專(zhuān)利名稱(chēng)：由來(lái)自植物的原料生產(chǎn)乳酸的方法及生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由來(lái)自植物的原料生產(chǎn)乳酸的方法及生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌。
背景技術(shù)：
乳酸是作為聚合物原料或農(nóng)藥、藥物的中間體近年來(lái)備受關(guān)注的有用物質(zhì)。乳酸有L-乳酸和D-乳酸，目前工業(yè)生產(chǎn)的聚乳酸是L-乳酸聚合物，但D-乳酸作為聚合物原料或農(nóng)藥、藥物的中間體近年來(lái)也備受關(guān)注。自然界中存在乳酸菌或絲狀菌等有效生產(chǎn)乳酸的微生物，在使用上述菌的乳酸制造方法中，已知有使用Lactbacillus delbrueckii等作為能有效生產(chǎn)L-乳酸的微生物的方法，另外已知有使用SporolactcAacillus屬的微生物等作為能有效生產(chǎn)D-乳酸的微生物的方法。但是事實(shí)上在任一用途中，都要求作為原料的乳酸具有高光學(xué)純度。隨著近年來(lái)研究的進(jìn)展，已經(jīng)發(fā)明了高選擇性高生產(chǎn)率地生產(chǎn)D-乳酸的微生物 (參見(jiàn)國(guó)際公開(kāi)2005/0333M號(hào)說(shuō)明書(shū))。另外，還已知由作為廉價(jià)的糖原料的蔗糖高選擇性地生產(chǎn)D-乳酸的大腸桿菌(參見(jiàn) Biotechnolohy Letters, Vol. 27，pp. 1891-1896 (2005)) 但是，由蔗糖生產(chǎn) D-乳酸的大腸桿菌生產(chǎn)率低，并且在蔗糖的同化上非?；ㄙM(fèi)時(shí)間，這在工業(yè)化上已成為課題。關(guān)于L-乳酸，雖然已知以葡萄糖為原料高選擇性高生產(chǎn)率地生產(chǎn)L-乳酸的大腸桿菌(日本特開(kāi)2007-49993號(hào)公報(bào))，但還沒(méi)有由蔗糖生產(chǎn)L-乳酸的大腸桿菌。根據(jù)現(xiàn)有的知識(shí)，微生物同化蔗糖的機(jī)制大致分為蔗糖 PTS (PhosPhoenolPyruvate :Carbohydrate Phosphotransferase System)禾口PTS 2 種(例如日本特開(kāi)2001-346578號(hào)公報(bào))。經(jīng)過(guò)蔗糖非PTS時(shí)，微生物以蔗糖的形式吸收蔗糖，之后分解為葡萄糖和果糖。另一方面，經(jīng)過(guò)蔗糖PTS時(shí)，微生物在吸收蔗糖時(shí)將蔗糖磷酸化，轉(zhuǎn)化為蔗糖-6-磷酸。并且在微生物內(nèi)部分解為葡萄糖-6-磷酸和果糖。S卩，即使經(jīng)過(guò)任一機(jī)制，來(lái)自蔗糖的果糖均首先以未被磷酸化的形式出現(xiàn)在微生物內(nèi)部。并且為了將上述未被磷酸化的果糖(以下稱(chēng)作非磷酸化果糖)吸收入糖酵解系統(tǒng)，果糖需要被異構(gòu)化為葡萄糖或被磷酸化。但是由于文獻(xiàn)(參見(jiàn)FEMS Yeast Res, Vol. 5, pp. 1055-1062(2005) ；PNAS, Vol.98 (26)，pp. 15257-15259 (2001) ； J.Bacteriology, Vol. 184 (19), pp. 5307-5316(2002))中暗示了該微生物為大腸桿菌(不包括能同化一部分蔗糖的大腸桿菌)時(shí)將非磷酸化果糖異構(gòu)化為葡萄糖的活性、將果糖磷酸化的活性均非常低，所以即使成功地使非磷酸化果糖出現(xiàn)在大腸桿菌內(nèi)部，但只要不采用特殊的手段，則不能期待該大腸桿菌同化非磷酸化果糖。已知蔗糖非PTS由CscB(進(jìn)行蔗糖的吸收)、CscA(在微生物內(nèi)部進(jìn)行蔗糖的分解)、CscK(進(jìn)行果糖的磷酸化)，CscR(控制CscB、A、K的表達(dá))4種因子構(gòu)成。上述 Biotechnolohy Letters, Vol. 27,pp. 1891-1896(2005)中記載了將上述 4 種因子導(dǎo)入到生產(chǎn)D-乳酸的大腸桿菌中，實(shí)現(xiàn)了由蔗糖以相對(duì)于糖為93%的收率、96. 5g/L/120小時(shí)的生產(chǎn)率的生產(chǎn)。但是從工業(yè)化的觀點(diǎn)考慮，該生產(chǎn)率為不充分的水平，期待生產(chǎn)率的進(jìn)一步提尚。另外，Can.J.Microbiol.，Vol. 45，pp. 418-422 (1999)公開(kāi)了通過(guò)在大腸桿菌中只導(dǎo)入cscA，大腸桿菌能夠以蔗糖為原料進(jìn)行繁殖。但是，該文獻(xiàn)中沒(méi)有涉及重要的來(lái)自蔗糖的果糖的同化。以蔗糖為原料的大腸桿菌在物質(zhì)生產(chǎn)中的重要的一點(diǎn)是由蔗糖原料實(shí)現(xiàn)高收率。因此來(lái)自蔗糖的葡萄糖和來(lái)自蔗糖的果糖被有效地同化是必要條件。然而在該文獻(xiàn)中雖然公開(kāi)了在大腸桿菌中只導(dǎo)入CscA、蔗糖被同化，但沒(méi)有公開(kāi)來(lái)自蔗糖的果糖被同化程度的任何數(shù)據(jù)。關(guān)于cscA，已知通過(guò)導(dǎo)入cscA、cscB、cscK和cscR基因組使來(lái)自磷酸烯醇丙酮酸 (PEP)的氨基酸例如色氨酸的產(chǎn)生進(jìn)一步提高(例如日本特開(kāi)2007-49993號(hào)公報(bào))。如上所述，由于由蔗糖生產(chǎn)乳酸的現(xiàn)有方法的生產(chǎn)率仍然較低，并且蔗糖的同化仍然非?；ㄙM(fèi)時(shí)間，所以仍然需要提高充分利用廉價(jià)且工業(yè)上利用價(jià)值高的蔗糖的工業(yè)上生產(chǎn)乳酸的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌及生產(chǎn)乳酸的方法，所述生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌能夠在更短的時(shí)間內(nèi)同化蔗糖，并且在由蔗糖更有效地生產(chǎn)乳酸方面是有用的。本發(fā)明提供生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌及生產(chǎn)乳酸的方法。即，本發(fā)明如下所述。[1] 一種生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，具有蔗糖非PTS基因組中至少包括蔗糖水解酶基因的1種以上的基因，但是不包括阻抑蛋白(CSCR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(CSCK) 及蔗糖透過(guò)酶(cscB)的組合和蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透過(guò)酶(cscB) 的組合，并且具有利用基因重組的乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)。[2]如[1]所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中上述蔗糖非PTS基因組中只具有蔗糖水解酶基因，并且具有利用基因重組的乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)。[3]如[1]或[2]所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌進(jìn)一步具有提高果糖代謝能力的系統(tǒng)。[4]如[1] [3]中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)包括丙酮酸甲酸裂解酶活性的失活或降低。[5]如[1] W]中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)包括用于生成D-乳酸或L-乳酸的NADH依賴(lài)性乳酸脫氫酶活性的增強(qiáng)。[6]如[1] W]中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)包括D-乳酸脫氫酶活性的增強(qiáng)、和該大腸桿菌本身具有的FAD依賴(lài)性D-乳酸脫氫酶活性的失活或降低。[7]如[1] W]中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)包括L-乳酸脫氫酶活性的增強(qiáng)、和該大腸桿菌本身具有的D-乳酸脫氫酶活性及FMN 依賴(lài)性L-乳酸脫氫酶活性的至少任一方的失活或降低。[8]如[3] [7]中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述提高果糖代謝能力的系統(tǒng)是在果糖代謝途徑中磷酸化能力的增強(qiáng)或果糖吸收能力的增強(qiáng)。[9]如[8]所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述果糖代謝途徑中磷酸化能力的增強(qiáng)來(lái)自果糖-ι-磷酸激酶活性。
[10]如[8]所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述果糖代謝途徑中果糖吸收能力的增強(qiáng)來(lái)自該大腸桿菌本身具有的FruR活性的失活或降低。[11]如[1] [10]中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述蔗糖水解酶基因來(lái)自埃希氏菌屬細(xì)菌。[12]如[1] [10]中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述蔗糖水解酶基因來(lái)自大腸桿菌0 157細(xì)菌。[13]如[9] [12]中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述果糖磷酸激酶來(lái)自埃希氏菌屬細(xì)菌。[14]如[9] [12]中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，上述果糖磷酸激酶是來(lái)自大腸桿菌MG1655的蛋白質(zhì)。[15]如[1] [14]中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌是大腸桿菌K12衍生株。[16] 一種生產(chǎn)乳酸的方法，包括使用[1] [15]中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌、由來(lái)自植物的含有蔗糖的原料生產(chǎn)乳酸。根據(jù)本發(fā)明，可以提供生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌及生產(chǎn)乳酸的方法，所述生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌能夠在更短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行蔗糖的同化，并且在更有效地生產(chǎn)乳酸方面是有用的。


[圖1]為表示使用本發(fā)明的實(shí)施例10中的各種生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌培養(yǎng)48小時(shí)后生成的乳酸的蓄積量的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的乳酸生產(chǎn)菌是具有蔗糖非PTS基因組中至少包括蔗糖水解酶基因的1種以上的基因(但是不包括阻抑蛋白(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(CSCK)及蔗糖透過(guò)酶(cscB)的組合、和蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透過(guò)酶(cscB)的組合)、并且具有利用基因重組的乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌。本發(fā)明的生產(chǎn)乳酸的方法是包括使用上述生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌、由來(lái)自植物的含有蔗糖的原料生產(chǎn)乳酸的乳酸生產(chǎn)方法。本發(fā)明的乳酸生產(chǎn)菌由于具有蔗糖非PTS基因組中至少包括蔗糖水解酶基因的1 種以上的基因(但是不包括阻抑蛋白(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透過(guò)酶(cscB)的組合、和蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透過(guò)酶(cscB)的組合)、并且具有乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)，所以能夠?qū)?lái)自蔗糖的果糖磷酸化并吸收入菌體內(nèi)，同時(shí)能使用乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)將該果糖轉(zhuǎn)化為乳酸。在不具有蔗糖同化能力的菌中賦予蔗糖非PTS基因組中至少包括蔗糖水解酶的1種以上的基因，從而以蔗糖為碳源生成產(chǎn)物的事例到目前為止還完全沒(méi)有報(bào)道。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)通過(guò)將蔗糖非PTS基因組中的部分但并非全部基因、即至少包括蔗糖水解酶基因的1種以上的基因?qū)氲缴a(chǎn)乳酸的大腸桿菌中，可以高效地同化來(lái)自蔗糖的果糖、并且比現(xiàn)有技術(shù)更顯著地提高生產(chǎn)率。結(jié)果能由來(lái)自植物的、廉價(jià)且在工業(yè)上價(jià)值高的蔗糖在短時(shí)間內(nèi)有效地得到乳酸。
特別是由于本發(fā)明的生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌不論作為其他糖資源的葡萄糖的是否存在， 均能同化蔗糖或作為其分解產(chǎn)物的果糖來(lái)生產(chǎn)乳酸，所以可以在葡萄糖等其他的糖基質(zhì)較少或枯竭前生產(chǎn)乳酸，因此是更有效的。通常已知大腸桿菌中葡萄糖的吸收通常優(yōu)先于果糖，在葡萄糖的存在下果糖未被充分代謝。另外，糖代謝對(duì)生物而言是基本的功能。因此，令人吃驚的是果糖代謝途徑的磷酸化活性或果糖吸收能力的增強(qiáng)并未阻礙細(xì)菌的繁殖、并且并未受葡萄糖引起的代謝抑制 (分解代謝物阻抑)的影響、而可以有效地進(jìn)行乳酸的生產(chǎn)。本發(fā)明中所謂的蔗糖非PTS基因組，是指微生物的蔗糖同化途徑中與非PTS系統(tǒng)有關(guān)的基因組。詳細(xì)而言，是由阻抑蛋白(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)、蔗糖透過(guò)酶(cscB)構(gòu)成的基因組。本發(fā)明中，只要為上述基因組中的至少包括cscA的1種以上的基因即可，例如可以舉出僅有cscA ；cscA及cscK的組合；cscA及cscB的組合；cscA及 cscR的組合；cscA、cscB和cscR的組合；cscA、cscK和cscR的組合。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中，從導(dǎo)入的蔗糖非PTS基因組的基因的組合中排除阻抑蛋白(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、 果糖激酶(cscK)及蔗糖透過(guò)酶(cscB)的組合、和蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透過(guò)酶(cscB)的組合。其中，從更有效地生產(chǎn)乳酸的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選只具有編碼cscA的基因，不包括其他基因。本發(fā)明中所謂的蔗糖水解酶(轉(zhuǎn)化酶、CscA)，是指基于國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合 (I. U. B.)酶委員會(huì)報(bào)告被歸屬于酶編號(hào)3. 2. 1.沈、催化由蔗糖生成D-葡萄糖和D-果糖的反應(yīng)的酶的總稱(chēng)。該酶是K12株等大腸桿菌中本身不具有的酶，是包括質(zhì)子共轉(zhuǎn)運(yùn)體、轉(zhuǎn)化酶、果糖激酶及蔗糖特異性阻抑蛋白的非PTS代謝途徑的酶的1種(參見(jiàn)Canadian Journal of Microbiology, (1991) vol. 45，pp418_422)。本發(fā)明中通過(guò)賦予上述CscA、特別是只賦予 cscA，菌體外的蔗糖可以在細(xì)胞膜上被分解為葡萄糖及果糖并被釋放到細(xì)胞外，通過(guò)葡萄糖PTS及果糖PTS被磷酸化并被引入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。結(jié)果果糖能被供給至細(xì)菌中的果糖代謝系統(tǒng)，并可利用糖酵解系統(tǒng)被同化。作為本發(fā)明的被導(dǎo)入宿主細(xì)菌的蔗糖水解酶(轉(zhuǎn)化酶、CscA)的基因，可以利用由具有該酶的生物得到的具有編碼蔗糖水解酶(轉(zhuǎn)化酶、CscA)的基因的堿基序列的DNA、或基于該基因的公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例，可以舉出來(lái)自歐文菌屬菌(Erwinia)、變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農(nóng)桿菌屬菌 (Agrobacterium)、根瘤菌屬菌(Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)，雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌Escherichia)基因，例如可以舉出具有來(lái)自大腸桿菌0 157株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選具有來(lái)自大腸桿菌0 157株的基因的堿基序列的DNA。另外優(yōu)選在cscA中添加用于使cscA移到菌體的外周胞質(zhì)的信號(hào)序列。作為本發(fā)明的被導(dǎo)入宿主細(xì)菌的阻抑蛋白(CscR)的基因，可以利用由具有該酶的生物得到的具有編碼阻抑蛋白(CscR)的基因的堿基序列的DNA、或基于該基因的公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例，可以舉出來(lái)自歐文菌屬菌(Erwinia)、變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農(nóng)桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌 (Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus),雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來(lái)自大腸桿菌0 157株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選為具有來(lái)自大腸桿菌0 157株的基因的堿基序列的DNA。作為本發(fā)明的被導(dǎo)入宿主細(xì)菌的果糖激酶(CscK)的基因，可以利用由具有該酶的生物得到的具有編碼果糖激酶(CscK)的基因的堿基序列的DNA、或基于該基因的公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例，可以舉出來(lái)自歐文菌屬菌(Erwinia)、變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農(nóng)桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌 (Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus),雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來(lái)自大腸桿菌O 157株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選為具有來(lái)自大腸桿菌O 157株的基因的堿基序列的DNA。作為本發(fā)明的被導(dǎo)入宿主細(xì)菌的蔗糖透過(guò)酶(CscB)的基因，可以利用由具有該酶的生物得到的具有編碼蔗糖透過(guò)酶(CscB)的基因的堿基序列的DNA、或基于該基因的公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例，可以舉出來(lái)自歐文菌屬菌(Erwinia)、 變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農(nóng)桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌 (Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus),雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來(lái)自大腸桿菌O 157株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選為具有來(lái)自大腸桿菌O 157株的基因的堿基序列的DNA。本發(fā)明中所謂的蔗糖同化，是指將蔗糖直接、或低分子化或高分子化后、優(yōu)選低分子化后引入生物體內(nèi)的能力，或者代謝性地將蔗糖轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)的能力。另外，本發(fā)明中，所謂同化包括將蔗糖進(jìn)一步低分子化的分解。詳細(xì)而言，包括將蔗糖分解為D-葡萄糖和D-果糖。本發(fā)明中所謂的果糖代謝能力的提高是指引入菌體內(nèi)的果糖增加的狀態(tài)。所謂的果糖代謝能力提高系統(tǒng)是指使果糖的代謝能力提高的結(jié)構(gòu)。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中所謂的“宿主”，是指接收一個(gè)以上的基因從菌體外的導(dǎo)入、結(jié)果變?yōu)楸景l(fā)明的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌的該大腸桿菌。本說(shuō)明書(shū)中所述的數(shù)值范圍表示包括分別以所記載的數(shù)值為最小值及最大值的范圍。本發(fā)明中所謂的乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)，是指用于提高乳酸生產(chǎn)能力的結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)是通過(guò)基因重組被導(dǎo)入或改變的。上述的乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)可以為使作為對(duì)象的大腸桿菌中原有的乳酸生產(chǎn)量增加的系統(tǒng)中的任意系統(tǒng)?？梢?xún)?yōu)選舉出與乳酸生產(chǎn)活性有關(guān)的酶活性的失活、降低或增強(qiáng)或它們的組合。如上所述，與上述CscA活性組合時(shí)，即使為本身不具有蔗糖同化能力的大腸桿菌，也可以有效地由蔗糖生產(chǎn)乳酸。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中“利用基因重組”的用語(yǔ)，包括全部通過(guò)在原有基因的堿基序列中插入其他DNA、或基因的某部分的取代、缺失或它們的組合而產(chǎn)生的堿基序列上的改變，例如該改變可以是突變產(chǎn)生的。本發(fā)明中所謂的“失活”，是指無(wú)論利用現(xiàn)有的任何測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定的該酶或作為轉(zhuǎn)錄因子的FruR的活性都在檢測(cè)限以下的狀態(tài)。此處所謂的FruR的活性，是指將利用被FruR控制的基因的表達(dá)生成的蛋白質(zhì)的量、或蛋白質(zhì)的功能定量化得到的值。本發(fā)明中所謂的“降低”，是指通過(guò)編碼該酶或作為轉(zhuǎn)錄因子的FruR的基因的基因重組，而使與進(jìn)行上述處理前狀態(tài)相比該酶或FruR的活性顯著降低的狀態(tài)。此處所謂的FruR的活性，是指將利用被FruR控制的基因的表達(dá)生成的蛋白質(zhì)的量、或蛋白質(zhì)的功能定量化得到的值。從副產(chǎn)物的減少及乳酸生產(chǎn)量的增加的觀點(diǎn)考慮，本發(fā)明中的乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)優(yōu)選包括丙酮酸甲酸裂解酶(Pfl)活性的失活或降低、用于生成D-乳酸或L-乳酸的NADH 依賴(lài)性乳酸脫氫酶活性的增強(qiáng)、或上述雙方(關(guān)于丙酮酸甲酸裂解酶(Pfl)活性的失活或降低，參見(jiàn)W02005/033324。關(guān)于NADH依賴(lài)性D-乳酸脫氫酶活性的增強(qiáng)，參見(jiàn)Yang等的文獻(xiàn)(Metab. Eng. Vol. 1 (2)，ppl41_152 (1999))。本發(fā)明中所謂的丙酮酸甲酸裂解酶(Pfl)，是基于國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合(I. U. B.)酶委員會(huì)報(bào)告被歸屬于酶編號(hào)2. 3. 1. 54、也稱(chēng)作甲酸乙?；D(zhuǎn)移酶的酶。該酶是指可逆地催化由丙酮酸生成甲酸的反應(yīng)的酶的總稱(chēng)。作為本發(fā)明中的NADH依賴(lài)性乳酸脫氫酶，可以舉出D-乳酸脫氫酶(LdhA)和L-乳酸脫氫酶(Ldh2)。所謂LdhA是指由丙酮酸和NADH生成D-乳酸和NAD的來(lái)自大腸桿菌的酶。所謂Ldh2是指由丙酮酸和NADH生成L-乳酸和NAD的酶，例如可以舉出來(lái)自長(zhǎng)雙歧桿菌的酶。本發(fā)明中所謂的乳酸脫氫酶活性的增強(qiáng)，是指通過(guò)編碼LdhA或Ldh2的基因的基因重組，而使與進(jìn)行上述處理前的狀態(tài)相比由編碼LdhA或Ldh2的基因生產(chǎn)的酶的活性顯著增加的狀態(tài)。需要說(shuō)明的是，乳酸包括D-乳酸及L-乳酸的光學(xué)異構(gòu)體，所以本發(fā)明中也將包括為了提高任意一方的光學(xué)異構(gòu)體的生產(chǎn)量的NADH依賴(lài)性D-乳酸脫氫酶或NADH依賴(lài)性 L-乳酸脫氫酶的活性的增強(qiáng)的系統(tǒng)特別稱(chēng)作“D-乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)”或“L-乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)”。因此，根據(jù)作為目標(biāo)的乳酸的種類(lèi)的不同可以適當(dāng)?shù)剡x擇乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)的種類(lèi)。特別是為了更快速地生成D-乳酸，D-乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括該大腸桿菌本身具有的FAD依賴(lài)性D-乳酸脫氫酶(Did)活性的失活或降低。D-乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)更優(yōu)選能夠包括下述兩方該大腸桿菌本身具有的FAD依賴(lài)性D-乳酸脫氫酶(Did)活性的失活或降低；及丙酮酸甲酸裂解酶(Pfl)活性的失活或降低及NADH依賴(lài)性D-乳酸脫氫酶活性的增強(qiáng)的至少一方，最優(yōu)選Dld活性的失活或降低、Pfl活性的失活或降低、及來(lái)自大腸桿菌的NADH依賴(lài)性D-乳酸脫氫酶(LdhA)活性的增強(qiáng)均具備的D-乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)。另外為了更快速地生成L-乳酸，L-乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括該大腸桿菌本身具有的FMN依賴(lài)性L-乳酸脫氫酶(LldD)活性或D-乳酸脫氫酶(LdhA)活性的失活或降低，優(yōu)選LldD活性和LdhA活性同時(shí)失活或降低。更優(yōu)選pfl活性、Ild活性及IdhA活性的至少一者的活性失活或降低、且NADH依賴(lài)性L-乳酸脫氫酶活性增強(qiáng)。最優(yōu)選Pfl活性及LldD活性及LdhA活性全部失活或降低、且來(lái)自雙歧桿菌的NADH依賴(lài)性L-乳酸脫氫酶活性增強(qiáng)。本發(fā)明中所謂的FMN依賴(lài)性L-乳酸脫氫酶(LldD)，是指基于國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合 (I. U. B.)酶委員會(huì)報(bào)告被歸屬于酶編號(hào)1. 1. 2. 3的酶。該酶是催化由L-乳酸生成丙酮酸反應(yīng)的酶的總稱(chēng)。作為本發(fā)明中LdhA活性增強(qiáng)、且Pfl活性失活或降低的細(xì)菌的例子，可以舉出W02005/033324 號(hào)中記載的 MT-10934/pGlyldhA。本發(fā)明中作為增強(qiáng)LdhA活性或Ldh2的方法之一，下述方法是有效的，即，將編碼 LdhA或Ldh2的基因和控制與糖酵解系統(tǒng)、核酸生物合成系統(tǒng)或氨基酸生物合成系統(tǒng)相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)的基因的啟動(dòng)子連接，在該狀態(tài)下組裝到表達(dá)質(zhì)粒中，再將表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到所希望的細(xì)菌中。此種情況下的控制與糖酵解系統(tǒng)、核酸生物合成系統(tǒng)或氨基酸生物合成系統(tǒng)相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)的基因的啟動(dòng)子是指通常在細(xì)菌內(nèi)、優(yōu)選在大腸桿菌內(nèi)發(fā)揮作用的強(qiáng)啟動(dòng)子、且即使在葡萄糖存在下其表達(dá)也不易受抑制的啟動(dòng)子，具體而言，可以舉出甘油醛-3-磷酸脫氫酶的啟動(dòng)子或絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(GlyA)啟動(dòng)子。如上所述得到的細(xì)菌在通氣條件下生產(chǎn)D-乳酸或L-乳酸時(shí)，與IdhA或ldh2的表達(dá)未被增強(qiáng)時(shí)相比，提高了 D-乳酸或L-乳酸的蓄積量，作為雜質(zhì)的丙酮酸濃度減少，并且能提高D-乳酸或L-乳酸的光學(xué)純度。本發(fā)明中所謂的FAD依賴(lài)性D-乳酸脫氫酶(Did)，是指催化在作為輔酶的氧化型黃素腺嘌呤二核苷酸的存在下由D-乳酸生成丙酮酸的反應(yīng)的酶的總稱(chēng)。本發(fā)明中作為以Dld活性失活或降低、且/或Pfl活性失活或降低、且/ 或LdhA活性增強(qiáng)為特征的微生物，可以舉出W02005/033324號(hào)中記載的大腸桿菌 MT-10994(FERMBP-10058)株。本發(fā)明中所謂的控制與糖酵解系統(tǒng)、核酸生物合成系統(tǒng)或氨基酸生合成系統(tǒng)有關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)的基因的啟動(dòng)子，是指通常在微生物內(nèi)發(fā)揮作用的強(qiáng)啟動(dòng)子，且即使在葡萄糖存在下其表達(dá)也不易受抑制的啟動(dòng)子，具體而言可以舉出甘油醛3-磷酸脫氫酶(以下也稱(chēng)作GAPDH)的啟動(dòng)子或絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的啟動(dòng)子。本發(fā)明中所謂的啟動(dòng)子是指具有σ因子的RNA聚合酶結(jié)合、并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)。 例如來(lái)自大腸桿菌的GAPDH啟動(dòng)子在GenBank accession number X(^662的堿基序列信息中被記為堿基編號(hào)397-440。本發(fā)明中作為具有下述特征的微生物，可以舉出W02005/033324號(hào)中記載的大腸桿菌MT-10994(FERM BP-10058)株，所述特征為編碼LdhA的基因在基因組上通過(guò)使用控制與糖酵解系統(tǒng)、核酸生物合成系統(tǒng)、或氨基酸生物合成系統(tǒng)有關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)的基因的啟動(dòng)子而表達(dá)該ldhA，Pfl活性失活或降低，且/或Dld活性失活或降低。大腸桿菌MT-10994株通過(guò)在基因組上與GAPDH啟動(dòng)子功能性地連接而使IdhA基因表達(dá)，另外通過(guò)基因破壞，PflB、Dld失活。基于涉及專(zhuān)利程序上的微生物保藏等國(guó)際認(rèn)證的布達(dá)佩斯條約，本菌株于平成16年3月19日以保藏編號(hào)FERM BP-10058保藏在日本茨城縣筑波市東1丁目1番1號(hào)中央第6的獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心。本發(fā)明的生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌，從乳酸生產(chǎn)效率的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選進(jìn)一步具有果糖代謝能力提高系統(tǒng)。作為上述果糖代謝能力提高系統(tǒng)，可以舉出在果糖代謝途徑中使磷酸化能力增強(qiáng)或果糖吸收能力增強(qiáng)的系統(tǒng)。此時(shí)，從乳酸生產(chǎn)效率的觀點(diǎn)考慮，更優(yōu)選果糖代謝途徑中磷酸化能力的增強(qiáng)是賦予果糖-1-磷酸激酶活性，果糖吸收能力的增強(qiáng)來(lái)自FruR活性的降低。本發(fā)明中能力的“賦予”或“增強(qiáng)”，除了包括將編碼酶的基因從宿主細(xì)菌的菌體外導(dǎo)入菌體內(nèi)之外，還包括使宿主細(xì)菌在基因組上具有的酶基因的啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，或通過(guò)被其他的啟動(dòng)子取代使酶基因強(qiáng)表達(dá)。本發(fā)明中所謂的磷酸化能力的“增強(qiáng)”是指磷酸化酶的活性提高從而使被磷酸化的基質(zhì)的量、或從該被磷酸化的基質(zhì)派生的代謝物的量顯著增加的狀態(tài)。本發(fā)明中所謂果糖吸收能力的增強(qiáng)，是指FruR控制的酶活性通過(guò)編碼FruR的基因的基因重組而與進(jìn)行上述處理前的狀態(tài)相比該酶活性顯著下降的狀態(tài)。本發(fā)明中酶的活性可以為利用現(xiàn)有的測(cè)定系統(tǒng)的任一種測(cè)定的活性。本發(fā)明中果糖-1-磷酸激酶(FruK)是基于國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合(I. U. B.)酶委員會(huì)報(bào)告被歸屬于酶編號(hào)2. 7. 1. 56、也被稱(chēng)作果糖磷酸激酶1的酶。在細(xì)菌類(lèi)例如在大腸桿菌內(nèi)的果糖吸收通常在葡萄糖的存在下被抑制，相對(duì)于此，到目前為止還完全未發(fā)現(xiàn)FruK 表達(dá)的增強(qiáng)即使在葡萄糖的存在下也能促進(jìn)果糖的吸收，并有助于生產(chǎn)D-乳酸的細(xì)菌中 D-乳酸的生產(chǎn)率的提高。另外，利用上述CscA由蔗糖得到的果糖被吸收進(jìn)細(xì)胞內(nèi)并被代謝為果糖-1-磷酸后，僅通過(guò)一系列的果糖代謝系統(tǒng)中的FruK的表達(dá)增強(qiáng)即可提高乳酸的生產(chǎn)率，這也是預(yù)想之外的。作為本發(fā)明的被導(dǎo)入宿主細(xì)菌的果糖-1-磷酸激酶(FruK)的基因，可以利用由具有該酶的生物得到的具有編碼果糖-1-磷酸激酶(FruK)的基因的堿基序列的DNA、或基于該基因公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例，可以舉出來(lái)自埃希氏菌屬菌 (Escherichia)、假單胞菌屬菌(Pseudomonas)、氣桿菌屬菌(Aerobacter)、梭狀芽孢桿菌屬菌(Clostridium)的基因，特別是可以舉出來(lái)自埃希氏菌屬菌Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來(lái)自大腸桿菌MG1655株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選具有來(lái)自大腸桿菌MG1655株的基因的堿基序列的DNA。本發(fā)明中的FruR控制構(gòu)成果糖PTS途徑的基因組的表達(dá)，即，控制果糖操縱子的表達(dá)，通過(guò)所述的果糖PTS途徑，微生物將果糖磷酸化并引入細(xì)胞內(nèi)。為大腸桿菌時(shí)，具體而言可以舉出具有記載于GenBank accession number U00096中所記載的大腸桿菌MG1655 株基因組序列的880 89032的序列的基因。破壞FruR基因時(shí)，已知作為果糖的磷酸供體的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的合成活性被抑制，結(jié)果一般認(rèn)為果糖未被吸收入菌體內(nèi)(參見(jiàn) Microbiology Reviews, SePt.，PP. 543-594 (1993))。因此，fruR 表達(dá)的降低可能促進(jìn)果糖的吸收是完全在預(yù)想之外的，fruR表達(dá)的降低有助于生產(chǎn)D-乳酸的細(xì)菌中D-乳酸生產(chǎn)率的提高完全是新的發(fā)現(xiàn)。作為本發(fā)明中表達(dá)被降低的FruR基因，可以為宿主細(xì)菌本身具有的基因，也可以為宿主細(xì)菌本身具有的具有編碼FruR的基因的堿基序列的DNA、或基于FruR基因公知的堿基序列組裝的合成DNA序列。更優(yōu)選蔗糖水解酶及果糖-1-磷酸激酶(FruK)均通過(guò)導(dǎo)入編碼來(lái)自大腸桿菌0 157或大腸桿菌MG 1655的各個(gè)蛋白質(zhì)的基因而得到。通過(guò)利用來(lái)自上述細(xì)菌的基因可以確保功能表達(dá)。本發(fā)明中所謂賦予酶活性的細(xì)菌，是指通過(guò)某種方法從菌體外向菌體內(nèi)被賦予了該酶活性的細(xì)菌。上述細(xì)菌例如可以使用利用基因重組技術(shù)將編碼該酶及蛋白質(zhì)的基因從菌體外導(dǎo)入菌體內(nèi)等方法進(jìn)行制作。將基因從菌體外導(dǎo)入菌體內(nèi)時(shí)必要的基因組DNA 的制備、DNA的切斷及連接、轉(zhuǎn)化、PCR(Polymerase Chain Reaction)、用作引物的寡核苷酸的設(shè)計(jì)、合成等的方法能夠使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的一般方法進(jìn)行。上述方法記載于Sambrook,J. ,et. al. ,"Molecular Cloning A Laboratory Manual,Second Edition",Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等中。本發(fā)明中所謂的酶活性降低的細(xì)菌，是指與賦予上述活性的細(xì)菌相同地利用某種方法從菌體外到菌體內(nèi)原有的活性被破壞的細(xì)菌。上述細(xì)菌例如可以通過(guò)破壞編碼該酶及蛋白質(zhì)的基因(基因破壞)制備。本發(fā)明中所謂的基因破壞，是指為了使某基因的功能不能發(fā)揮而在該基因的堿基序列中引入突變、插入另外的DNA或使基因的某部分缺失?；蚱茐牡慕Y(jié)果為該基因不能轉(zhuǎn)錄為mRNA，從而使結(jié)構(gòu)基因不被翻譯；或者被轉(zhuǎn)錄的mRNA不完全，從而使被翻譯的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的氨基酸序列中發(fā)生突變或缺失，不能發(fā)揮原有的功能?；蚱茐闹甑闹苽淇梢允褂萌我夥椒ㄖ灰艿玫皆撁富虻鞍踪|(zhì)不表達(dá)的破壞株。已經(jīng)報(bào)道了各種基因破壞的方法(自然育種、誘變劑添加、紫外線(xiàn)照射、放射線(xiàn)照射、隨機(jī)突變、轉(zhuǎn)座子、部位特異性基因破壞)，但從只能破壞某種特定基因的方面考慮，優(yōu)選利用同源重組的基因破壞。利用同源重組的方法記載于J. Bacteriol.，161， 1219-1221 (1985)或 J. Bacteriol.，177，1511-1519 (1995)或 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 97,6640-6645(2000)中，該領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用上述方法及其應(yīng)用容易地實(shí)施。本發(fā)明中所謂的大腸桿菌，是指無(wú)論本身是否具有由來(lái)自植物的原料生產(chǎn)乳酸的能力，均具有能通過(guò)使用某種方法而得到由來(lái)自植物的原料生產(chǎn)乳酸的能力的大腸桿菌。此處作為導(dǎo)入上述各基因的大腸桿菌，可以為不具有乳酸生產(chǎn)能力的通常的大腸桿菌，也可以為允許上述各基因的導(dǎo)入及變更的任意大腸桿菌。較優(yōu)選為預(yù)先賦予了乳酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌，由此可以更有效地生產(chǎn)乳酸。特別是根據(jù)本發(fā)明對(duì)本身不具有蔗糖同化能力的大腸桿菌賦予蔗糖同化能力可以由蔗糖有效地生產(chǎn)乳酸。作為上述本身不具有蔗糖同化能力的大腸桿菌，可以舉出K12株、B株、C株及其衍生株等。作為上述生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌，例如可以舉出國(guó)際公開(kāi)2005/033324號(hào)說(shuō)明書(shū)中記載的丙酮酸甲酸裂解酶(Pfl)活性失活或降低、且來(lái)自大腸桿菌的NADH依賴(lài)性D-乳酸脫氫酶(LdhA)活性增強(qiáng)的大腸桿菌；或者除在上述特性之外進(jìn)而FAD依賴(lài)性D-乳酸脫氫酶 (Did)活性失活的大腸桿菌；或蘋(píng)果酸脫氫酶(Mdh)活性失活或降低且Pfl活性失活或降低且/或Dld活性失活或降低的大腸桿菌等。作為本發(fā)明中用于使各種基因表達(dá)的啟動(dòng)子，只要能控制上述任一種基因的表達(dá)即可，優(yōu)選為通常在微生物內(nèi)發(fā)揮作用的強(qiáng)啟動(dòng)子、且即使在葡萄糖存在下其表達(dá)也不易受到抑制的啟動(dòng)子，具體而言可以舉出甘油醛3-磷酸脫氫酶(以下也稱(chēng)作GAPDH)的啟動(dòng)子或絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的啟動(dòng)子。另外作為用于使各種基因失活的方法，只要使用用于該目的的通常使用的方法即可，沒(méi)有特殊限制，例如可以舉出利用同源重組等的基因破壞。本發(fā)明的生產(chǎn)乳酸的方法包括使用上述生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌由來(lái)自植物的含有蔗糖的原料生產(chǎn)乳酸的方法，即，為包括使上述生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌與來(lái)自植物的含有蔗糖的原料接觸的工序、和將通過(guò)接觸得到的乳酸回收的回收工序的方法。上述乳酸生產(chǎn)方法中使用的來(lái)自植物的原料只要為從植物得到的碳源、且為來(lái)自植物的含有蔗糖的原料即可，沒(méi)有特殊限制。本發(fā)明中是指根、莖、桿、枝、葉、花或種子等器官、含有它們的植物體、上述植物器官的分解產(chǎn)物，進(jìn)而在由植物體、植物器官、或它們的分解產(chǎn)物得到的碳源中能在微生物的培養(yǎng)中用作碳源的也包含在來(lái)自植物的原料中。包含在上述的來(lái)自植物的原料中的碳源中，除蔗糖之外，作為一般物質(zhì)可以舉出 淀粉、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等糖類(lèi)，或大量含有上述成分的草木質(zhì)分解產(chǎn)物或纖維素水解物等或它們的組合，進(jìn)而來(lái)自植物油的甘油或脂肪酸也可以包含在本發(fā)明中的碳源中。本發(fā)明中作為來(lái)自植物的原料的示例，可以?xún)?yōu)選舉出糧食等農(nóng)作物，例如玉米、 米、小麥、大豆、甘蔗、甜菜、棉花等、或它們的組合，作為該原料的使用形式，可以為未加工品、榨汁、粉碎物等，沒(méi)有特別限定。另外，也可以是只為上述碳源的形式。接觸工序中生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌和來(lái)自植物的原料的接觸通常可以在含有來(lái)自植物的原料的培養(yǎng)基中通過(guò)培養(yǎng)生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌而進(jìn)行。來(lái)自植物的原料和生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌的接觸密度根據(jù)生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌的活性而不同，通常情況下，作為培養(yǎng)基中來(lái)自植物的原料的濃度，相對(duì)于混合物的總質(zhì)量，以葡萄糖換算可以使初始的糖濃度為20質(zhì)量％以下，從細(xì)菌的耐糖性的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選使初始的糖濃度為15質(zhì)量％以下。其他的各成分只要以微生物的培養(yǎng)基中通常添加的量添加即可，沒(méi)有特殊限制。另外作為培養(yǎng)基中的生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌的含量，根據(jù)細(xì)菌的種類(lèi)及活性而不同，但通常情況下初始菌濃度相對(duì)于培養(yǎng)液可以為0. 1質(zhì)量％ 30質(zhì)量％，從控制培養(yǎng)條件的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選為1質(zhì)量％ 10質(zhì)量％。作為用于培養(yǎng)生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌的培養(yǎng)基，只要為含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)離子、及為生產(chǎn)乳酸微生物所必需的有機(jī)微量元素、核酸、維生素類(lèi)等的培養(yǎng)基即可，沒(méi)有特殊限制。作為碳源，可以適當(dāng)使用葡萄糖、果糖、糖蜜等糖類(lèi)；富馬酸、檸檬酸、琥珀酸等有機(jī)酸；甲醇、乙醇、甘油等醇類(lèi)及其他碳源。作為氮源，可以適當(dāng)使用有機(jī)銨鹽、無(wú)機(jī)銨鹽、氨氣、氨水等無(wú)機(jī)氮源、及蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物等有機(jī)體氮源及其他氮源。作為無(wú)機(jī)離子，可以根據(jù)需要適當(dāng)使用鎂離子、磷酸離子、鉀離子、鐵離子、錳離子及其他無(wú)機(jī)離子。作為有機(jī)微量成分，可以適當(dāng)使用維生素、氨基酸等及含有它們的酵母提取物、 胨、玉米漿、酪蛋白分解物及其他有機(jī)微量成分。需要說(shuō)明的是，作為本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基，從應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的方面考慮，優(yōu)選為液體培養(yǎng)基。可以?xún)?yōu)選舉出添加有2種以上氨基酸的培養(yǎng)基。通過(guò)使用上述培養(yǎng)基可以更有效地生產(chǎn)乳酸。所謂添加有2種以上的氨基酸的培養(yǎng)基，是指含有天然存在的各種氨基酸中的至少2種以上的培養(yǎng)基，也包括含有酵母提取物、酪蛋白水解物、胨、乳清、廢糖蜜、玉米漿等天然物質(zhì)或天然物質(zhì)提取物的水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基。為了得到較優(yōu)選的結(jié)果，優(yōu)選含有 0. 5質(zhì)量％ 20質(zhì)量％、更優(yōu)選含有2質(zhì)量％ 15質(zhì)量％的選自酵母提取物、胨、乳清、廢糖蜜及玉米漿中的至少1種或它們的混合物的培養(yǎng)基。特別是玉米漿的添加能得到明顯的效果，此時(shí)不添加硫酸銨等鹽反而有時(shí)得到更好的結(jié)果。培養(yǎng)基為通常的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件根據(jù)制備的菌體、培養(yǎng)裝置而改變，通常情況下優(yōu)選在20°C 40°C，較優(yōu)選在25°C 35°C下的培養(yǎng)溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)選利用NaOH、NH3等將pH調(diào)至4 9、更優(yōu)選至6. 0 7. 2，更優(yōu)選至6. 5 6. 9進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間沒(méi)有特別限定，是菌體充分增殖、 且乳酸生成所需要的時(shí)間。
培養(yǎng)時(shí)通常使用能控制溫度、pH、通氣條件、攪拌速度的培養(yǎng)槽，但本發(fā)明的培養(yǎng)并不限于使用培養(yǎng)槽。使用培養(yǎng)槽培養(yǎng)時(shí)，根據(jù)需要也可以預(yù)先進(jìn)行作為預(yù)培養(yǎng)的種培養(yǎng)， 然后將其必要量接種到預(yù)先配制的培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)本發(fā)明中得到的微生物生產(chǎn)乳酸時(shí)，可以完全不進(jìn)行通氣，但為了得到較優(yōu)選結(jié)果，進(jìn)行通氣較好。此處所謂的通氣條件下，未必是必須將空氣通過(guò)培養(yǎng)液中，也包括根據(jù)培養(yǎng)槽的形狀一邊適度地?cái)嚢枧囵B(yǎng)液一邊將培養(yǎng)液上的空氣層進(jìn)行換氣之類(lèi)的上面通氣，所謂的通氣條件下是指使含有氧的氣體流入培養(yǎng)槽的內(nèi)部。通氣到液體中時(shí)，由于根據(jù)內(nèi)壓、攪拌槳位置、攪拌槳形狀、攪拌速度的組合溶存的氧濃度發(fā)生變化，所以可以以乳酸的生產(chǎn)率及除乳酸之外的有機(jī)酸的量等為指標(biāo)如下求出最適條件。例如，使用500g的培養(yǎng)液利用ABLE公司制培養(yǎng)裝置BMJ-Ol等較小型的培養(yǎng)槽進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，通過(guò)能夠達(dá)到在常壓下0. 005L/分鐘 0. 5L/分鐘的通氣率和50rpm 500rpm的攪拌速度、較優(yōu)選能夠達(dá)到在常壓下0. 05L/分鐘 0. 25L/分鐘的通氣率和 IOOrpm 400rpm的攪拌速度的通氣條件可以得到合適結(jié)果。所述通氣攪拌條件可以在以溫度30°C的水為對(duì)象的情況下在常壓下以Ι/h以上400/h以下的氧轉(zhuǎn)移速度系數(shù)(ha)進(jìn)行氧的供給。上述通氣條件不需要從培養(yǎng)初期至結(jié)束一直維持，即使在培養(yǎng)工序的一部分維持上述通氣條件也能夠得到合適結(jié)果。在回收工序中，回收由上述接觸得到的乳酸，通常情況下也可以從通過(guò)上述培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物中回收乳酸。本發(fā)明中所謂的培養(yǎng)物，是指利用上述方法生產(chǎn)的菌體、培養(yǎng)液、及它們的處理物。從培養(yǎng)物中回收乳酸的方法可以利用例如從培養(yǎng)液中收集等通常已知的方法，例如可以采用下述方法利用離心分離等除去菌體后進(jìn)行酸化、然后直接進(jìn)行蒸餾的方法； 形成丙交酯并進(jìn)行蒸餾的方法；加入醇和催化劑進(jìn)行酯化后進(jìn)行蒸餾的方法；在有機(jī)溶劑中進(jìn)行提取的方法；利用離子交換柱進(jìn)行分離的方法；利用電透析進(jìn)行濃縮分離的方法等和組合上述方法的方法。另外，由于利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的菌體產(chǎn)生了適合乳酸生產(chǎn)的酶組，所以利用菌體進(jìn)一步生產(chǎn)、回收乳酸也被認(rèn)為是從培養(yǎng)物回收乳酸的方法的一部分。[實(shí)施例]以下記載本發(fā)明的實(shí)施例，但是本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。需要說(shuō)明的是， 只要沒(méi)有特殊說(shuō)明，則“ ％ ”及“份”為質(zhì)量基準(zhǔn)。[實(shí)施例1]<大腸桿菌MG1655株did基因缺失株的制備>大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBank accession number U00096)，編碼大腸桿菌的FAD依賴(lài)性D-乳酸脫氫酶的基因(以下也簡(jiǎn)稱(chēng)did)的堿基序列也被 艮道(Genbank accession number M10038)?；诖竽c桿菌MG 1655株基因組DNA的did基因附近區(qū)域的基因信息，合成了下述 4 種寡核苷酸引物CAACACCAAGCTTTCGCG (序列號(hào) 1)、TTCCACTCCTTGTGGTGGC (序列號(hào) 2)、 AACTGCAGAAATTACGGATGGCAGAG(序列號(hào)；3)及 TGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC (序列號(hào) 4)。通過(guò) Current Protocols in Molecular Biology (Johnffiley & Sons)記載的方法制備大腸桿菌MG1655株的基因組DNA，以所得的基因組DNA為模板，使用序列號(hào)1和序列號(hào)2的引物，在通常條件下進(jìn)行PCR，由此擴(kuò)增約1. 4kbp的DNA片段(以下也稱(chēng)作dld_L 片段)，使用序列號(hào)3和序列號(hào)4的引物，在通常條件下進(jìn)行PCR，由此擴(kuò)增約1. 2kbp的 DNA片段(以下也稱(chēng)作dld-R片段)。分別利用限制酶HindIII和PstI, PstI和XbaI消化所得的dld-L片段、dld-R片段。將該片段與利用Hindlll、XbaI消化溫度感受性質(zhì)粒 pTH18csl (Hashimoto-Gotoh, Τ.，et. al. ,Gene, Vol. 241 (1),PP185-191 (2000))所得的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)株式會(huì)社DNA-903)中，得到于30°C下在含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于30°C 下在含有10 μ g/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒。將所得的質(zhì)粒命名為PTH Δ did。需要說(shuō)明的是，大腸桿菌MG 1655株可以從作為細(xì)胞·微生物·基因庫(kù)的美國(guó)模式菌種收集中心獲得。[實(shí)施例2]于30°C下將實(shí)施例1中得到的質(zhì)粒pTHAdld轉(zhuǎn)化到MG1655株中，得到在含有 10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的轉(zhuǎn)化體涂布到瓊脂平板上，于 30°C下培養(yǎng)一夜。然后為了得到上述培養(yǎng)菌體，將培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體涂布到含有10μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，得到于42°C下繁殖的菌落。進(jìn)而再一次重復(fù)得到于42°C下繁殖的單菌落的操作，選擇通過(guò)同源重組質(zhì)粒整體被組裝到染色體中的克隆體。確認(rèn)了該克隆體的細(xì)胞質(zhì)中不具有質(zhì)粒。然后將上述克隆體涂布在LB瓊脂平板上，于30°C下培養(yǎng)一夜后，接種到LB液體培養(yǎng)基CMl/試管)中，于42°C下振搖培養(yǎng)3 4小時(shí)。為了得到單菌落，將其進(jìn)行適當(dāng)?shù)叵♂?10_2 10_6左右)，涂布在LB瓊脂平板上，于42°C下培養(yǎng)一夜，得到菌落。從出現(xiàn)的菌落中任意挑選100個(gè)菌落，使其分別在LB瓊脂平板和含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖，選出只在LB瓊脂平板上繁殖的氯霉素感受性克隆體。然后使用上述目標(biāo)克隆體的染色體DNA利用PCR擴(kuò)增含有did的約2. Okb的片段，選擇did基因區(qū)域缺失的株，以滿(mǎn)足以上條件的克隆體作為did缺失株，將所得的株命名為MG1655 Δ did株。[實(shí)施例3]<大腸桿菌MG1655pflB、did基因缺失株的制備>大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBank accession number U00096)，編碼大腸桿菌的丙酮酸甲酸裂解酶的基因(pflB)的堿基序列也被報(bào)道(Genbank accession number X08035)。為了克隆pf IB基因的堿基序列的附近區(qū)域，合成了下述4種寡核苷酸引物GCACGAAAGCTTTGATTACG(序列號(hào)幻、TTATTGCATGCTTAGATTTGACTGAAATCG (序列號(hào) 6) TTATTGCATGCTTATTTACTGCGTACTTCG (序列號(hào) 7) AAGGCCTACGAAAAGCTGCAG (序列號(hào) 8)。以大腸桿菌MG1655株的基因組DNA為模板，使用序列號(hào)5和序列號(hào)6的引物，在通常條件下進(jìn)行PCR，由此擴(kuò)增約1. Skbp的DNA片段(以下也稱(chēng)作pflB-L片段)，使用序列號(hào)7和序列號(hào)8的引物，在通常條件下進(jìn)行PCR，由此擴(kuò)增約1. 3kbp的DNA片段(以下也稱(chēng)作pflB-R片段)。利用瓊脂糖電泳分離、回收上述DNA片段，用HindIII及SphI消化 PflB-L片段，用SphI及I^stI消化pflB-R片段。利用T4DNA連接酶使上述2種消化片段與溫度感受性質(zhì)粒 pTH18csl (GenBank accession number AB019610)的 Hindlll 及 PstI 消化物反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)株式會(huì)社DNA-903)中，得到包含PflB基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2個(gè)片段的質(zhì)粒，命名為ρΤΗΔρ !。將所得的質(zhì)粒ρΤΗ Δ pf 1轉(zhuǎn)化到實(shí)施例2中得到的MG1655 Δ did株中，得到于30°C 下在含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的轉(zhuǎn)化體涂布到瓊脂平板上，于30°C下培養(yǎng)一夜。然后為了得到上述培養(yǎng)菌體，將培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體涂布到含有 10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，得到于42°C下繁殖的菌落。按照與實(shí)施例2相同的方法從所得的克隆體得到pfl基因被破壞的MG1655 Δ did 株，命名為 MG1655 Δ pfl Δ did 株。[實(shí)施例4]< 大腸桿菌 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh 株的制備 >大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBank accession number U00096)，大腸桿菌的mdh基因的堿基序列也被報(bào)道(Genbank accession number M24777)。為了克隆mdh基因(939bp)的堿基序列的附近區(qū)域，合成了下述 4 種寡核苷酸引物AAAGGTACCAGAATACCTTCTGCTTTGCCC (序列號(hào) 9)、 AAAGGATCCCCTAAACTCCTTATTATATTG(序列號(hào) 10)、AAAGGATCCAAACCGGAGCACAGACTCCGG (序列號(hào) 11)及 AAATCTAGAATCAGATCATCGTCGCCTTAC(序列號(hào) 12)。以大腸桿菌MG1655株的基因組DNA為模板，利用序列號(hào)9和序列號(hào)10、序列號(hào) 11和序列號(hào)12的組合，在通常條件下進(jìn)行PCR，由此擴(kuò)增約800bp (以下也稱(chēng)作mdh-L片段)及約l，000bp(以下也稱(chēng)作mdh-R片段)的DNA片段。利用瓊脂糖電泳分離、回收上述DNA片段，用KpnI及BamHI消化mdh_L片段，用BamHI及)(baI消化mdh-R片段。利用 T4DNA連接酶使上述2種消化片段與溫度感受性質(zhì)粒pTHWcsl (GenBank accession number AB019610)的KpnI及)(bal消化物反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)株式會(huì)社DNA-903)中，得到包含編碼mdh的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2 個(gè)片段的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為pTHAmdh。將質(zhì)粒ρΤΗ Δ mdh轉(zhuǎn)化到實(shí)施例3中得到的大腸桿菌MG1655 Δ pfl Δ did株中，按照與實(shí)施例2相同的方法獲得mdh基因被破壞的MG1655Apfl Adld株。將該株命名為 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh 株。[實(shí)施例5]< 大腸桿菌 MG1655 Δ pfl AdldAmdhAasp 株的制備 >大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBank accession number U00096),大腸桿菌的aspA基因的堿基序列也被報(bào)道(Genbank accession number X04066)。為了克隆aspA基因(1，482bp)的堿基序列的附近區(qū)域，合成了下述4種寡核苷酸引物TTTTGAGCTCGATCAGGATTGCGTTGGTGG(序列號(hào)13)、 CGAACAGTAATCGTACAGGG(序列號(hào) 14)、TACGATTACTGTTCGGCATCGACCGAATACCCGAG (序列號(hào) 15) 及 TTTTTCTAGACCTGGCACGCCTCTCTTCTC(序列號(hào) 16)。以大腸桿菌MG1655株的基因組DNA為模板，利用序列號(hào)13和序列號(hào)14、序列號(hào) 15和序列號(hào)16的組合，使用上述引物，在通常條件下進(jìn)行PCR，由此擴(kuò)增約910bp(以下也稱(chēng)作aspA-L片段)及約l，100bp (以下也稱(chēng)作aspA-R片段)的DNA片段。利用瓊脂糖電泳分離、回收上述DNA片段，利用DNA Blunting Kit(TAKARA BIO)將aspA-L片段和aspA-R片段的兩者的末端平端化后，使用T4多核苷酸激酶按照常規(guī)方法磷酸化5’末端。另外，溫度感受性質(zhì)粒pTH18csl經(jīng)SmaI消化后，利用堿性磷酸酶進(jìn)行脫磷酸化處理。利用T4DNA 連接酶使上述磷酸化的2種片段與脫磷酸化的質(zhì)粒反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)株式會(huì)社DNA-903)中，得到包含aspA基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2個(gè)片段的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為pTHAasp。將質(zhì)粒pTHAasp轉(zhuǎn)化到實(shí)施例4中得到的大腸桿菌MG1655 Δ pf 1 Δ did Δ mdh 株中，最終得到aspA基因被破壞的MG1655ApflAdldAmdh株，命名為 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp株。得到該株的詳細(xì)方法基于本發(fā)明的實(shí)施例2中所述的方法。[實(shí)施例6]<大腸桿菌MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp株的基因組上IdhA啟動(dòng)子對(duì)GAPDH啟動(dòng)子的取代〉大腸桿菌的IdhA基因的堿基序列已經(jīng)被報(bào)道(GenBank accession number U36928) 0為了獲得甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動(dòng)子，使用大腸桿菌MG1655株的基因組 DNA 為模板，利用 AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC (序列號(hào) 17)、及 ACAGAATTCGCTATTT GTTAGTGAATAAAAGG(序列號(hào)18)用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，利用限制酶EcoRI消化所得的DNA片段， 由此得到約IOObp編碼GAPDH啟動(dòng)子的片段。進(jìn)而為了獲得D-乳酸脫氫酶基因(IdhA)， 使用大腸桿菌MG1655株的基因組DNA為模板，利用GGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGAAACT (序列號(hào)19)、及CCCAAGCTTTTAAACCAGTTCGTTCGGGC(序列號(hào)20)用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，利用限制酶 EcoRI及HindIII消化所得的DNA片段，由此得到約1. Okbp的D-乳酸脫氫酶(IdhA)基因片段。將上述2個(gè)DNA片段與利用限制酶EcoRI及HindIII消化質(zhì)粒pUC 18所得的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)株式會(huì)社DNA-903) 中，得到在含有50μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于 30°C下在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒 pGAP-ldhA。進(jìn)而使用基于大腸桿菌MG1655株的IdhA基因5’附近區(qū)域的基因信息制備的 AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC(序列號(hào) 21)和 GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC (序列號(hào) 22)，以大腸桿菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，由此擴(kuò)增約IOOObp的DNA片段。另外，使用基于大腸桿菌MG1655株的甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動(dòng)子的序列信息制備的GGTCTAGAGCAATGATTCACACGATTCG(序列號(hào)23)和基于大腸桿菌MG1655株的 IdhA基因的序列信息制備的AACTGCAGGTTCGTTCTCATACACGTCC(序列號(hào)24)，以預(yù)先制備的質(zhì)粒pGAPldhA為模板進(jìn)行PCR，得到由GAPDH啟動(dòng)子和IdhA基因的起始密碼子的附近區(qū)域組成的約850bp的DNA片段。分別利用限制酶KpnI和)(baI、XbaI和I^stI消化如上所述得到的片段，將該片段與利用KpnI和I^stI消化溫度感受性質(zhì)粒pTHlScsl所得的片段混合，使用連接酶連接后， 于30°C下轉(zhuǎn)化到DH5ci感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)株式會(huì)社DNA-903)中，得到在含有IOyg/ ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于30°C下在含有10 μ g/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒，命名為pTH-GAPldhA。將所得的質(zhì)粒pTH-GAPldhA轉(zhuǎn)化到實(shí)施例5中得到的大腸桿菌MG1655 Δ pf 1 Δ did Δ mdh Δ asp株，于30°C下在含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)一夜，得到轉(zhuǎn)化體。將所得的轉(zhuǎn)化體接種到含有10 μ g/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基上，于 30°C下培養(yǎng)一夜。然后為了得到上述的培養(yǎng)菌體，將培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體涂布到含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，得到于42°C下繁殖的菌落。將所得的菌落于30°C下在不含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一夜，進(jìn)而涂布到不含氯霉素的LB瓊脂平板上，得到于42°C下繁殖的菌落。從出現(xiàn)的菌落中任意挑選100個(gè)菌落，使其分別在不含氯霉素的LB瓊脂平板和含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖，選出氯霉素感受性克隆體。然后使用上述目標(biāo)克隆體的染色體DNA利用PCR擴(kuò)增含有GAPDH啟動(dòng)子和IdhA基因的約800bp的片段，選擇IdhA啟動(dòng)子區(qū)域被GAPDH啟動(dòng)子取代的株，將滿(mǎn)足以上條件的克隆體命名為 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp/GAPldhA 基因組插入株。[實(shí)施例7]< 大腸桿菌 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp Δ fruR/GAPldhA 基因組插入株的制備 >大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBankaccession number U00096)，大腸桿菌MG1655的fruR基因的堿基序列已經(jīng)被報(bào)道。S卩，fruR基因被記載在 GenBank accession number U00096中所記載的大腸桿菌MG1655株基因組序列的88028 89032。為了克隆fruR基因(IO(^bp)的堿基序列的附近區(qū)域，合成了如下所示的4種寡核苷酸引物TACTGCAGATCTCAATAACCGCTATCTGG(序列號(hào)25)、 GCTCTAGATAGCCATTGTACTGGTATGG (序列號(hào) 26)、TATCTAGATGCTCAGCCGTAGCTAAGC (序列號(hào) 2了) 及 CGAATTCATCCATCTGACATTCGCTGG(序列號(hào) 28)。以大腸桿菌MG1655株的基因組DNA為模板，利用序列號(hào)25和序列號(hào)沈、序列號(hào)27 和序列號(hào)28的組合，使用上述引物，在通常條件下進(jìn)行PCR，由此擴(kuò)增約950bp (以下也稱(chēng)作 fruR-L片段)及約880bp (以下也稱(chēng)作fruR-R片段)的DNA片段。利用瓊脂糖電泳分離、 回收上述DNA片段，用I^stI及^CbaI消化fruR-L片段，用)(baI及EcoRI消化fruR-R片段。 利用T4DNA連接酶使上述2種消化片段與溫度感受性質(zhì)粒pTH18csl (GenBan kaccession numberAB019610)的I3StI及EcoRI消化物反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)株式會(huì)社DNA-903)中，得到包含fruR基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2個(gè)片段的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為ρΤΗΔ fruR。將質(zhì)粒pTHAfruR轉(zhuǎn)化到實(shí)施例6中得到的大腸桿菌MG 1655ApflAdldAmdhAasp/GAPldhA基因組插入株中，按照與實(shí)施例2相同的方法獲得 fruR基因被破壞的MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp/GAPldhA基因組插入株。將該株命名為 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp Δ fruR/GAPldhA 基因組插入株。[實(shí)施例8]〈來(lái)自大腸桿菌0157的蔗糖水解酶(轉(zhuǎn)化酶)的基因表達(dá)載體及該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建>大腸桿菌0 157的轉(zhuǎn)化酶的氨基酸序列和基因的堿基序列已經(jīng)被報(bào)道。S卩，編碼轉(zhuǎn)化酶的基因(cscA)被記載在GenBank accession number AE005174中所記載的大腸桿菌0 157株基因組序列的3274383 3275816。上述基因編碼的蛋白質(zhì)的N末端側(cè)，存在與在單字母氨基酸標(biāo)記中以MTQSRLHAA(序列號(hào)35)表示的、疏水性高并利用信號(hào)肽酶切斷的氨基酸序列相同的序列。作為用于表達(dá)上述基因所必需的啟動(dòng)子的堿基序列，可以使用在 GenBank accession number X02662的堿基序列信息中被記于397-440的來(lái)自大腸桿菌的甘油醛3-磷酸脫氫酶(以下也稱(chēng)作GAPDH)的啟動(dòng)子序列。為了獲得GAPDH啟動(dòng)子，使用大腸桿菌MG1655株的基因組DNA為模板，利用CGAG CTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG (序列號(hào) 2 、及 TCTAGAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG (序列號(hào)30)用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，利用限制酶NdeI消化所得的DNA片段，由此得到約IlObp的相當(dāng)于GAPDH啟動(dòng)子的DNA片段。將所得的DNA片段與利用限制酶NdeI及PvuII消化質(zhì)粒ρ BR322(GenBankaccessionnumberJ01749)得到的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci株感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)株式會(huì)社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于37°C下在含有50μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒pBRgapP。為了獲得轉(zhuǎn)化酶基因，使用大腸桿菌0 157的基因組DNA (SIGMA-ALDRICH IRMM449)為模板，利用 GATCTAGACGGAGAAAGTCTTATGACGCAATCTCGATTGCATG(序列號(hào) 31)、及 ATGGTACCTTAACCCAGTTGCCAGAGTGC(序列號(hào)3 用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，利用限制酶XbaI消化所得的DNA片段，由此得到約1. 4kbp的轉(zhuǎn)化酶基因片段。將所得的DNA片段與利用限制酶 ^CbaI及I^shAI消化預(yù)先制成的質(zhì)粒pBRgapP得到的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci株感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)株式會(huì)社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于37°C下在含有50μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒pGAP-cscA。將該質(zhì)粒pGAP-cscA轉(zhuǎn)化到實(shí)施例7中制成的 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp Δ fruR/GAPldhA 基因組插入株感受態(tài)細(xì)胞中，于 37 °C 下在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB Broth, Miller瓊脂平板上培養(yǎng)一夜，由此得到 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp Δ fruR/GAPldhA 基因組插入株 /pGAP-cscA 株。另外轉(zhuǎn)化到實(shí)施例6中制成的]\^1655八？打八(11(^111(11^38 /64 1(11^基因組插入株感受態(tài)細(xì)胞中，于37°C下在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB Broth，MiIler瓊脂平板上培養(yǎng)一夜，由此得到 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp/GAPldhA 基因組插入株 /pGAP-cscA 株。[實(shí)施例9]〈來(lái)自大腸桿菌0157的轉(zhuǎn)化酶基因、來(lái)自大腸桿菌MG1655的果糖-1-磷酸激酶基因的表達(dá)載體及該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建>大腸桿菌MG1655的果糖磷酸激酶的氨基酸序列和基因的堿基序列已經(jīng)被報(bào)道。即，編碼果糖-1-磷酸激酶的基因(fruK)被記載在GenBank accession number U00096 中所記載的大腸桿菌MG1655株基因組序列的2沈0387 2259449。為了獲得果糖-1-磷酸激酶基因，使用大腸桿菌MG1655的基因組DNA 為模板，利用 ATGGTACCGGAGAAAGTCTTATGAGCAGACGTGTTGCTAC (序列號(hào) 3 、及 TCGGATCCTTATGCCTCTCCTGCTGTCAG(序列號(hào)34)用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，利用限制酶KpnI消化所得的DNA片段，由此得到約1. Okbp的果糖-1-磷酸激酶基因片段。將所得的DNA片段與利用限制酶KpnI及EcoRV消化實(shí)施例8中制成的質(zhì)粒pGAP-cscA所得的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α株感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)株式會(huì)社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于37°C 下在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒 pGAP-cscA-fruKo將上述質(zhì)粒pGAP-cscA-fruK轉(zhuǎn)化到實(shí)施例6中制成的 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp/GAPldhA基因組插入株感受態(tài)細(xì)胞中，于37°C下在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB Broth, Miller瓊脂平板上培養(yǎng)一夜，由此得到 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp/GAPldhA 基因組插入株 /pGAP-cscA-fruK 株。[實(shí)施例10]< 利用 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp Δ fruR/GAPldhA 基因組插入株 /pGAP-cscA 株、MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp/GAPldhA 基因組插入株 /pGAP-cscA-fruK 株、 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp/GAPldhA 基因組插入株 /pGAP-cscA 株生產(chǎn) D-乳酸 >作為預(yù)培養(yǎng)，是在3個(gè)裝有25mlLB Broth、Miller培養(yǎng)液(Difco244620)的500ml 容量帶擋板的錐形瓶中分別植入實(shí)施例8中得到的MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp Δ fruR/ GAPldhA基因組插入株/pGAP-cscA株(以下為“fruR破壞株”或“ Δ fruR株”)、 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp/GAPldhA 基因組插入株 /pGAP-cscA 株(以下為“cscA 株，，)、 實(shí)施例 9 中得到的 MG1655 Δ pfl Δ did Δ mdh Δ asp/GAPldhA 基因組插入株/pGAP-cscA-fruK 株(以下為“fruK增強(qiáng)株”或“+fruK株”)，于35°C、以120rpm攪拌培養(yǎng)一夜。然后，在裝有如表1所示的475g培養(yǎng)基的3臺(tái)IL容量的培養(yǎng)槽(ABLE公司制培養(yǎng)裝置BMJ-01)中， 分別植入上述燒瓶的全部?jī)?nèi)容物。[表1]培養(yǎng)基組成
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，具有蔗糖非PTS基因組中至少包括蔗糖水解酶基因的1 種以上的基因，但是不包括阻抑蛋白(CSCR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(CSCK)及蔗糖透過(guò)酶(cscB)的組合和蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透過(guò)酶(cscB)的組合，并且具有利用基因重組的乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)。
2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中所述蔗糖非PTS基因組中只具有蔗糖水解酶基因，并且具有利用基因重組的乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)。
3.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌進(jìn)一步具有提高果糖代謝能力的系統(tǒng)。
4.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)包括丙酮酸甲酸裂解酶活性的失活或降低。
5.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)包括用于生成D-乳酸或L-乳酸的NADH依賴(lài)性乳酸脫氫酶活性的增強(qiáng)。
6.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)包括D-乳酸脫氫酶活性的增強(qiáng)，和所述大腸桿菌本身具有的FAD依賴(lài)性D-乳酸脫氫酶活性的失活或減低。
7.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)包括L-乳酸脫氫酶活性的增強(qiáng)，該大腸桿菌本身具有的D-乳酸脫氫酶活性及FMN依賴(lài)性L-乳酸脫氫酶活性中的至少任一方的失活或降低。
8.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述增強(qiáng)果糖代謝能力的系統(tǒng)是在果糖代謝途徑中磷酸化能力的增強(qiáng)或果糖吸收能力的增強(qiáng)。
9.如權(quán)利要求8所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述果糖代謝途徑中磷酸化能力的增強(qiáng)來(lái)自果糖-ι-磷酸激酶活性。
10.如權(quán)利要求8所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述果糖代謝途徑中果糖吸收能力的增強(qiáng)來(lái)自該大腸桿菌本身具有的FruR活性的失活或降低。
11.如權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述蔗糖水解酶基因來(lái)自埃希氏菌屬細(xì)菌。
12.如權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述蔗糖水解酶基因來(lái)自大腸桿菌0 157細(xì)菌。
13.如權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述果糖-1-磷酸激酶來(lái)自埃希氏菌屬細(xì)菌。
14.如權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，所述果糖-1-磷酸激酶是來(lái)自大腸桿菌MG 1655的蛋白質(zhì)。
15.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，其中，生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌是大腸桿菌 K12衍生株。
16.一種生產(chǎn)乳酸的方法，包括使用權(quán)利要求1 15中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌，由來(lái)自植物的含有蔗糖的原料生產(chǎn)乳酸。
全文摘要
本發(fā)明提供生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌和使用該生產(chǎn)乳酸的大腸桿菌由來(lái)自植物的含有蔗糖的原料生產(chǎn)乳酸的乳酸生產(chǎn)方法，所述大腸桿菌具有蔗糖非PTS基因組中的至少包括蔗糖水解酶基因的1種以上的基因，但是不包括阻抑蛋白(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透過(guò)酶(cscB)的組合和蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透過(guò)酶(cscB)的組合，并且具有利用基因重組的乳酸生產(chǎn)增強(qiáng)系統(tǒng)。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102333859SQ20098013597
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2009年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月16日
發(fā)明者和田光史, 安樂(lè)城正, 宮澤大輔, 望月大資, 森重敬, 高橋克幸, 高橋均 申請(qǐng)人:三井化學(xué)株式會(huì)社