Brca1基因突變檢測特異性引物和液相芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種BRCA1基因突變檢測液相芯片和特異性引物，該液相芯片主要包括有：每種由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列為：針對A926G位點的SEQ?ID?NO.13及SEQ?ID?NO.14，針對C2077T位點的SEQID?NO.15及SEQ?ID?NO.16，針對A1525G位點的SEQ?ID?NO.17及SEQ?ID?NO.18，針對G53675A位點的SEQ?ID?NO.19及SEQ?ID?NO.20，針對C36048T位點的SEQ?ID?NO.21及SEQ?ID?NO.22，和/或針對C2612T位點的SEQ?ID?NO.23及SEQ?ID?NO.24；有不同anti-tag序列包被的微球；擴(kuò)增引物。本發(fā)明所提供的檢測液相芯片的檢測結(jié)果與測序法的吻合率高達(dá)100％，實現(xiàn)多個突變位點的野生型和突變型并行檢測。
【專利說明】BRCA1基因突變檢測特異性引物和液相芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種BRCAl基因突變檢測特異性引物和液相芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]BRCAl 基因稱為乳腺癌 I (breast cancer I, early onset, BRCA I)，定位于 17 號染色體17q21長臂上，約100個kb，內(nèi)含高達(dá)41.5%的Alu重復(fù)序列和4.8%的其它重復(fù)序列。含有24個外顯子，其中22個轉(zhuǎn)錄出716kb mRNA，最終可編碼含1863個氨基酸的蛋白質(zhì)。第11個外顯子較大，長314kb，占整個編碼區(qū)的61 %。BRCAl編碼蛋白的N末端序列含有一環(huán)狀結(jié)構(gòu)域(ring domain),能夠與BRCAl相關(guān)環(huán)狀蛋白(BRCA12associated ringdomainprotein, BARD1)組成環(huán)2環(huán)異二聚體,一般認(rèn)為BRCAl的N末端在調(diào)節(jié)RNA合成酶功能方面起著重要作用。BRCAl基因是腫瘤抑制基因家族中的一員。與其它腫瘤抑制基因一樣，BRCAl能防止細(xì)胞過快或者失去控制地生長和分化。通過對受損的蛋白質(zhì)進(jìn)行修復(fù)，BRCAl蛋白質(zhì)在保持DNA處于良好工作狀態(tài)中發(fā)揮了重要的作用。野生型BRCAl編碼蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著重要作用。但是當(dāng)BRCAl發(fā)生突變時，上述功能不但都會喪失，同時突變的BRCAl還可能通過阻斷野生型BRCAl的正常生理功能而大大增加患腫瘤的可能性。研究表明，BRCAl作為抑癌基因，其突變與高乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌的發(fā)病率有關(guān)。
[0003]目前，BRCAl基因突變檢測方法主要有:熒光定量PCR技術(shù)，PCR-RFLP技術(shù)，直接測序法，熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、自動化程度高的特點，但也存在樣品易污染、假陽性率高的缺點，且每次只能檢測一種突變類型。PCR-RFLP法是基于基因突變造成的限制性內(nèi)切酶識別位點的改變，如位點丟失或產(chǎn)生新位點，通過PCR擴(kuò)增某一特定片段，再用限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳觀察片段的大小，這種方法用于檢測酶切位點改變的基因突變，可直接判斷基因型，但該法不能用于沒有產(chǎn)生新酶切位點的基因突變檢測。而直接測序法兩端靠近引物的序列容易測不準(zhǔn)，測序方法成本高、操作復(fù)雜，對于那些突變比例低于15%~20%的標(biāo)本，如果用測序的方法進(jìn)行檢測，很難發(fā)現(xiàn)突變，因此這些檢測方法都難以滿足實際應(yīng)用的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是提供BRCAl基因突變檢測液相芯片，該液相芯片可用于單獨或并行檢測 BRCAl 基因六種常見基因型 A926G、C2077T、A1525G、G53675A、C36048T 和 C2612T
的野生型和突變型。
[0005]實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0006]一種BRCAl基因突變檢測液相芯片，包括有:
[0007](A).針對BRCAl基因不同突變位點分別設(shè)計的野生型和突變型的ASPE引物對:每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對A926G位點的SEQ ID N0.13及SEQ ID N0.14，針對C2077T位點的 SEQ IDN0.15 及 SEQ ID N0.16，針對 A1525G 位點的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，針對 G53675A 位點的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20，針對 C36048T 位點的 SEQ ID N0.21及 SEQ ID N0.22，和 / 或針對 C2612T 位點的 SEQ ID N0.23 及 SEQ ID N0.24 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 ~SEQ IDN0.12 ；
[0008](B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.25~SEQ IDN0.36,且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補配對；
[0009](C).用于擴(kuò)增出需要檢測的、具有相應(yīng)突變位點的目標(biāo)序列的引物。
[0010]在其中一個實施例中，所述擴(kuò)增引物為:針對A926G位點的SEQ ID N0.37及SEQID N0.38，針對 C2077T 位點的 SEQ ID N0.39 及 SEQ ID N0.40，針對 A1525G 位點的 SEQ IDN0.41 及 SEQ IDN0.42，針對 G53675A 位點的 SEQ ID N0.43 及 SEQ ID N0.44，針對 C36048T位點的 SEQ ID N0.45 及 SEQ ID N0.46，和 / 或針對 C2612T 位點的 SEQ ID N0.47 及 SEQ IDN0.48。
[0011]在其中一個實施例中，所述ASPE引物對為:針對A926G位點的由SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.13組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.14組成的序列，針對C2077T位點的由SEQ IDN0.3和SEQ ID N0.15組成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.16組成的序列，針對A1525G位點的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.17組成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.18組成的序列，針對G53675A位點的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.19組成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ IDN0.20組成的序列，針對C36048T位點的由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.21組成的序列及由SEQ IDN0.10和SEQ ID N0.22組成的序列，和/或針對C2612T 位點的由 SEQ ID N0.11 和 SEQ ID N0.23 組成的序列及由 SEQ ID N0.12 和 SEQ IDN0.24組成的序列。`
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供用于BRCAl基因突變檢測的特異性引物。
[0013]實現(xiàn)該目的的技術(shù)方案如下。
[0014]用于BRCAl基因突變檢測的特異性引物，所述特異性引物為針對A926G位點的SEQ IDN0.13 及 SEQ ID N0.14，針對 C2077T 位點的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，針對A1525G 位點的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，針對 G53675A 位點的 SEQ ID N0.19 及 SEQID N0.20，針對 C36048T 位點的 SEQ ID N0.21 及 SEQ ID N0.22，和 / 或針對 C2612T 位點的SEQ ID N0.23 及 SEQID N0.24。
[0015]本發(fā)明的主要優(yōu)點在于:
[0016]1.本發(fā)明所提供的BRCAl基因突變檢測液相芯片的檢測結(jié)果與測序法的吻合率高達(dá)100%，且檢測所需要的時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測序技術(shù)，特別符合實際應(yīng)用需要。所制備的BRCAl基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設(shè)計的探針以及ant1-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)，tag標(biāo)簽序列、ant1-tag標(biāo)簽序列的選取以及tag標(biāo)簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免交叉反應(yīng)，實現(xiàn)多個突變位點的并行檢測。
[0017]2.本發(fā)明通過發(fā)明人長期積累的設(shè)計經(jīng)驗和大量的實驗操作，從眾多的特異性引物中選取了最優(yōu)的組合。本發(fā)明設(shè)計的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識別目標(biāo)檢測的突變位點，準(zhǔn)確區(qū)分各種型別的基因型；在同一個反應(yīng)體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標(biāo)檢測的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之間基本上不存在交叉反應(yīng)，檢測特異性好，交叉反應(yīng)率低于3% ;除了能夠檢測單個位點突變情況，也能夠同時并行檢測多個突變位點的突變情況，檢測效果一致。
[0018]3.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，6種突變位點檢測可通過一步PCR即可完成6條含有突變位點的目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的同時定性、定量分析特征。
[0019]4.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，同時對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備微球能適用于不同的檢測項目，具有很強(qiáng)的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進(jìn)一步得到提高，信噪比增強(qiáng)，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
【具體實施方式】
[0020]實施例1BRCAl基因突變檢測液相芯片，主要包括有:
[0021]一、ASPE 引物
[0022]針對BRCAl 基因六種常見基因型 A926G、C2077T、A1525G、G53675A、C36048T 和C2612T的野生型和突變型，分別設(shè)計特異性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示:
[0023]表1BRCAl基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特異性引物序列)
[0024]
【權(quán)利要求】
1.一種BRCAl基因突變檢測液相芯片，其特征是，包括有: (A).針對BRCAl基因不同突變位點分別設(shè)計的野生型和突變型的ASPE引物對:每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對A926G位點的SEQ ID N0.13及SEQ ID N0.14，針對C2077T位點的SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，針對 A1525G 位點的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，針對G53675A 位點的 SEQ IDN0.19 及 SEQ ID N0.20，針對 C36048T 位點的 SEQ ID N0.21 及 SEQID N0.22，和/或針對C2612T位點的SEQ ID N0.23及SEQ ID N0.24 ;所述tag序列選自SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.12 ； (B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.25~SEQ ID N0.36，且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補配對； (C).用于擴(kuò)增出需要檢測的、具有相應(yīng)突變位點的目標(biāo)序列的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的BRCAl基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述擴(kuò)增引物為:針對 A926G 位點的 SEQ ID N0.37 及 SEQ ID N0.38，針對 C2077T 位點的 SEQ ID N0.39 及SEQ IDN0.40，針對A1525G位點的 SEQ ID N0.41 及 SEQ ID N0.42，針對G53675A位點的 SEQID N0.43 及 SEQ ID N0.44，針對 C36048T 位點的 SEQ ID N0.45 及 SEQ ID N0.46，和 / 或針對 C2612T 位點的 SEQ ID N0.47 及 SEQ ID N0.48。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的BRCAl基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述ASPE引物對為:針對A926G位點的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.13組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.14組成的序列，針對C2077T位點的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.15組成的序列及由SEQ IDN0.4和SEQ ID N0.16組成的序列，針對A1525G位點的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.17組成的序列及`由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.18組成的序列，針對G53675A位點的由SEQ ID N0.7和SEQID N0.19組成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.20組成的序列，針對C36048T位點的由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.21組成的序列及由SEQ IDN0.10和SEQ ID N0.22組成的序列，和/或針對C2612T位點的由SEQ ID N0.11和SEQ IDN0.23組成的序列及由SEQ ID N0.12和SEQ IDN0.24組成的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的BRCAl基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂為5-10 個 T0
5.用于BRCAl基因突變檢測的特異性引物，其特征是，所述特異性引物為針對A926G位點的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，針對 C2077T 位點的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，針對 A1525G位點的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，針對 G53675A 位點的 SEQ ID N0.19 及SEQ ID N0.20，針對 C36048T 位點的 SEQ ID N0.21 及 SEQ ID N0.22，和 / 或針對 C2612T 位點的 SEQ ID N0.23 及 SEQ ID N0.24。
【文檔編號】C12Q1/68GK103865985SQ201210545608
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月14日
【發(fā)明者】吳詩揚, 鄒鳳文 申請人:益善生物技術(shù)股份有限公司