌株UAL26，其分離自真空包裝的牛肉(Stiles和Holzapfel，1997)。通過將洗滌的細(xì)菌細(xì)胞加入滅菌的0.85%的鹽水以提供2.5x106cfu/ml的接種物水平來制備接種物。將單獨(dú)的維也納香腸浸入接種物混懸液中達(dá)一分鐘，脫水干燥并以每袋5個(gè)一組的維也納香腸進(jìn)行真空包裝(高屏障，低02傳遞，VP袋)。作為對照，將維也納香腸在沒有細(xì)菌接種物的情況下，浸入0.85%的滅菌鹽水中。接著，將處理的和對照樣品置于冷藏(4°C)貯藏多達(dá)12周。在0天和在貯藏的2,4,6,7,8,10和12周后對維也納香腸取樣進(jìn)行微生物分析和感官評價(jià)。通過切下1.8cm長的維也納香腸塊(等價(jià)于10cn^的表面積)，將其置于滅菌的組織勻漿袋中并進(jìn)行勻漿來制備樣品進(jìn)行微生物分析。細(xì)菌計(jì)數(shù)通過標(biāo)準(zhǔn)稀釋和接種技術(shù)進(jìn)行并且包括l)在25°C，好氧溫育48小時(shí)的在平板計(jì)數(shù)瓊脂上的總的好氧平板計(jì)數(shù)；2)在25。C，厭氧溫育48小時(shí)的在APT瓊脂上的乳酸細(xì)菌；3)在35。C溫育18小時(shí)的在添加了1%的葡萄糖的VioletRedBileAgar上的腸道細(xì)菌。將細(xì)菌的濃度報(bào)道為每cr^產(chǎn)物的cfu(cfu/cm2)。將要進(jìn)行感官特性評價(jià)的維也納香腸在"剛沸騰"的水中蒸煮，并使其靜止5分鐘(內(nèi)部維也納香腸的溫度大約為83。C)。將維也納香腸切成塊，并置于用編碼的箔覆蓋的容器中，在94。C的烘箱中加熱15分鐘，立即進(jìn)行評估。感官評估由進(jìn)行了三個(gè)月時(shí)期訓(xùn)練的一組9人的專門小組進(jìn)行。使用15cm的非正式的線等級(jí)，對樣品進(jìn)行了總的芳香味強(qiáng)度，肉風(fēng)味強(qiáng)度，調(diào)味(seasoned)風(fēng)味，煙塵強(qiáng)度，酸味/酸度，臭味(off-flavor)和總的可接受度的評估，其中0=非常溫和，15=非常強(qiáng)烈。在樣品之間，舌用脆點(diǎn)心和1:1稀釋的7-Up⑧凈化。該研究報(bào)道了已經(jīng)用C.ma/tomma"cwm菌株LV17或UAL26接種的樣品維也納香腸在經(jīng)過7或8周冷藏后分別達(dá)到2.75xl()S和1.2xl05cfo/cm2的最大厭氧乳酸細(xì)菌(LAB)數(shù)量。在貯藏期間，C.ma/tor麵加'c廳以緩慢的速率在真空包裝的維也納香腸上生長并且生長伴隨著表面pH的相當(dāng)小的減少。LV17從0周的pH6.2變化到第10周的pH6.1，而UAL26在6-8周和12周期間從開始的pH6.2變化到大約5.9。得出結(jié)論為與其它乳酸細(xì)菌諸如冷生明串珠菌比較，當(dāng)接種到冷藏(4°C)，真空包裝的維也納香腸上時(shí)，C.ma/towwa"cwm是緩慢生長的種類。C.wa/toraw如'cww的水平在12周的冷藏后達(dá)到最大5xl0、fWcn^。基于由訓(xùn)練的9個(gè)成員的專門小組在12周的貯藏期間進(jìn)行的感官評估，用C.ma/torama/cMW進(jìn)行的接種并未導(dǎo)致對芳香味，臭味，酸度或總的可接受度的明顯的不利影響。實(shí)施例10.當(dāng)接種到香腸中時(shí)，Ow朋6a"e""mm"/tofwmi"c"附的生長特性在香腸的生產(chǎn)期間，將Cma/taramar!'cwmCB1作為接種物在三次試驗(yàn)中，加入豬肉。以21點(diǎn)線等級(jí)來處理香腸(作為未加工的和蒸煮過的二者進(jìn)行評價(jià))的氣味強(qiáng)度和新鮮度品質(zhì)。接種水平范圍從lx103到lx105cfu/g肉。在第0，5,10,15和20天來進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分析以評估C.wa/torama^cwn的生長和細(xì)菌素的產(chǎn)生。對冷凍的豬肉肩部和豬肉脂肪進(jìn)行稱重，粗研并將其分成4批，將2.76%的水和1.8%的調(diào)料加入其中。用多達(dá)105cfb/g的C.;^/torow加'cwm對測試產(chǎn)品進(jìn)行接種。將研磨的肉和成分進(jìn)行混合，精研并填到膠原蛋白腸衣(casing)(UniPac,Edmonton)中。將填充過的腸衣切成3.5-3.75英寸的環(huán)，以得到約為20.4一g/香腸的香腸。在-5(TC將單獨(dú)的香腸環(huán)快速冷凍大約35分鐘。將冷凍的香腸包裝在Styrofoam碟上(每個(gè)包裝大約10oz)，將其密封包裹并密封在塑料包裝中。在細(xì)菌取樣前，將樣品解凍并貯藏于4。C。肉類的一般加工程序包括"急冷"肉以進(jìn)行運(yùn)輸?shù)某绦?，以及后來為銷售或進(jìn)一步加工進(jìn)行的解凍。在己經(jīng)解凍并貯藏于4。C0，5，10,15和20天的樣品上進(jìn)行細(xì)菌學(xué)取樣。將一式兩份的10g樣品置于滅菌的細(xì)菌分離器袋(VWRInternational)中并與90ml滅菌的0.1%的蛋白胨水混合。將在0.1%蛋白胨水中的適合的系列稀釋度在預(yù)傾注的APT瓊脂和MRS瓊脂平板上劃線并將其在30°C溫育48小時(shí)。在溫育時(shí)期后，記錄每個(gè)樣品的一式兩份計(jì)數(shù)(cfli/g肉)。在20天時(shí)期內(nèi)，在MRS瓊脂上的總的厭氧細(xì)菌計(jì)數(shù)從103-105cfu/g產(chǎn)品，增加到10、fWg產(chǎn)品。在測試產(chǎn)品中的背景微生物區(qū)系的生長并未不同于與未接種的樣品相關(guān)的背景微生物區(qū)系的生長，如通過在APT瓊脂上的生長所顯示的。這說明用C.ma/toram如'c蘭接種香腸肉并未增加香腸中細(xì)菌生長的總的發(fā)生率。微生物測定指出在APT和MRS瓊脂上的細(xì)菌生長的總數(shù)在未接種的對照和測試產(chǎn)品上是相似的。所以，加入的c.ma/torama"cww培養(yǎng)物并未增加在測試產(chǎn)品上發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌的數(shù)量，也沒有使所述肉比對照腐敗得更快。在第0，5,10,15和20天通過直接和間接測定來測試在香腸樣品中的細(xì)菌素產(chǎn)生，并對其進(jìn)行檢測，指示由添加的C.w"/to/ww油'cww進(jìn)行的細(xì)菌素產(chǎn)生。到第io天通過間接測定[香腸的部分被熱處理(殺死生產(chǎn)生物)]和直接包埋在用單核細(xì)胞增生李斯特氏菌CDC7762(血清型4b)]接種的APT瓊脂中來觀察對指示生物單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制，其中這種抑制維持到所述測定的第20天。在用C.ma/tonwa&ww接種的香腸中對細(xì)菌素產(chǎn)生的直接測定(將熱處理的勻漿香腸的上清液直接加入用單核細(xì)胞增生李斯特氏菌指示生物覆蓋的APT瓊脂平板中)指示到香腸在4t:貯藏的第15天發(fā)生細(xì)菌素的產(chǎn)生并持續(xù)到貯藏的第20天。實(shí)施例11.CVw7KM"w/"附wtf/似/wfiflrt'c"附的添加在即食(RTE)和新鮮冷裝的、加工的肉產(chǎn)品中的應(yīng)用RTE肉和新鮮冷裝，加工的肉產(chǎn)品需要抑制可能的病原菌生長的防腐技術(shù)。致命的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌爆發(fā)最近席巻了美國東北部，導(dǎo)致美國食品與藥物管理局和USDA's食品安全監(jiān)察署(FSIS)在2003年9月發(fā)布健康警報(bào)(MorbidityandMortalityweeklyReport,2003)。建議作為減輕由人病原菌諸如單核細(xì)胞增生李斯特氏菌導(dǎo)致的污染的影響的手段，將C.wa/torow加'cwm加入氣調(diào)包裝的即食(RTE)肉產(chǎn)品和新鮮冷凍的，加工的肉產(chǎn)品中。在RTE肉產(chǎn)品諸如維也納香腸的包裝期間，建議每454g(1磅)包裝應(yīng)用一定劑量(大約1.5ml,或5xl06cfti)的重構(gòu)C.在成分混合和進(jìn)一步研磨并填充到腸衣中以前，將重構(gòu)c.附Wtor函a&訓(xùn)的等分部分(遞送約1X1()3至1J1X104cfb/g)加入新鮮冷凍的，加工的肉產(chǎn)品中以產(chǎn)生新鮮冷凍的，加工的肉產(chǎn)品。新鮮冷凍的，加工的肉產(chǎn)品將在-5(TC被快速冷凍直到中心被冷凍，接著在塑料包裝中被密封包裹并冷凍貯藏。對于RTE肉產(chǎn)品和新鮮冷凍，加工的肉產(chǎn)品的接種范圍是大約lx103到lxl()4活的C.wa/toraw加'cwm細(xì)胞(cfti)/g產(chǎn)品。實(shí)施例12由Duffes等(2000)進(jìn)行的對分離自商業(yè)，真空包裝的冷-煙熏的鮭魚(CSS)中的產(chǎn)細(xì)菌素菌株C.ma/toram如'c"m(菌株SF668)抑制在CSS上的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長的潛能的檢查，發(fā)現(xiàn)Cma/toroma"cwwSF668在貯藏在4'C的真空包裝的的冷-煙熏鮭魚上，在21天中能夠從lxl()S增加到3xl07cfu/ml(表8)。與C.共培養(yǎng)的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在4。C三周后從lx103cfti/ml增加到3.5xl03cfu/ml。這種C.ma/toroma"c誰與單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的共培養(yǎng)導(dǎo)致了對在冷-煙熏的鮭魚上的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長的明顯的細(xì)菌抑制效應(yīng)(在缺乏C.ma/toram加z'cwm時(shí)，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長達(dá)到大約5xl04cfu/ml)。當(dāng)針對21株的李斯特氏菌屬進(jìn)行篩選時(shí)，由C.wa/toraw""cLK5形成的獨(dú)特的抑制圈對于17株菌株是明顯的(Buchanan和Klawitter，1992a)。發(fā)現(xiàn)C.wa/toraw加'cwwLK5沒有形成過氧化氫，但是產(chǎn)生細(xì)菌素。C.wa/taromfl//cMmLK5抑制李斯特氏菌屬的能力是溫度-依賴型的(在5°C和19。C測定)，與在19°C比較，在5'C對與C.mfl/toraw油'c"wLK5共培養(yǎng)的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌發(fā)生顯著更大的抑制。C.Wfl/tomma//a^LK5顯示在冷凍溫度上能夠生長得比單核細(xì)胞增生李斯特氏菌明顯更快，而在19。C生長速度大約是相同的。在19°C，對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(接種濃度保持在lxl0^fu/ml不變)的抑制依賴于接種比率，其中僅》l:1的LK5:單核細(xì)胞增生李斯特氏菌比率產(chǎn)生顯著的抑制程度。在5"C，在溫育的早期階段期間，對于更高的接種比率，觀察到增加水平的抗-李斯特氏菌活性，但是到溫育的大約300小時(shí)，LK5接種大小對抑制活性沒有影響；對于范圍從0.01:1到1000:1(分別為10:lxl()3和lxlO6:lxl()3dWml)的比率)，抑制的程度是相同的。在冷凍溫度，肉桿菌分離株非常具有競爭性，說明甚至小量的接種物在冷凍食品中可以用于控制單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。此研究證實(shí)了Schillinger和Holzapfel(1990)的報(bào)道，其報(bào)道了在13株C.wa/toraw加'cww菌株中，有10株顯著抑制單核細(xì)胞增生李斯特氏菌DSM20600的生長，如通過瓊脂斑點(diǎn)測試所確定的。實(shí)施例13.7.2.對CVw"oA""e"w附附"/似rowifl"'cMm的背景暴露研究己經(jīng)顯示在有效期內(nèi)通常在零售食品中發(fā)現(xiàn)乳酸細(xì)菌，具體地C.ma/toram加'cwm(氣調(diào)包裝和冷凍優(yōu)先選擇厭氧肉桿菌屬)(Milliere和Lefebvre,1994a;Kelly等，1996;Schobitz等，1999;Amezquita禾口Brashears,2002;Sakala等，2002)。所以，對于精確評估可以最大程度消耗的C.ma/toroma^wm的數(shù)量，必須考慮可能己經(jīng)存在于目標(biāo)食物上的任何理論量白勺C.ma/^Toma^'CMW。對文獻(xiàn)進(jìn)行了廣泛研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩篇具體分析在商購食物上發(fā)現(xiàn)的C.wa/toraw如'cwm的量的參考文獻(xiàn)。Sakala等(2002)測定了包含C.扁/tora扁&謂的兩個(gè)牛肉樣品。在貯藏(真空包裝的并貯藏于2"C)的第0,1,3,5和6周檢測到的平均數(shù)量分別為2xl03，2xl04，2.5x106,lx107，和2.5xl07cfti/g肉。Montel(2000)發(fā)現(xiàn)在香腸的發(fā)酵時(shí)期的末期，乳酸細(xì)菌通常是主要的微生物區(qū)系，其中C.ma/toram^/cwm在天然狀態(tài)下，在發(fā)酵時(shí)期以大約5xl0VfWg香腸的水平存在，但是隨后消失。在6"C貯藏2-3周后，發(fā)現(xiàn)以104-105cfli/g鮭魚接種的無菌冷熏鮭魚具有范圍介于5x107到109cfti/g的最終計(jì)數(shù)(Stohr等，2001)。Nadon等(2001)顯示在貯藏的最初6周，在真空包裝的或二氧化碳?xì)庹{(diào)(C02-CAP)包裝處理的豬肉中，LAB(其包含肉桿菌)從最初的100cfo/cmn曾加到lx106cfti/cm2的平均水平，并且在13周研究的余下的時(shí)間里維持LAB的水平。在C02-CAP豬肉樣品中，LAB直到貯藏的第11周才有明顯的增加，其中LAB的最大水平在3.2xl05cfWcm2。由Nadon等(2001)進(jìn)行的未公開的工作證實(shí)在缺氧的情況下，在-1.5。C貯藏期間，肉桿菌在LAB微生物區(qū)系中占據(jù)優(yōu)勢地位。實(shí)施例14C.ma/toram加'cww的菌株產(chǎn)生數(shù)種不同的肉桿菌素(Quadri等，1994)，其已經(jīng)被鑒定為耐熱的肽，在寬泛的pH范圍內(nèi)是穩(wěn)定的并且能夠作為殺菌劑起作用(Jack等，1996)。最近在一項(xiàng)研究中對C.ma/toram加'cwmL103的細(xì)菌素進(jìn)行了測試從而測定該細(xì)菌素在真空包裝的肉中控制單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長的能力(Schobitz等，1999)。將部分純化的細(xì)菌素以100AU/ml(AU/ml=活性的任意單位)的濃度來接種牛半腱肌肌肉條。將單核細(xì)胞增生李斯特氏菌加入肉中作為指示菌株，最終濃度為lx103dWcnA在確保與肉較好接觸后，將所述肉條進(jìn)行真空包裝并貯藏于《C21天。每個(gè)取樣日，都包含未接種的對照和僅包含指示菌株的肉。在第0天和每7天對一式兩份的肉條進(jìn)行取樣來觀察單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長和LAB生長。在4'C貯藏7天后，觀察到單核細(xì)胞增生李斯特氏菌計(jì)數(shù)的明顯減少，計(jì)數(shù)從開始的2xl03cfo/cm2到4cfu/cm在貯藏的第14天完全抑制病原體(<1cfWcm2)。LAB在真空包裝的肉類上成倍增加，在14天后，達(dá)到lx107cfu/cmH十?dāng)?shù)，其中起始水平為1.6xl02cfli/cm2。肉的顏色和氣味在14天的貯藏期間仍舊是可接受的。此研究的結(jié)果說明來自C."w/tora/77^/cww的細(xì)菌素能夠在多達(dá)14天的時(shí)間里抑制在真空包裝的肉上的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，而仍舊保持肉的食用特性(Schobitz等,1999)。C.ma/torama"cwwLV61產(chǎn)生這樣的細(xì)菌素，其X寸C.ma/tarama"cwm2762和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(菌株R2,Lud1033，Brl246,Lud905和T)具有活性，但是被鏈霉蛋白酶E，蛋白酶K和胰蛋白酶所滅活(Pilet等,1995)。其它研究已經(jīng)說明來自C.ma/taram加'c畫LV61的純化的細(xì)菌素抑制肉桿菌和腸球菌的數(shù)個(gè)菌株，但是不抑制李斯特氏菌的數(shù)個(gè)菌株(Holck等，1994)。所以推論，C.ma/toram^/cwmLV61除了產(chǎn)生piscicolin61之夕卜，產(chǎn)生涉及抗李斯特氏菌活性的另一種因素。實(shí)施例15肉桿菌屬是嗜冷的，在8-9的高pH值上生長并且發(fā)酵菊粉。在存在菊粉的培養(yǎng)條件下，C.wa/tomm加'c謂形成具有金屬銅光澤的黃色到粉紅色的菌落，培養(yǎng)基的黃色改變和沉淀物的消失。各種C.ma/torama"cwm菌株已經(jīng)顯示產(chǎn)生細(xì)菌素，具有抑制其它肉桿菌，乳桿菌和李斯特氏菌屬生長的能力的蛋白質(zhì)化合物。推薦將C./^/toraw加'cwm以lx103至Ulx104cfU/g的范圍接種到各種即食和新鮮冷凍，加工的肉產(chǎn)品中從而提高防腐并減少病原菌生長?；谶@些接種范圍，以及細(xì)菌將在貯藏的延長時(shí)期生長的理論設(shè)想，添加到選定的RTE食品中的C.ma/toraw加'cwm平均每人消耗估計(jì)為對于60kg人的4.3x1()9cfU/天或7.2x107cfb/kg/天。當(dāng)在鮭魚，雞肉，豬肉，牛肉和其它商購的肉產(chǎn)品中評估時(shí)，C.ma/toram加'c蘭對病原體，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制發(fā)生。C.ma/toram^/cMW與單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的共培養(yǎng)導(dǎo)致單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長的對數(shù)減少。在低溫，與單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長比較時(shí)，C.ma/torama&"w對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長的抑制作用在低溫得到提高。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌抑制可以通過乳酸的產(chǎn)生，營養(yǎng)物的競爭以及細(xì)菌素的產(chǎn)生進(jìn)行調(diào)節(jié)。細(xì)菌素的產(chǎn)生與單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生長的增加的抑制相關(guān)。當(dāng)受到模擬胃酸或蛋白水解酶作用時(shí)，由C.顧/toram加'c騰產(chǎn)生的細(xì)菌素的活性快速減少，指示為非毒性和非變應(yīng)性蛋白質(zhì)。C.ma/toram加'c"m增加RTE和真空-包裝的肉產(chǎn)品的貯藏時(shí)間，同時(shí)減少病原菌的生長。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)C.腦/toram加'c謂的生長是自限的，其中在RTE肉產(chǎn)品和真空包裝的，冷熏的鮭魚上的C.ma/toram加'cww的水平穩(wěn)定在約lxl09cfti/g。將C.wa/torawa"c"w以介于1乂103和lxl()4cfli/g之間的水平添加到目標(biāo)RTE和新鮮冷凍，加工的肉產(chǎn)品中將不會(huì)明顯增加來自這些食品的LAB的總的人類消耗(確定理論上的自然消耗為4.3X109dW天)。已纟圣顯示C.ma/toraw(3"cwm本身的生長是自限；C.ma/torama〃cww生長將在大約lxl()S和lxl09cfo/g肉之間停止。推測這是由于限制更高細(xì)菌密度的特異性細(xì)菌素的釋放導(dǎo)致的。實(shí)施例16來自肉產(chǎn)品的乳酸細(xì)菌(LAB)的分離和篩選冷藏的或冷凍的，生的和即食加工的肉類的樣品是A)購買自零售市場的樣品；帶到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物分析B)來自生豬肉香腸的中試車間生產(chǎn)的冷凍樣品，解凍并進(jìn)行微生物分析C)購買自零售市場的即食加工的肉類的樣品，其在實(shí)驗(yàn)室中貯存于4。C直到它們的"最佳日期結(jié)束"，進(jìn)行微生物分析。將一式三份的10g樣品在無菌條件下從每個(gè)包裝中切下，稀釋在90ml的滅菌的0.1。/。胨水中并在細(xì)菌分離器Lab-Blender400(Seward,England)中勻漿2分鐘。將勻漿物的系列稀釋物在0.1%的胨水中進(jìn)行制備并鋪在預(yù)灌注的APT(通用吐溫；Difco)瓊脂(1.5。/。)平板上。將平板在25°C(A,B)或15°C(C)厭氧(A,B)和好氧(C)溫育48小時(shí)。從APT平板用滅菌的牙簽挑取隨機(jī)選擇的單菌落，并將其劃線到需要量的預(yù)灌注的APT平板組上(對于用于篩選的每種指示菌株一組)。將平板在25"C厭氧(A)和好氧(B，C)溫育24小時(shí)。用以1%接種在軟APT瓊脂(0.75%)上的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌指示菌株或通用的指示菌株廣布肉桿菌LV13的菌苔涂在每組平板上。將涂布過的平板在37t:溫育24小時(shí)。將在涂布層中觀察為透明圈的抑制區(qū)域記錄為產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的生物。針對鏈霉蛋白酶E(Sigma)的敏感性和對于熱的敏感性來篩選顯示此活性的生物。選擇對于鏈霉蛋白酶敏感的并且在6(TC穩(wěn)定30分鐘的那些來進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。實(shí)施例17.許多細(xì)菌產(chǎn)生抗細(xì)菌肽或蛋白質(zhì)(例如，細(xì)菌素)，其通常針對其它細(xì)菌、典型地緊密相關(guān)的細(xì)菌具有活性。細(xì)菌和它們的細(xì)菌素的示范性列表顯示在表6中。表6菌株我們實(shí)驗(yàn)室收集的LAB1.CaA77o6ac/eWww觸tow應(yīng)dcCB1未知的2.C.畫/rara應(yīng)"'c薩CB2+未知的3.C.ma/^3romaZ/cwwCB34.C.應(yīng)toram加'cUAL265.C.ma/(aromaf/cMmLV176.C.Twa/farowaricMWUAL26/8A7.廣布肉桿菌LV138.冷生明串珠菌UAL1879.清酒乳桿菌清酒亞種UAL18510.明串珠菌屬UAL280細(xì)菌素肉桿菌素BMl，piscicolin126+肉桿菌素BMl,piscicolin126肉桿菌素BMl,piscicolin126piscicolin126肉桿菌素A，BM1和B2piscicolin126,肉桿菌素AdivergicinAleucocinA未知的未知的抑制李斯特氏菌屬的非LAB11.野油菜索絲菌(5rac^oA/7'xc纖pe欲/s)brochocinCATCC4375412.金黃色葡萄球菌A5313.*廣展矢豆豐干菌(Brevibacteriumlinens)ATCC917514.擴(kuò)展短桿菌0C215.雙歧雙歧桿菌NCFB1454金霉素(aureocin)A53未知的linenscinOC2bifidocinB肉來源的抑制李斯特氏菌的LAB16.C.畫/tora麵"'c調(diào)LV61肉桿菌素A17.Cma/torow""cwwVI肉桿菌素BMl，piscicolin12618.C.wtftorowWc,CP5肉桿菌素BM1和B219.C.顧/Zaraw油'c畫JG126piscicolin12620.肉桿菌屬377camocinH21.C.ma/tora聽Z/cU149carnocinU14922.廣布肉桿菌750divergicin75023.乳酸片球菌(尸.a"'A7ac""')PACl.O片球菌素PA-124.乳酸片球菌E片球菌素PA-125.乳酸片球菌F片球菌素PA-126.乳酸片球菌H片球菌素PA-127.乳酸片球菌JDl-23片球菌素PA-128.乳酸片球菌M片球菌素PA-129.戊糖片球菌(尸.peWc^aceM)Z102片球菌素PA-130.植物乳桿菌WHE92片球菌素PA-131.植物乳桿菌ALC01片球菌素PA-132.清酒乳桿菌清酒亞種Lb706sakacinAB.清酒乳桿菌清酒亞種CTC494sakacinA34.彎曲乳桿菌(Z.cwrv"/wj)LTH1174sakacinA35.清酒乳桿菌清酒亞種LTH673sakacinP36.清酒乳桿菌清酒亞種674sakacinP37.巴伐利亞乳桿菌CZ^"o6ac///^sakacinP&ava"'cws)Ml40138.清酒乳桿菌清酒亞種MNbavaricinMN39.屎腸球菌CTC492腸道菌素A和B40.屎腸球菌T136腸道菌素A和B41.屎腸球菌WHE81腸道菌素A和B42.屎腸球菌BFE900腸道菌素A和B43.屎腸球菌L50腸道菌素L50A和L50B,P,Q44.屎腸球菌DPC114645.屎腸球菌EK1346.屎腸球菌P1347.屎腸球菌AA1348.屎腸球菌G1649.屎腸球菌JCM5804T50.鉛黃腸球c磁e/y/a窗)IM416K151.肉色明c"r"ay膽)401052.植物乳桿菌UG153.屎腸球菌CRL3554.干酪乳桿菌(Za"o6ac///^c^we/)CRL70555.清酒乳桿菌清酒亞種CTC49456.肉色明串珠菌57.肉色明串珠菌58.短乳桿菌(丄a"o6ac/〃M6rcWOVB28659.植物乳桿菌CTC30560.植物乳桿菌CTC30661.清酒乳桿菌清酒亞種CTC372腸道菌素A腸道菌素A和P腸道菌素P腸道菌素P腸道菌素P腸道菌素A,B,P腸道菌素416K1串珠菌(丄ewconoWocleucocin禾卩ACplantaricinUG1腸道菌素CRL35lactocinCRL705sakacinKleucocinF10leucocinB-Tallabrevicin286未知的未知的未知的抑制李斯特氏菌的LAB62.C.腿/tor麵""'c畫CS52663.唾液鏈球菌嗜熱亞種(5V，Zococctw//jevnopW/w力Sfil364.糞腸球菌(E/aecato)EJ9765.糞腸球菌BFE107166.糞腸球菌FAIR-E30967.糞腸球菌Y171768.糞腸球菌LMG233369.糞腸球菌DPC528070.糞腸球菌S-4871.糞腸球菌INIA472.植物乳桿菌ALC0173.Lb.Sake251274.植物乳桿菌423未知的耐熱革裥菌素13腸道菌素EJ97腸道菌素1071腸道菌素1071細(xì)菌素31enterolysinAenterolysinA腸道菌素AS-48腸道菌素AS-48片球菌素PA-1sakacinGplantaricin42375.蒙氏腸球菌CE她racocc"5腿"必')AT06mundticin76.蒙氏腸球菌NFR17393mundticinKS77.布氏孚L桿菌(丄a"o6a"7/zw16wc/we")buchnericin-LB78.德氏乳桿菌乳亞種(丄./acto)MMFII乳球菌素MMFII79.德氏乳桿菌乳亞種UL720diacetinB80.雞乳桿-菌Cfiy^racoccwi"g"〃/"arww)012腸道菌素01281.植物乳桿菌plantaricinNA82.腸膜明串珠菌(￡ewco"oWocmsscnterocin52A應(yīng)s加era/(ie力FR5283.腸膜明串珠菌Y105mesentericinY105抑制李斯特氏菌的羊毛硫抗生素84.德氏乳桿菌乳亞種乳鏈菌肽85.德氏乳桿菌乳亞種乳鏈菌肽z86.德氏乳桿菌乳亞種61-14乳鏈菌肽Q87.德氏乳桿菌乳亞種DPC3147乳鏈球菌素3147其它產(chǎn)生細(xì)菌素的細(xì)菌88.德氏乳桿菌乳亞種乳球菌素A,B，M89.德氏乳桿菌乳亞種LMG280乳球菌素G90.德氏乳桿菌乳亞種IPLA972乳球菌素97291.德氏乳桿菌乳亞種DPC5552乳鏈球菌素48192.德氏乳桿菌乳亞種BGMN1-5LsbA,LsbB93.約氏乳桿菌(丄a"o6ac/〃ws乂o/m犯m7)VPI萵苣苦素(lactacin)F謹(jǐn)894.嗜酸孚L桿菌(丄a"o6ac/〃wsac/t/op/W"i1)acidocinBM4695.嗜酸乳桿菌N2萵苣苦素B96.加氏乳桿菌LA39gassericinA97.唾液乳桿菌UCC118ABP-11898.植物乳桿菌CllplantaricnE/F,J/K99.植物乳桿菌NC8plantaricinNC8100.詹氏丙酸豐干菌CPrap/o"/6acfehww丙酸菌素SM1ye"sem'〖)DF1101.大腸桿菌(五ir/2e"'c/zz'aco//)大腸菌素v102大腸桿菌大腸菌素Y101103.大腸桿菌104.表皮葡萄球菌(51fa;/iy/oco"wj，V;fe,加X)105.枯草芽孢桿菌CSac!7/w^wWfc)168106.加氏乳桿菌107.肺炎克雷伯氏菌(K/e6w'e&108.酪丁酸梭菌(C7oWavW/ww0^。6"0^'cz/附)ADRIAT932109.手早氏梭菌(C/ay/r/(i'ww6e々'en'"cfe7)ATCC25752110.食淀粉乳桿菌(Z^cto6ac///ja，/ovori")DCE471111.植物乳干菌SA6112.清酒乳桿菌清酒亞種L45微生物素H47subtilosinAgassericinK7B微生物素E492Closticin574circularinA胞外多糖L471plantaricinSA6lactocinS將下面的生物素稱為由革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生的微生物素-1.肺炎克雷伯氏菌RYC492微生物素E492(與107相同)2.大腸桿菌微生物素V(與101相同，舊稱大腸菌3.大腸桿菌4.大腸桿菌5.大腸桿菌6.大腸桿菌微生物素Y101(與102相同)微生物素H47微生物素L微生物素2411.參考文獻(xiàn)Aguirre,M.andCollins,M.D.(1993)Lacticacidbacteriaandhumanclinicalinfection.Jot/ma/oMpp//'eafSacfen'ofogy75:95-107.Ahn，C.a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