專利名稱：產(chǎn)生具有高淀粉含量和產(chǎn)量以及高直鏈淀粉/支鏈淀粉比例的轉(zhuǎn)基因植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳工程和植物生理學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明包括產(chǎn)生具有高淀粉水平以及高直鏈淀粉/支鏈淀粉比例的轉(zhuǎn)基因植物的方法，用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的載體，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞本身，通過(guò)該方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物和它們的用途。
背景技術(shù)：
植物中的淀粉和細(xì)菌以及動(dòng)物中的糖原都是通過(guò)α -1，4和α _1，6型共價(jià)鍵連接的葡萄糖分子的支化均聚物。這些聚合物是重要的糖類和能量?jī)?chǔ)存形式。在植物中，淀粉是在質(zhì)體中合成的，淀粉大量積聚在諸如種子(小麥、大麥、玉米、豌豆等)和塊莖(其中有馬鈴薯和甘薯)的組織中，并且是人類飲食的基本組成成分。另一方面，淀粉常常用于造紙、 化妝品、醫(yī)藥和食品工業(yè)中，以及作為基本的原材料用于制造可生物降解的塑料，具有低環(huán)境壓力的顏料以及生物乙醇。許多淀粉應(yīng)用是主要基于直鏈淀粉和支鏈淀粉的平衡，這決定了淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)和它在水懸浮液中的粘度。ADPG是在植物和細(xì)菌中分別用于生物合成淀粉和糖原的通用前體分子。普遍猜測(cè)該核苷酸糖的產(chǎn)生僅僅由酶ADPG焦磷酸化酶(AGPase) (EC 2. 7. 7. 27)控制(1-4)。然而， 有證據(jù)顯示蔗糖合成酶(EC 2. 4. 1. 13) (UDP-葡萄糖D_果糖-2-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶)參與 ADPG的合成，ADPG對(duì)于淀粉生物合成而言是必要的(5_9)。如果考慮到ADPG降解機(jī)制，則在植物(10-13)和細(xì)菌(14，15)中都存在ADPG水解酶。在植物中，淀粉降解是由α -淀粉酶、β -淀粉酶和α _葡糖苷酶催化的水解反應(yīng)控制的(16，17)。相反，在動(dòng)物、細(xì)菌和酵母中，則是α-1，4-葡聚糖磷酸酶(GP) (EC 2. 4. 1. 1)控制糖原分子在體內(nèi)的降解(18-22)。GP催化非還原性多聚葡聚糖例如淀粉、麥芽糖糊精和糖原末端的α-1，4鍵的可逆切割，導(dǎo)致生成葡萄糖-1-磷酸(GlP)。動(dòng)物、植物或細(xì)菌來(lái)源的編碼具有GP活性的酶的核苷酸序列是保守序列。植物具有質(zhì)體內(nèi)和質(zhì)體外GP。與在細(xì)菌、酵母和動(dòng)物中所發(fā)生的不同，迄今為止植物GP的作用還未知，尤其是質(zhì)體內(nèi)的那些。考慮到GP的可逆性，有可能它們?cè)诘矸鄞x中的作用依賴于Pi/GlP平衡01)。因此植物細(xì)胞中現(xiàn)有的高Pi/GlP平衡強(qiáng)有力地顯示質(zhì)體 GP并不參與淀粉合成，增強(qiáng)了淀粉合成僅僅通過(guò)依賴于ADPG產(chǎn)生的方法的理論。有證據(jù)暗示質(zhì)體GP可能參與Phaseoulus vulgaris和擬南芥(Arabidopsis thaliana)葉子中的淀粉降解03)。另一方面，已經(jīng)暗示質(zhì)體GP具有與非生物脅迫、開(kāi)花和種子發(fā)育相關(guān)的功能04-27)。在考慮到質(zhì)體GP缺陷的海藻萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的STA4突變體淀粉水平降低時(shí)，關(guān)于植物中質(zhì)體GP的生物功能的討論進(jìn)一步復(fù)雜化，其暗示質(zhì)體GP并不參與萊茵衣藻中的淀粉降解08)。另一方面，有研究顯示質(zhì)體GP在塊莖植物例如馬鈴薯和小麥中不參與淀粉降解09，30)。這為討論質(zhì)體GP可能參與淀粉降解增添了更多困惑，盡管一些研究已經(jīng)顯示了正相關(guān)性。存在一些工作描述了具有低GP活性的植物的產(chǎn)生和表征04)。這些植物積聚正常水平的淀粉。另一方面，有工作描述了編碼GP的大腸桿菌glgP基因的過(guò)表達(dá)，得到了糖原水平降低或?yàn)榱愕募?xì)菌0 。最后，有一些工作描述了編碼哺乳動(dòng)物GP的基因的過(guò)表達(dá)得到了糖原水平降低的人細(xì)胞(18)?，F(xiàn)有技術(shù)沒(méi)有提供在植物GP酶和它的具體功能之間的明確聯(lián)系。事實(shí)上，迄今為止還沒(méi)有關(guān)于具有高GP活性的更高級(jí)植物品種的產(chǎn)生和/或鑒定的已知出版物。本發(fā)明精確地集中在該最后一點(diǎn)，描述了具有高GP活性(細(xì)胞質(zhì)的和質(zhì)體的)的塊莖轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，表達(dá)編碼具有GP活性的蛋白質(zhì)/酶的基因，獲得高GP活性 (細(xì)胞質(zhì)的和質(zhì)體的)，并因而得到高淀粉水平和性能，高直鏈淀粉/支鏈淀粉平衡?？紤]的另一個(gè)重要方面是本發(fā)明顯示編碼GP酶的基因的表達(dá)，因此提高了 GP活性，導(dǎo)致淀粉含
量提高。因此，本發(fā)明打破了現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)動(dòng)物、細(xì)菌和酵母GP活性所建立的偏見(jiàn)，其限定了 GP活性傾向于切割葡萄糖聚合物的^-1，4鍵而產(chǎn)生6斤。這還顯示細(xì)菌GP在表達(dá)編碼該酶的基因的轉(zhuǎn)基因植物中促進(jìn)淀粉的合成。因此，本發(fā)明的目的是產(chǎn)生具有高淀粉含量和產(chǎn)量以及高直鏈淀粉/支鏈淀粉平衡的植物，作為GP活性(細(xì)胞質(zhì)中的GP活性和質(zhì)體中的GP活性)提高的結(jié)果以表達(dá)編碼具有GP活性的蛋白質(zhì)的基因。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，本發(fā)明的目的是產(chǎn)生具有高淀粉含量和產(chǎn)量以及高直鏈淀粉/支鏈淀粉平衡的植物，作為GP活性(細(xì)胞質(zhì)中的和質(zhì)體中的)提高的結(jié)果以表達(dá)編碼具有高GP 活性的蛋白質(zhì)的基因。為了本發(fā)明的目的，注解下列術(shù)語(yǔ)MM 所有生物能夠自主活動(dòng)的最小單位(形態(tài)的和功能的)。細(xì)菌和植物細(xì)胞對(duì)于本發(fā)明是特別感興趣的。細(xì)胞質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)的液體溶液。質(zhì)體植物細(xì)胞特有的細(xì)胞器。其負(fù)責(zé)光合作用真核生物的光合作用。遺傳載體用于將外源遺傳材料轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)部的“媒介”。本領(lǐng)域中已知的任何載體都可以用于本發(fā)明中。然而，在本發(fā)明中，優(yōu)選使用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)0同源序列幾乎一致的DNA核苷酸序列，包括能夠在嚴(yán)格條件下發(fā)生堿基配對(duì)。異位表汰基因的異位表達(dá)是指它的產(chǎn)物在通常不發(fā)生表達(dá)的位置被表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植物基因組被遺傳改造的植物為了實(shí)現(xiàn)與野生型植物的生物特征不同的生物特征(如本發(fā)明的情況)。GP酶的高活件當(dāng)活性是野生型植物中所存在的活性的至少5倍時(shí)，成為高GP酶活性。高淀粉含量在本文中所使用的，這種表達(dá)方式直接指的是比在對(duì)照植物中所觀察到的數(shù)值高的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的數(shù)值。圖7顯示在所分析的野生型植物(CRl和CM)的塊莖中平均淀粉含量大約為290微摩爾葡萄糖/g(鮮重)，偏差幅度為10%。因此，“高淀粉含量”可以被認(rèn)為是超過(guò)290微摩爾葡萄糖/g(鮮重)數(shù)值的至少20%。在本發(fā)明中超過(guò)該數(shù)值，獲得了轉(zhuǎn)基因塊莖，其積聚了最少400微摩爾葡萄糖/g (鮮重)的淀粉量。
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HiRh盲鏈淀粉/支鏈淀粉比例如圖9中所示，桉照淀粉酶的百分比表汰的盲鏈淀粉/支鏈淀粉比例，在所分析的野生型植物(CR)的塊莖中為大約22.5%，誤差幅度為 2.5% (其構(gòu)成了在CR中觀察到的平均數(shù)值的10%)。當(dāng)所分析的轉(zhuǎn)基因植物的直鏈淀粉百分比數(shù)值比在相應(yīng)的野生型植物中直鏈淀粉百分比數(shù)值大至少10%時(shí)，認(rèn)為存在高直鏈淀粉/支鏈淀粉比例(在這種情況中，直鏈淀粉/支鏈淀粉比例大于25%被認(rèn)為是富含直鏈淀粉)。


圖1 表達(dá)質(zhì)粒pETMb-glgP的構(gòu)建階段。圖 2 表達(dá)質(zhì)粒 pBIN20-B33-LCA-GP-N0S 的構(gòu)建階段。.圖3 表達(dá)質(zhì)粒pBIN20;35S-GP-N0S的構(gòu)建階段。圖 4 =SDS-PAGE0 從用 pET15b_glgP (CECT 7071)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌 BL21 (DE3) C43 的細(xì)胞提取物純化的重組GP的染色。圖5 未轉(zhuǎn)換馬鈴薯植物(品系1)塊莖的蛋白質(zhì)印跡和來(lái)自轉(zhuǎn)化CECT 7054(品系2)和CECT 7055(品系3和4)的馬鈴薯植物的不同克隆的塊莖的蛋白質(zhì)印跡。在每個(gè)泳道中，上樣50g蛋白質(zhì)，并且進(jìn)行SDS-PAGE。使用GP大腸桿菌特異性多克隆抗體對(duì)大腸桿菌的GP進(jìn)行免疫標(biāo)記。注意，只有表達(dá)大腸桿菌glgP的品系才產(chǎn)生了大概93kDa的條
市ο圖6 野生型馬鈴薯植物和通過(guò)分別使用根癌土壤桿菌(A. tumefaciens) CECT 7054和CECT 7055菌株向其基因組中整合35S-glgP-N0S和B33_ChlTP-glgP_N0S構(gòu)建體之后表達(dá)大腸桿菌glgP的塊莖中的GP活性?；钚灾府a(chǎn)自糖原的GlP的量比塊莖粗提物鮮重(每miliU/g鮮重)。所分析的兩種野生型植物被標(biāo)記為CRl和CR2。轉(zhuǎn)基因植物被標(biāo)記為 B33-7、B33-11、B33-12、B33-13 和 B33_14(使用 CECT 7055 獲得的那些)以及 35S-1、 35S-6、35S-11和35S_14(使用CECT 7054獲得的那些)。所表示的數(shù)值對(duì)應(yīng)每個(gè)品系10 株不同植物的塊莖的標(biāo)準(zhǔn)平均值和偏差。圖7 野生型馬鈴薯植物和通過(guò)分別使用根癌土壤桿菌(A. tumefaciens) CECT 7054和CECT 7055菌株向其基因組中整合35S-glgP-N0S和B33_ChlTP-glgP_N0S構(gòu)建體之后表達(dá)大腸桿菌glgP的塊莖中的淀粉含量。所分析的兩種野生型植物被標(biāo)記為CRl和 CR2。轉(zhuǎn)基因植物被標(biāo)記為 B33-7、B33-11、B33-12、B33-13 和 B33_14(使用 CECT7055 獲得的那些)以及35S-1、35S-6、35S-11和35S-14(使用CECT 70M獲得的那些)。所表示的數(shù)值對(duì)應(yīng)每個(gè)品系10株不同植物的塊莖的標(biāo)準(zhǔn)平均值和偏差。圖8 野生型馬鈴薯植物和通過(guò)分別使用根癌土壤桿菌(A. tumefaciens) CECT 7054和CECT 7055菌株向其基因組中整合35S-glgP-N0S和B33_ChlTP-glgP_N0S構(gòu)建體之后表達(dá)大腸桿菌glgP的塊莖中的蔗糖(A)、葡萄糖(B)和果糖(C)的含量。所分析的兩種野生型植物被標(biāo)記為CRl和CR2。轉(zhuǎn)基因植物被標(biāo)記為B33-7、B33-11、B33-12、B33-13 和 B33-14(使用 CECT 7055 獲得的那些)以及 35S_1、35S-6、35S_11 和 35S_14(使用 CECT 7054獲得的那些)。所表示的數(shù)值對(duì)應(yīng)每個(gè)品系10株不同植物的塊莖的標(biāo)準(zhǔn)平均值和偏差。圖9 野生型馬鈴薯植物和通過(guò)分別使用根癌土壤桿菌(A. tumefaciens) CECT7054和CECT 7055菌株向其基因組中整合35S-glgP-N0S和B33_ChlTP-glgP_N0S構(gòu)建體之后表達(dá)大腸桿菌glgP的塊莖中的直鏈淀粉/支鏈淀粉比例，表達(dá)為直鏈淀粉百分比。所分析的兩種野生型植物被標(biāo)記為CRl和CR2。轉(zhuǎn)基因植物被標(biāo)記為B33-7、B33-11、B33-12、 B33-13 和 B33-14(使用 CECT 7055 獲得的那些)以及 35S_1、35S-6、35S_11 和 35S_14(使用CECT 70M獲得的那些)。所表示的數(shù)值對(duì)應(yīng)每個(gè)品系10株不同植物的塊莖的標(biāo)準(zhǔn)平均值和偏差。發(fā)明的詳細(xì)描述獲得和純化活件重組GP大腸桿菌glgP的核苷酸序列是已知的(22)，形成兩條特異性引物(SEQID NO 1和SEQ ID NO :2)，對(duì)應(yīng)基因的5’端和3’端。通過(guò)使用這些引物，利用傳統(tǒng)的PCR方法從大腸桿菌的基因組DNA擴(kuò)增大約M60堿基對(duì)的DNA片段。將該DNA片段引入質(zhì)粒 pGemT-easy (Promega)中，得到pG-glgP構(gòu)建體(圖1)，將其在XLl藍(lán)色宿主細(xì)菌中進(jìn)行擴(kuò)增。使用限制性酶HioI和BamHI消化PG-glgP。將所釋放的片段(含有g(shù)lgP)克隆入表達(dá)質(zhì)粒pET-15b(+) (Novagen)的相同限制性位點(diǎn)。將所得到標(biāo)記為名稱pETMb-glgP的質(zhì)粒 (圖1)通過(guò)電穿孔引入菌株大腸桿菌BL21(DE3)C43 (Novagen)中，保藏號(hào)為CECT 7071。通過(guò)向在37°C下培養(yǎng)的IOOml細(xì)胞培養(yǎng)物中添加ImM異丙基-硫代半乳糖苷(IPTG)來(lái)實(shí)現(xiàn) glgP表達(dá)。在誘導(dǎo)培養(yǎng)六小時(shí)后，收獲細(xì)菌并重懸浮在細(xì)1結(jié)合緩沖液(Novagen，His-結(jié)合純化試劑盒)中，超聲處理并在40，OOOg下離心20分鐘。將含有在N-末端具有組氨酸標(biāo)簽的重組GP的上清液通過(guò)Novagen" His-結(jié)合"蛋白質(zhì)純化試劑盒的親和柱。根據(jù)試劑盒的指導(dǎo)，用6ml推薦的洗脫緩沖液對(duì)GP進(jìn)行洗脫，所述推薦的洗脫緩沖液含有200mM 咪唑而不是1摩爾。在洗脫后，將蛋白質(zhì)快速進(jìn)行透析以除去所有痕量的可能會(huì)不可逆地使GP失活的咪唑?？扇苄蕴呛偷矸酆康拇_定使用科學(xué)文獻(xiàn)中描述的技術(shù)提取可溶性糖(34，35)。使用配合PAlOCarboPac株、 ED50電化學(xué)檢測(cè)儀、GP50 El梯度泵和EOl洗脫劑組織器的DIONEX自動(dòng)離子層析檢測(cè)蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、果糖和葡萄糖0幻。使用配合Partisil-10-SAX柱的HPLC Waters系統(tǒng)測(cè)定ADPG (10)。使用文獻(xiàn)中描述的商業(yè)試劑盒測(cè)量淀粉、糖原和支鏈淀粉(36)。使用文獻(xiàn)中描述的分光光度計(jì)法測(cè)定直鏈淀粉/支鏈淀粉比例(36)。鑒定具有GP酶活性的產(chǎn)物通過(guò)下列功能特征鑒定鑒定GP酶產(chǎn)物-它是α-1，4-糖原磷酸酶(EC2.4. 1. 1)。通常，該酶催化葡萄糖分子(支化或非支化)通過(guò)α-1，4和α _1，6鍵共價(jià)連接的均聚多糖，例如麥芽糖糊精、淀粉和糖原的非還原端的α -1，4鍵的可逆磷酸分解，導(dǎo)致GlP的產(chǎn)生。獲得特異件GP大腸桿菌多克降抗體在SDS-PAGE上分離兩毫克純化的重組大腸桿菌GP。洗脫后，將純化的重組GP與弗氏完全佐劑混合(以50/50比值)，然后等分成三份相同的部分，將每個(gè)部分以兩周的周期注射入兔子內(nèi)。在首次注射后大約兩周之后，從兔子中提取含有針對(duì)大腸桿菌GP特異性的多克隆抗體的血清。
通過(guò)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)鑒定產(chǎn)物在SDS-PAGE上分離野生型植物以及表達(dá)編碼大腸桿菌GP的glgP基因的轉(zhuǎn)基因植物的塊莖的粗提取物。隨后，將它們轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，并且根據(jù)文獻(xiàn)中描述的方法使用抗大腸桿菌GP的特異性抗體檢測(cè)大腸桿菌GP (37)。獲得表汰大腸桿菌glgP的轉(zhuǎn)基因棺物a.在塊苯的淀粉ilH本(amvloplasts)中Jl有高GP活t牛的馬鈐薯棺物利用酶NcoI和BamHI消化質(zhì)粒pG-glgP-NcoI (與pG-glgP相同，只是質(zhì)粒pG-glgP-Ncol在ATG翻譯起始密碼子處具有NcoI位點(diǎn))。將所釋放的片段克隆入 pSK-B33-SuSy-N0S的NcoI和BamHI位點(diǎn)(B33是編碼patatin的基因的啟動(dòng)子區(qū)域， patatin基因的表達(dá)是塊莖特異性的)(38)，得到了質(zhì)粒pSK-B33-glgP_N0S (圖2)。為了產(chǎn)生編碼定位在質(zhì)體中的大腸桿菌的GP的基因構(gòu)建體，利用NcoI和BamHI 消化pG-glgP-Ncol。將所釋放的片段克隆在質(zhì)粒pSK-ChlTP-ASPP的NcoI和BamH位點(diǎn)之間，質(zhì)粒pSK-ChlTP-ASPP含有編碼蛋白質(zhì)P541的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的基因的區(qū)域，得到了質(zhì)粒 pSK-ChlTP-glgP(圖 2)。為了產(chǎn)生編碼特異性積聚在馬鈴薯塊莖的淀粉質(zhì)體中的大腸桿菌的GP的構(gòu)建體，連續(xù)用Sail、T4-DNA聚合酶和BamHI消化pSK-ChlTP-glgP。在已經(jīng)連續(xù)用Ncol、 T4-DNA聚合酶和BamHI消化后，將所釋放的片段克隆入pSK-B33-glgP_N0S，得到了質(zhì)粒 pSK-B33-ChlTP-glgP-N0S(圖 2)。為了產(chǎn)生對(duì)于通過(guò)根癌土壤桿菌(A. tumefaciens)轉(zhuǎn)化植物而言必要的含有基因構(gòu)建體B33-ChlTP-N0S-glgP的雙向質(zhì)粒，依次用NotI、T4 DNA聚合酶和 XhoI消化psK-B33-ChlTP-glgP-N0S。將所釋放的片段克隆入雙向質(zhì)粒pBIN20 (40)， 所述雙向質(zhì)粒PBIN20之前被依次用HpaI、T4 DNA聚合酶和BioI消化，得到質(zhì)粒 PBIN20-B33-C1P-GP-N0S (圖 2)。通過(guò)電穿孔將 PBIN20-B33-C1P-GP-N0S 引入不同的根癌土壤桿菌菌株內(nèi)，這些根癌土壤桿菌對(duì)于轉(zhuǎn)化物種例如馬鈴薯、擬南芥、番茄、煙草、玉米和水稻而言是必要的(例如，菌株C58 :GV2260，保藏號(hào)CECT 7055)。將CECT7055用于根據(jù)該物種的常規(guī)轉(zhuǎn)化規(guī)程轉(zhuǎn)化馬鈴薯植物G1)。b.組成型表達(dá)glgP以及具有高細(xì)胞質(zhì)GP活性的植物為了產(chǎn)生具有高細(xì)胞質(zhì)GP活性的植物，形成大腸桿菌glgP基因構(gòu)建體，它們的表達(dá)由煙草花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35S控制。為此，用BioI和NcoI消化質(zhì)粒pSK_35S。 將所釋放的片段(含有結(jié)合至促進(jìn)區(qū)的啟動(dòng)子35S(42))克隆在質(zhì)粒pSK-B33-glgP-N0S 的XhoI和NcoI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pSK-35S-glgP-N0S(圖3)。為了將該構(gòu)建體通過(guò)根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)至植物基因組，必須要之前將該構(gòu)建體克隆在雙向質(zhì)粒。為此，依次用酶NotI， T4DNA聚合酶和BioI消化pSK-35S-glgP_N0S。將釋放的片段克隆入雙向質(zhì)粒pBIN20，其之前已經(jīng)被連續(xù)用酶Hpal，T4 DNA聚合酶和B10I進(jìn)行消化。將所獲得的質(zhì)粒標(biāo)記名稱為 pBIN2035S-GP-N0S(圖；3)。通過(guò)電穿孔將pBIN2035S_GP_N0S引入不同的根癌土壤桿菌菌株內(nèi)(例如菌株C58 :GV2260，保藏號(hào)為CECT 70M)，這些根癌土壤桿菌對(duì)于轉(zhuǎn)化物種例如馬鈴薯、擬南芥、番茄、煙草、玉米和水稻而言是必要的。因此，本發(fā)明的第一目的涉及一種獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法，與未轉(zhuǎn)化的野生型植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物具有高GP活性，高淀粉含量和產(chǎn)量以及高直鏈淀粉/支鏈淀粉比例，其特征在于，利用包含動(dòng)物、植物或細(xì)菌來(lái)源的核苷酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化野生型植物，所述核苷酸序列編碼具有高GP活性的蛋白質(zhì)并且在經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá)所述蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明方法的特征在于，在所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中編碼和表達(dá)的蛋白質(zhì)的GP活性是所述野生型動(dòng)物的GP活性的至少5倍，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的淀粉含量比未轉(zhuǎn)化的野生型植物的淀粉含量高至少20%，所述轉(zhuǎn)基因植物的直鏈淀粉含量比未轉(zhuǎn)化的野生型植物的直鏈淀粉含量高至少10%，在所有情況下未經(jīng)轉(zhuǎn)化的野生型植物與轉(zhuǎn)基因植物在相同的條件下生長(zhǎng)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明方法的特征在于，用于轉(zhuǎn)化所述野生型植物的表達(dá)載體中所包含的核苷酸序列選自下列a.編碼特征為SEQ ID NO 4的氨基酸序列的核苷酸序列；b.特征為SEQ ID NO 3的核苷酸序列；c.與“a”或“b”中所限定的核苷酸序列雜交并且編碼具有GP活性的酶產(chǎn)物的核苷酸序列；d.由于遺傳密碼子簡(jiǎn)并性而與“a”、“b”或“C”中所限定的核苷酸序列不同的核苷酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明方法的特征在于，在所述轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)，通過(guò)利用包含質(zhì)粒PBIN2035S-GP-N0S的根癌土壤桿菌CECT 7054轉(zhuǎn)化所述野生型植物能夠達(dá)到在細(xì)胞質(zhì)水平的高GP活性，以及通過(guò)利用包含質(zhì)粒PBIN20-B33-C1P-GP-N0S的根癌土壤桿菌CECT7055轉(zhuǎn)化所述野生型植物達(dá)到在質(zhì)體水平的高GP活性。本發(fā)明的第二方面涉及表達(dá)載體-根癌土壤桿菌CECT7054，其特征在于包含質(zhì)粒pBIN2035S_GP_N0S-根癌土壤桿菌CECT7055，其特征在于包含質(zhì)粒pBIN20-B33-ClP-GP_N0S。本發(fā)明的第三個(gè)目的涉及被上述兩種載體轉(zhuǎn)化或者感染的細(xì)胞，所述細(xì)胞是細(xì)菌或植物細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)菌細(xì)胞的特征在于是大腸桿菌BL21(DE3)C43 的細(xì)菌細(xì)胞，其被利用表達(dá)編碼重組GP蛋白質(zhì)的基因的質(zhì)粒pETMb-glgP轉(zhuǎn)化。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的植物細(xì)胞的特征在于所述植物細(xì)胞被包含質(zhì)粒pBIN2035S-GP-N0S的根癌土壤桿菌CECT 7054轉(zhuǎn)化或者感染，或者被包含質(zhì)粒 PBIN20-B33-C1P-GP-N0S的根癌土壤桿菌CECT 7055轉(zhuǎn)化或者感染，其中屬于下列植物物種馬鈴薯(Solanumtuberosum),煙草(Nicotiana tabacum),/K 稻(Oryza sativa),玉米 (Zea mays)禾口擬南芥(Arabidopsis thaliana)。本發(fā)明的第四個(gè)目的涉及前述細(xì)菌細(xì)胞用于生產(chǎn)活性重組GP蛋白質(zhì)以及生產(chǎn)針對(duì)GP的特異性抗體的用途。本發(fā)明的第五個(gè)目的涉及被包含質(zhì)粒PBIN2035S-GP-N0S的根癌土壤桿菌CECT 7054轉(zhuǎn)化或者感染的細(xì)菌或植物細(xì)胞的用途，或者被包含質(zhì)粒PBIN20-B33-C1P-GP-N0S的根癌土壤桿菌CECT 7055轉(zhuǎn)化或者感染的細(xì)菌或植物細(xì)胞用于生產(chǎn)淀粉的用途。本發(fā)明的第六個(gè)目的涉及被包含質(zhì)粒PBIN2035S-GP-N0S的載體根癌土壤桿菌 CECT 7054轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，或者被包含質(zhì)粒PBIN20-B33-C1P-GP-N0S的根癌土壤桿菌 CECT 7055轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，相對(duì)于野生型植物在細(xì)胞質(zhì)水平和質(zhì)體水平上均具有高GP活性，因而與未經(jīng)轉(zhuǎn)化的野生型植物相比具有高淀粉含量和產(chǎn)量以及高直鏈淀粉/支鏈淀粉比例，在所有情況中，野生型植物都是在與轉(zhuǎn)基因植物在相同條件和相同的年份生長(zhǎng)的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的特征在于GP活性為野生型植物的 GP活性的至少5倍，它的淀粉含量比野生型的淀粉含量高至少20%，直鏈淀粉含量的數(shù)值比野生型植物的直鏈淀粉含量的數(shù)值高至少10 %，在所有情況中，野生型植物都是在相同的條件下進(jìn)行培育的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的特征在于，它表達(dá)glgP基因 (SEQ ID NO 3)并且編碼具有高GP活性的蛋白質(zhì)，并且進(jìn)一步所述轉(zhuǎn)基因植物選自包括下列的組馬鈴薯(Solanum tuberosum)、煙草(Nicotiana tabacum)、水稻(Oryza sativa)、 玉米(Zea mays)禾口擬南芥(Arabidopsis thaiiana)。本發(fā)明的第七個(gè)目的涉及前述轉(zhuǎn)基因植物用于生產(chǎn)淀粉的用途。本發(fā)明的第八個(gè)目的涉及針對(duì)GP酶的多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明的第九目的涉及所述抗體用于測(cè)量樣品中所存在GP濃度的用途。根據(jù)布達(dá)佩斯條約進(jìn)行的微生物保藏在本發(fā)明中所使用的微生物被保藏于西班牙普通微生物保藏中心 (Coleccion Espanola de Cultivos Tipo-CECT),位于 Research Building ofValencia University, Burjassot Campus, Burjassot 46100(Valencia, Spain)。·轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pET15b-glgP的大腸桿菌BL21 (DE3)C43菌株于2005年3月7日被保藏，保藏號(hào)為CECT 7071。·轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 pBIN20-B33-ClP-GP-N0S 的根癌土壤桿菌 C58 :GV2260 菌株于 2005 年 1月14日被保藏，保藏號(hào)為CECT 7055?！まD(zhuǎn)化質(zhì)粒pBIN2035S-GP-N0S的根癌土壤桿菌C58 :GV2260菌株于2005年1月 14日被保藏，保藏號(hào)為CECT 7054。
實(shí)施例下面所提出的實(shí)施例是為了描述本發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 在大腸桿菌中產(chǎn)生重組GP根據(jù)編碼大腸桿菌GP的glgP基因的核苷酸序列知識(shí)形成兩條特異性的引物(它們的序列是有義鏈5，-3，)，SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。通過(guò)使用這些引物，利用傳統(tǒng)的 PCR方法從大腸桿菌的基因組DNA擴(kuò)增DNA片段；將其引入質(zhì)粒pGemT-easy (Promega)，得到質(zhì)粒pG-glgP。用限制性酶BioI和BamHI消化PG-glgP。將所釋放的片段(含有g(shù)lgP) 克隆入表達(dá)質(zhì)粒pET-15b(+) (Novagen)的相同限制性位點(diǎn)。通過(guò)電穿孔將所得到的質(zhì)粒 (標(biāo)記名稱為 pET15b-glgP，圖 1)引入大腸桿菌 BL21(DE3)C43 (Novagen)。pET_15b(+)中克隆的核苷酸序列片段是SEQ ID NO :3。在SEQ ID NO :3表達(dá)之后得到的氨基酸序列是SEQ ID NO :4。通過(guò)添加ImM IPTG，發(fā)生轉(zhuǎn)化 pET15b-glgP 的細(xì)菌 BL21(DE3)C43(CECT 7071)中 glgP表達(dá)的誘導(dǎo)。額外在37攝氏度下培養(yǎng)6小時(shí)后，觀察到轉(zhuǎn)化pETMb-glgP的細(xì)菌積聚了大約95kD的蛋白質(zhì)，其可以被以簡(jiǎn)單的方式借助親和層析使用"His-結(jié)合”純化試劑盒(Novagen)純化成均一的(圖4)。此外，這些細(xì)菌的特征在于不含有糖原02)。實(shí)施例2 酶促檢驗(yàn)在37攝氏度下進(jìn)行酶促反應(yīng)。根據(jù)所分析的多聚糖原的降解測(cè)量GP活性。在第一步驟中，將50微升反應(yīng)混合物溫浴15分鐘，該反應(yīng)混合物由下列構(gòu)成50mM HEPES (pH 7.5)、30mM磷酸緩沖液(pH 7.5)、多聚糖原(相當(dāng)于IOmM葡萄糖)和蛋白質(zhì)提取物。在煮沸2分鐘后，停止反應(yīng)，以30，OOOg離心20分鐘。將上清中存在的釋放的GlP通過(guò)下列方法任一項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定·通過(guò)分光光度計(jì)法。將300微升含有H印es 50mM pH 7，EDTA ImM, MgCl2 2mM, KCl 15mM, NAD+O. 6mM, 1單位磷酸葡萄糖變位酶以及另一種Leuconostoc mesenteroides的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，以及30微升從步驟1得到的上清液溫浴20分鐘，在340nm處使用 Multiskan EX spectrophotometer (Labsystems)監(jiān)控 NADH 的產(chǎn)生。在步驟 1 中不存在糖原時(shí)，所有蛋白質(zhì)提取物所產(chǎn)生的NADH的量都是可以忽略不計(jì)的。 通過(guò)層析。將40微升來(lái)自步驟1的上清液，使用配有Carbo-Pac PAlO柱和電流測(cè)定的DX-500Dionex系統(tǒng)進(jìn)行高親和力液相層析。單位(U)被描述為催化每分鐘產(chǎn)生1微摩爾產(chǎn)物的酶的量。實(shí)施例3 具有GP活性的產(chǎn)物的鑒定所獲得的具有GP活性的產(chǎn)物滿足任何GP相關(guān)科學(xué)文獻(xiàn)中描述的通常特征 (22. 43-45)?！ご竽c桿菌的GP識(shí)別5個(gè)或以上葡萄糖分子的均聚多糖例如糖原、淀粉、麥芽七糖、麥芽六糖和麥芽五糖?！に鼘?duì)麥芽四糖、麥芽三糖或麥芽糖不起作用?！に槐籄DP葡萄糖、UDP葡萄糖、核苷單磷酸酯、核苷二磷酸酯、核苷三磷酸酯例如AMP、ADP和ATP、3-磷酸甘油酯、果糖_1，6- 二磷酸、果糖_6_磷酸、葡萄糖_6_磷酸或葡萄糖所抑制?！ぴ谧冃阅z中的純化的蛋白質(zhì)的表觀分子量為約93kDa(圖4)。實(shí)施例4 根據(jù)下面的異位表達(dá)編碼GP的基因，制備具有高GP活性的植物(質(zhì)體高GP活性以及細(xì)胞質(zhì)高GP活性)使用菌株根癌土壤桿菌CECT 7054(其容納質(zhì)粒pBIN2035S-GP-N0S)，獲得組成型表達(dá) glgP 的下列馬鈴薯植物(Solanumtuberosum)，煙草(Nicotiana tabacum)，7K稻 (Oryza sativa)，玉米(Zea mays)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)。使用菌株根癌土壤桿菌CECT 7055 (其容納質(zhì)粒pBIN20-B33-LCA-GP-N0Q，獲得在其塊莖中表達(dá)glgP的馬鈴薯植物。使用CECT 7055和CECT 70M轉(zhuǎn)化的的馬鈴薯植物的塊莖聚集由針對(duì)大腸桿菌的 GP獲得的多克隆抗體特異性識(shí)別的一種蛋白質(zhì)(圖5)，然而，在相同環(huán)境和種植條件(灌溉、肥料、殺蟲(chóng)劑處理等)、相同的年份生長(zhǎng)的未轉(zhuǎn)化的野生型馬鈴薯植物的塊莖不會(huì)表達(dá)該酶。使用CECT 7054(其容納編碼定位于細(xì)胞質(zhì)的GP的構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植物以及使用CECT7055轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植物(其容納編碼定位于淀粉質(zhì)體中的GP的構(gòu)建體)具有下列特征1. GP活性是在未轉(zhuǎn)化的塊莖中存在的活性的5-8倍(圖6)。
2.與未轉(zhuǎn)化的塊莖相比為高淀粉含量(在未轉(zhuǎn)化的塊莖中為大約300 μ mol葡萄糖 /g 鮮重，而在品系:35S-glgP-NOS 和 B33-ChlTP-glgP-N0S 中觀察到的為 450-700 μ mol 葡萄糖/g鮮重)(圖7)。因此，令人吃驚的是，與在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中所發(fā)生的不同， GP活性的提高導(dǎo)致了淀粉含量的提高。3.高蔗糖含量以及低葡萄糖和果糖的趨勢(shì)(圖8)。4.與未轉(zhuǎn)化植物的塊莖相比為高直鏈淀粉/支鏈淀粉比例(圖9)。同樣，該結(jié)果是令人吃驚的，因?yàn)槿绻鸊P具有葡萄糖聚合物的降解作用，則異位表達(dá)GP的塊莖的直鏈淀粉/支鏈淀粉比例應(yīng)該低于未轉(zhuǎn)化的植物的塊莖中所觀察到的直鏈淀粉/支鏈淀粉比例。 圖7和圖9中所表示的結(jié)果顯示GP的表達(dá)引起在貯藏器官中聚集的淀粉量的增加。5.與未轉(zhuǎn)化的植物相比，異位表達(dá)GP的植物的外形沒(méi)有異常。6.與未轉(zhuǎn)化的植物相比，異位表達(dá)GP的品系中塊莖的數(shù)目是正常的。每株植物以 kg鮮重計(jì)的產(chǎn)量不受GP表達(dá)的影響，而每株植物的淀粉產(chǎn)量則受GP表達(dá)的影響。表1 大腸桿菌GP的底物特異性。反應(yīng)混合物(50 μ 1)包括50mMHEPES (pH 7. 5)， 30mM Pi，指定的糖原(5mM葡萄糖)和3U重組GP。在37攝氏度下溫浴3小時(shí)后，在100攝氏度下加熱2分鐘停止反應(yīng)。通過(guò)具有電流測(cè)定的的HPLC分析產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法，與未轉(zhuǎn)化的野生型植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物具有高 GP活性，高淀粉含量和產(chǎn)量以及高直鏈淀粉/支鏈淀粉比例，其特征在于，利用包含動(dòng)物、 植物或細(xì)菌來(lái)源的核苷酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化野生型植物，所述核苷酸序列編碼具有高GP 活性的蛋白質(zhì)并且在經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá)所述蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中編碼和表達(dá)的蛋白質(zhì)的GP活性是所述野生型植物的GP活性的至少5倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物的淀粉含量比在相同的條件下生長(zhǎng)的未轉(zhuǎn)化的野生型植物的淀粉含量高至少20%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物中直鏈淀粉含量數(shù)值比未轉(zhuǎn)化的野生型植物的直鏈淀粉含量數(shù)值高至少10%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，用于轉(zhuǎn)化所述野生型植物的表達(dá)載體中所包含的核苷酸序列選自下列a.編碼特征為SEQID NO 4的氨基酸序列的核苷酸序列；b.特征為SEQID NO 3的核苷酸序列；c.與“a”或“b”中所限定的核苷酸序列雜交并且編碼具有GP活性的酶產(chǎn)物的核苷酸序列；d.由于遺傳密碼子簡(jiǎn)并性而與“a”、“b”或“C”中所限定的核苷酸序列不同的核苷酸序列。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在所述轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)在細(xì)胞質(zhì)水平和質(zhì)體水平上均能夠達(dá)到高GP活性。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述高細(xì)胞質(zhì)GP活性是通過(guò)利用包含質(zhì)粒PBIN2035S-GP-N0S的根癌土壤桿菌CECT70M轉(zhuǎn)化所述野生型植物達(dá)到的。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述高質(zhì)體GP活性是通過(guò)利用包含質(zhì)粒pBIN20-B33-ClP-GP-N0S的根癌土壤桿菌CECT7055轉(zhuǎn)化所述野生型植物達(dá)到的。
9.表達(dá)載體根癌土壤桿菌CECT7054，其特征在于包含質(zhì)粒pBIN2035S-GP-N0S。
10.表達(dá)載體根癌土壤桿菌CECT7055,其特征在于包含質(zhì)粒 PBIN20-B33-C1P-GP-N0S。
11.一種細(xì)胞，其被權(quán)利要求9或10所述的載體轉(zhuǎn)化或感染。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是細(xì)菌或植物細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的大腸桿菌CECT7071細(xì)菌細(xì)胞，其特征在于，被質(zhì)粒 pET15b-glgP轉(zhuǎn)化并且表達(dá)編碼所述重組GP蛋白質(zhì)的基因。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述植物細(xì)胞被包含質(zhì)粒pBIN2035S-GP-N0S的根癌土壤桿菌CECT 7054轉(zhuǎn)化或者感染，或者被包含質(zhì)粒 PBIN20-B33-C1P-GP-N0S的根癌土壤桿菌CECT7055轉(zhuǎn)化或者感染。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述植物細(xì)胞屬于下列植物物種 馬鈴薯(Solanum tuberosum)、煙草(Nicotiana tabacum)、水稻 (Oryza sativa)、玉米(Zea mays)禾口擬南芥(Arabidopsis thaliana)。
16.權(quán)利要求13所述的細(xì)胞用于產(chǎn)生活性重組GP蛋白質(zhì)的用途。
17.權(quán)利要求13所述的細(xì)胞用于產(chǎn)生針對(duì)GP的特異性抗體的用途。
18.權(quán)利要求11、12、14和/或15所述的細(xì)胞用于生產(chǎn)淀粉的用途。
19.一種轉(zhuǎn)基因植物，其被權(quán)利要求9或10所述的載體轉(zhuǎn)化，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物與野生型植物相比在細(xì)胞質(zhì)水平上和在質(zhì)體水平上均具有高GP活性，因而具有高淀粉含量和產(chǎn)量以及高直鏈淀粉/支鏈淀粉比例。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物的GP活性是未轉(zhuǎn)化的野生型植物的GP活性的至少5倍。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物的淀粉含量比未轉(zhuǎn)化的野生型植物的淀粉含量高至少20%。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物的直鏈淀粉含量數(shù)值比未轉(zhuǎn)化的野生型植物的直鏈淀粉含量數(shù)值高至少10%。
23.根據(jù)權(quán)利要求19-22任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)基因glgP(SEQ ID NO 3)并且編碼具有高GP活性的蛋白質(zhì)。
24.根據(jù)權(quán)利要求19-23任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其選自包括下列的組馬鈴薯 (Solanum tuberosum)、煙草(Nicotiana tabacum)、水禾§ (Oryza sativa)、玉米(Zea mays) 或擬南芥(Arabidopsis thaliana)。
25.根據(jù)權(quán)利要求19-24的轉(zhuǎn)基因植物用于生產(chǎn)淀粉的用途。
26.針對(duì)GP的多克隆或單克隆抗體。
27.權(quán)利要求沈的所述的多克隆或單克隆抗體用于測(cè)量樣品中所存在GP濃度的用途。
全文摘要
一種用于產(chǎn)生具有高淀粉含量和產(chǎn)量以及高直鏈淀粉/支鏈淀粉比例的轉(zhuǎn)基因植物的方法。α-1，4-糖原磷酸酶(GP)催化多聚葡聚糖例如淀粉、麥芽糖糊精和糖原非還原性末端的α-1，4鍵的可逆切割，導(dǎo)致生成葡萄糖-1-磷酸(G1P)。細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞中的GP負(fù)責(zé)降解糖原。盡管GP活性的提高導(dǎo)致細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞中糖原的細(xì)胞內(nèi)水平的降低，但是本發(fā)明公開(kāi)了通過(guò)表達(dá)編碼GP的基因，產(chǎn)生了具有高淀粉水平和產(chǎn)量以及高直鏈淀粉/支鏈淀粉比例的植物。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102165065SQ200980135998
公開(kāi)日2011年8月24日 申請(qǐng)日期2009年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日
發(fā)明者弗朗西斯科·何塞·穆尼奧斯·佩雷斯, 弗朗西斯科·哈維爾·普澤塔·羅梅羅, 米任·埃頓·巴羅加·費(fèi)爾南德斯, 諾拉·阿隆索·卡塞耶斯 申請(qǐng)人:艾登生物技術(shù)有限公司