專利名稱：通過4輪連續(xù)pcr或阻斷pcr或其全基因合成的方法進(jìn)行的含有基因特異的條形碼的粟酒 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉 及系統(tǒng)地制備基因靶向的雜合缺失突變粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)菌株的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過用缺失盒(deletion cassette)轉(zhuǎn)化粟酒裂殖酵母制備基因靶向的雜合缺失粟酒裂殖酵母的方法，該缺失盒由4 輪連續(xù)PCR、阻斷PCR或全基因合成構(gòu)建，含有同源重組位點(diǎn)。同時，本發(fā)明涉及由該 方法制備的基因靶向的雜合缺失粟酒裂殖酵母突變體，和基因靶向的雜合缺失粟酒裂殖 酵母突變體的文庫。此外，本發(fā)明與用于在文庫中篩選藥物作用方式的方法和試劑盒有 關(guān)。
背景技術(shù)：
在2006年，據(jù)報道全世界的藥物市場價值為6430億美元，韓國藥物產(chǎn)品占該總 額中的11,4728億韓元份額。全球藥物市場預(yù)期在2007年增加到7350 7450億美元。 據(jù)報道將新藥帶進(jìn)市場需要1 6億美元的平均成本，10至15年的開發(fā)期。盡管這樣巨 大的時間和金錢的花費(fèi)，但是據(jù)報道新藥開發(fā)的成功率低，為萬分之一。因此，新藥的 成功開發(fā)必須應(yīng)該從許多可能的作用方式中定義高度假定的在疾病的發(fā)生和治療中起關(guān) 鍵作用的“藥物的作用方式”；這通常是通過從復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中提取生物相關(guān)性的智 能生物信息學(xué)工具完成的。由此，系統(tǒng)地篩選直接涉及許多疾病的特異作用方式非常重 要。就這一點(diǎn)而論，篩選技術(shù)在鑒別藥物發(fā)揮其治療作用的靶標(biāo)中是有用的，因此 非常有助于減少藥物開發(fā)需要的時限。同時，篩選技術(shù)允許與藥物的副作用相關(guān)的作用 方式的鑒別。因此，急需篩選藥物作用方式的新穎的方法。粟酒裂殖酵母是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中有用的裂殖酵母，它與芽殖酵母—— 釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在進(jìn)化上不具有高度相關(guān)性，盡管它們都屬于子囊 菌粟酒裂殖酵母(ascomycetes S.pombe) (Wood V.et al.，Nature.45 871-880，2002)， 在釀酒酵母以后被標(biāo)記為第六模式真核生物，其基因組已被完全測序(Goffeau A.etal.， Science, 274 546-567，1996)。根據(jù)分析，在迄今其基因組已被測定的真核細(xì)胞中， 粟酒裂殖酵母具有有效的基因組結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有最低的基因功能重復(fù)。還據(jù)報道粟酒 裂殖酵母含有4,824個蛋白編碼基因，這是已被鑒定的真核生物的最小數(shù)目，但是約43% 的基因含有內(nèi)含子。同時，發(fā)現(xiàn)粟酒裂殖酵母具有對包括細(xì)胞周期控制、蛋白水解、蛋 白磷酸化和RNA剪接需要的那些細(xì)胞構(gòu)造在內(nèi)的真核細(xì)胞構(gòu)造重要的高度保守基因。此 夕卜，粟酒裂殖酵母的基因的31%被鑒定為與釀酒酵母的基因不同，而與人類同源。因 此，粟酒裂殖酵母和釀酒酵母之間的遺傳功能的比較正顯現(xiàn)為研究人類基因功能的有效 方法學(xué)。術(shù)語“基因打靶(基因?qū)ぐ?，，如本文所用以在藥物作用方式的篩選中轉(zhuǎn)化酵母菌株，意欲指使用同源重組來改變內(nèi)源基因一諸如通過破壞基因(敲除)或通過導(dǎo)入基 因一的遺傳技術(shù)。已使?fàn)可嫣禺惣膊〉幕驈钠渲腥コ驅(qū)肫渲械霓D(zhuǎn)基因小鼠具有 其觀察到的病理學(xué)，因此允許在功能上鑒別敲除基因。由于1989年轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生，基因打靶已產(chǎn)生了巨大的技術(shù)進(jìn)步。例如，靶 基因能在特定的發(fā)育階段被導(dǎo)入或?qū)氲揭呀?jīng)長大的成體。同時，可能設(shè)計(jì)在發(fā)育過程 中的特定時間表達(dá)的突變基因。Martin J.Evans、Oliver Smithies和Mario R.Capecchi因他 們在基因打靶方面的工作而被宣布成為2007年生理學(xué)和醫(yī)學(xué)諾貝爾獎獲得者。
PCR(聚合酶鏈反應(yīng))是用于復(fù)制和擴(kuò)增DNA的分子生物學(xué)技術(shù)(美國專 利號 4,683,195、4,683,202 和 4,800,159 ；歐洲專利號 0200362、0201184 和 0229701 ； Methods in Enzymology, Volume 155, 1987, pp.335-350, Murakawa et al.，DNA 7 ； 287-295(1988))。這個技術(shù)典型地由30至40個變性、退火和延伸的循環(huán)組成，并允許感 興趣的基因區(qū)段選擇性地擴(kuò)增，甚至從DNA庫中的痕量擴(kuò)增。現(xiàn)在，已發(fā)展了基本PCR 技術(shù)的變化，包括多重PCR、巢式PCR、定量PCR、實(shí)時PCR、逆轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)、遞 降PCR等。實(shí)時PCR是建立的用于DNA定量的工具，因?yàn)闊晒馓结樑c引物一起使用，基于 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增期間按比例產(chǎn)生的熒光信號的檢測，它測量每輪PCR擴(kuò)增之后DNA產(chǎn)物的 積累。實(shí)時PCR能快速并方便地獲得PCR結(jié)果，因?yàn)樗恍枰娪緶y定。同時，實(shí)時 PCR具有污染風(fēng)險低的優(yōu)勢。由于這些理由，實(shí)時PCR作為典型PCR的替代享有廣泛 的使用。轉(zhuǎn)化是緣于外源DNA的攝取、基因組整合和表達(dá)的細(xì)胞遺傳變化。實(shí)際上， 用選擇性標(biāo)記來標(biāo)記外源DNA以容易地選擇外源DNA已被成功導(dǎo)入的細(xì)胞。選擇性標(biāo) 記的典型例子包括氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因和卡那霉素抗性基因。轉(zhuǎn)化之 后，在相關(guān)抗生素存在下的培養(yǎng)允許成功轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的選擇。在本發(fā)明中，通過將抗生 素抗性基因?qū)氲较鄳?yīng)的同源重組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)化來敲除裂殖酵母中的特定基因?；蚝铣墒枪夹g(shù)，自從20世紀(jì)90年代早期基于PCR的寡聚體連接的發(fā)展 后，已發(fā)表了約200篇關(guān)于基因合成的文章(Edgeet al.，Nature.292 756-62、Roufflardet al., NAR.32 176—80、Smithetal., NAR. 10 4467—82、Dillon etal.，Biotechniques.9 298-300、Ciccarelli et al.，Nucleic Acid Research.21 6007-13、Prodromou et al., ProteinEngineering. 5 827-29、Stemmer et al.，Gene. 164 49-53、Lin etal.，Gene.288 85-94、Venter et al., Proceedings National Academy of Science. 100 15440-45)。原則 上，將20bp至60bp長的寡核苷酸退火并相互連接以產(chǎn)生雙鏈DNA片段，該片段然后被 用作通過PCR的期望DNA擴(kuò)增的模板?？梢酝ㄟ^基因合成獲得的DNA片段通常小于 l,000bp。對于較長的基因，通過PCR連接獲得的小于IOOObp的DNA片段。在2003 年，Craig Venter博士以這樣的方式成功地建立φΧ174噬菌體(phiX174噬菌體)全部的 5,386-bp基因組。關(guān)于藥物作用方式的篩選，最廣泛使用的是體外的方法。例如，將細(xì)胞蛋 白的混合物通過具有藥物附著的樹脂的親和柱，純化因此結(jié)合到藥物上的蛋白并用 MALDI-TOF 分析(Schreiber et al.，Bioorg.Med.Chem.6 1127-1152)?？蛇x的是將人 類蛋白質(zhì)噬菌體文庫通過含有藥物附著的樹脂的親和柱，在該文庫中人類蛋白質(zhì)表達(dá)在膜上，接下來選擇和分析結(jié)合到藥物的噬菌體以推論藥物的靶蛋白(Scheetal.，Chem. Biol.6 707-716)。最近，已經(jīng)對與上面的兩種方法完全不同的體內(nèi)篩選方法進(jìn)行了嘗試(Lutnet alCell.116 121-37)。盡管與篩選人類蛋白的體外方法相比，這種方法因?yàn)楹Y選酵母蛋 白是不利的，但是它具有快速(100個藥物/周)、方便和高成功率的優(yōu)點(diǎn)。在2004年， Merck的Shoemaker和Lum博士的研究小組篩選了針對80個預(yù)先存在藥物的作用方式， 成功率從25%增加到70%。被稱作藥物誘導(dǎo)的單倍性不足的篩選策略是基于降低藥物靶 標(biāo)的基因劑量增加對藥物的敏感性的事實(shí)。在大多數(shù)情況下，一個等位基因足以允許細(xì) 胞正常地工作，但是當(dāng)正常的表型需要兩個等位基因的蛋白產(chǎn)物時，50%的基因功能的 重建導(dǎo)致異常的表型，這被稱作單倍性不足。據(jù)報道，芽殖酵母的180個基因，相當(dāng)于 約6,000個基因的3%，牽涉單倍性不足，因此與野生型相比，突變體甚至在充足的營養(yǎng) 培養(yǎng)基中生長差(Deutschbauer etal.，Genetics. 169 1915-25)。這種單倍性不足是在雜 合突變體酵母菌株中篩選藥物作用方式的基礎(chǔ)。例如，假定藥物‘a(chǎn)’靶向蛋白‘A’， IC5tl劑量的藥物‘a(chǎn)’的治療導(dǎo)致在基因靶向的雜合菌株中蛋白‘A’的100%抑制(擊 倒)，IC5tl是抑制蛋白‘A’ 一半的濃度。相應(yīng)地，藥物治療的菌株以比未治療的菌株 低的速度生長。根據(jù)本發(fā)明，提供在單倍性不足的基礎(chǔ)上篩選藥物作用方式的方法。構(gòu)建基因靶向菌株的成功依賴菌株的性質(zhì)，因?yàn)樗赏粗亟M效率決定，一個 菌株與另一個菌株的同源重組效率不同。然而，在相同的菌株中同源重組效率與基因組 同源位點(diǎn)的長度成比例。因此，對應(yīng)于基因組同源位點(diǎn)的較長DNA片段允許基因靶向 的菌株以更有效的速度構(gòu)建。被概述在下面表1中的試驗(yàn)已在芽殖酵母上進(jìn)行，但是在 裂殖酵母上沒有這樣高成功率的先例(Palaniyandi et al.，Nud Acid Res.3 2799-2800 ； Michael etal., Gene. 158 113-17 ； Kauretal, NudAddRes.25 1080-81)。表 權(quán)利要求
1.構(gòu)建基因靶向的雜合裂殖酵母突變體的方法，包括將用于基因打靶的缺失盒導(dǎo)入 到裂殖酵母菌株中，所述缺失盒包括選擇性標(biāo)記基因；用于微點(diǎn)陣的、分別定位于所述 選擇性標(biāo)記基因兩側(cè)的一對基因特異的條形碼堿基序列；和被分別分配到定位在所述選 擇性標(biāo)記基因的上游和下游的所述條形碼堿基序列側(cè)面的一對同源重組區(qū)，其中每個同 源重組區(qū)的長度大于150bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述每個同源重組區(qū)的長度范圍是150bp至 450bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述每個同源重組區(qū)的長度范圍是250bp至 450bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述缺失盒是通過四輪連續(xù)PCR、阻斷PCR或 基因合成構(gòu)建的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述每個條形碼堿基序列的長度范圍是20至 30bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述條形碼堿基序列選自圖7至55顯示的堿基 序列，所述條形碼堿基序列中的兩個被分別分配在所述選擇性標(biāo)記基因的上游和下游。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述選擇性標(biāo)記基因是卡那霉素抗性基因。
8.被缺失盒轉(zhuǎn)化的、基因靶向的雜合裂殖酵母菌株，所述缺失盒包括選擇性標(biāo)記基 因；用于微點(diǎn)陣的、分別定位于所述選擇性標(biāo)記基因兩側(cè)的一對基因特異的條形碼堿基 序列；和被分配到各自的條形碼堿基序列側(cè)面的一對同源重組區(qū)，所述條形碼堿基序列 選自圖7至55顯示的堿基序列，其中兩個被分別分配在所述選擇性標(biāo)記基因的上游和下 游。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基因靶向的雜合裂殖酵母菌株，其中所述選擇性標(biāo)記基因是 卡那霉素抗性基因。
10.將缺失盒導(dǎo)入到裂殖酵母每個基因的基因靶向的雜合裂殖酵母突變體文庫，其中 所述缺失盒包括選擇性標(biāo)記基因和分別定位于裂殖酵母每個基因的所述選擇性標(biāo)記基因 兩側(cè)的一對基因特異的條形碼堿基序列，所述基因特異的條形碼堿基序列選自圖7至55 顯示的堿基序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的基因靶向的雜合裂殖酵母突變體文庫，其中所述選擇性標(biāo) 記基因是卡那霉素抗性基因。
12.篩選藥物作用方式的方法，包括1)用化學(xué)藥品處理權(quán)利要求10或11所述的基因靶向的雜合裂殖酵母突變體文庫；2)培養(yǎng)所述化學(xué)處理的裂殖酵母突變體文庫；3)從所述培養(yǎng)的文庫中分離基因組DNA;和4)利用施加到微點(diǎn)陣基因芯片上的所述分離的基因組DNA測量和分析所述突變體的 生長速度，以檢測相對生長被抑制的菌株。
13.篩選藥物作用方式的方法，包括1)用化學(xué)藥品處理權(quán)利要求10或11所述的基因靶向的雜合裂殖酵母突變體文庫；2)培養(yǎng)所述化學(xué)處理的裂殖酵母突變體文庫；3)從所述培養(yǎng)的文庫中分離基因組DNA;和4)利用所述分離的基因組DNA通過定量實(shí)時PCR測量和分析所述突變體的生長速 度，以檢測相對生長被抑制的菌株。
14.用于藥物作用方式的篩選試劑盒，包括權(quán)利要求10所述的基因靶向的雜合裂殖酵 母突變體文庫。
全文摘要
提供用于制備基因靶向的雜合缺失粟酒裂殖酵母的方法，包括用缺失盒轉(zhuǎn)化粟酒裂殖酵母，該缺失盒由4輪連續(xù)PCR、阻斷PCR或全基因合成構(gòu)建，含有同源重組位點(diǎn)。還提供了由該方法制備的基因靶向的雜合缺失粟酒裂殖酵母突變體，和基因靶向的雜合缺失粟酒裂殖酵母突變體文庫。此外，該文庫在構(gòu)建用于篩選藥物作用方式的方法和試劑盒中有用。
文檔編號C12N15/00GK102016022SQ200880128751
公開日2011年4月13日 申請日期2008年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月22日
發(fā)明者俞香淑, 元美善, 南美英, 崔信正, 張榮珠, 樸助英, 樸翰浯, 李惠美, 李慜鎬, 白昇泰, 許京善, 許光來, 鄭璟淑, 金東旭, 金東燮, 金炯培, 韓尚助 申請人:韓國生命工學(xué)研究院