專利名稱：T.fusca海藻糖合成酶基因及海藻糖制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海藻糖酶基因，特別是利用生物技術(shù)獲得的酶及其用于制造海藻糖的方法。
背景技術(shù)：
海藻糖，更確切地說是α，α-1，1-海藻糖是由兩分子葡萄糖以α，α-1，1-糖苷鍵相連而成。海藻糖是一種天然性二糖，廣泛地存在于微生物、蝦類、釀酒酵母、蘑菇及各種真菌、昆蟲、植物等。但含量甚微。過去主要是從干酵母中提取。由于含量低，提取過程較復(fù)雜，成本極高。如此昂貴的海藻糖只能局限于某些特殊領(lǐng)域如醫(yī)學(xué)生物制品的活性保持的應(yīng)用。隨著人類社會(huì)的發(fā)展和進(jìn)步，要求將海藻糖應(yīng)用于各類食品的鮮味保持與質(zhì)地改善的趨勢越來越明顯，因此必須要盡快地找到廉價(jià)而高效的海藻糖制造方法。
株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所在中國專利CN1106065A(1995年)中講述了一種海藻糖制造方法。該法從Pimelobacter、Psceudomonas和Thermus三種菌屬中分離純化了海藻糖合成酶(TRES)，該酶能夠以麥芽糖為原料制成海藻糖。這為廉價(jià)制造適合應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)等需量大的領(lǐng)域的低價(jià)位海藻糖產(chǎn)品提供了極大的可能性。1996年，株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所的K.Tsusaki等人披露了克隆自Pimelobacter sp R48和Thermus aquaticus的海藻糖合成酶基因的DNA(脫氧核糖酸)序列及其構(gòu)成該酶的氨基酸序列(K.Tsusaki，etal.1996，Biochim.Biophys，Acta，12901-3；K.Tsusaki，etal.1997，Biochim.Biophys.Acta，133428-32)。2000年，De Smet等人通過生物信息學(xué)的方法從測序完成的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis CDC1551)的基因組中分離，鑒定了海藻糖合成酶基因(K、A、L、De Smet etal.2000，Microbiology，146199-208)。發(fā)現(xiàn)它與來自Pimerlobacter sp R48的TRES在組成該酶的氨基酸序列有70％的同源性，而DNA水平上的同源性為69％，分離自Thermus aquaticus(水棲嗜熱菌)的TRES是一種大分子酶蛋白，由963個(gè)氨基酸的單鍵多肽組成。Thermus aquaticus的與Pimerlobacter sp R48的TRES的氨基酸序列的同源性是55％，而DNA的同源性是36.4％。來自Thermus caldophilus GK24的TRES與Thermus aquaticus的非常相似。它由965個(gè)氨基酸組成，兩者的氨基酸同源性為99％，DNA的同源性為98.9％，很可能是在進(jìn)化進(jìn)程中基因平移(genelateral transfer)造成的結(jié)果。
另外，通過檢索，還查到有關(guān)海藻糖合成酶的一些科技文獻(xiàn)1、中國專利<申請?zhí)?amp;gt;99816517<<發(fā)明名稱>海藻糖合酶蛋白質(zhì)、基因、質(zhì)粒、微生物和生產(chǎn)海藻糖的方法<申請人>第一制糖株式會(huì)社，韓國漢城<文摘>本發(fā)明涉及生產(chǎn)海藻糖的微生物和生產(chǎn)海藻糖的方法。本發(fā)明還涉及新的海藻糖合酶蛋白質(zhì)、海藻糖合酶基因、攜帶所述海藻糖合酶基因的重組質(zhì)粒以及用所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的微生物。
2、中國專利<申請?zhí)?amp;gt;01100417<發(fā)明名稱>海藻糖基水解酶及其制備和用途<申請人>中國科學(xué)院微生物研究所，北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號<文摘>本發(fā)明公開了一種新型嗜酸耐熱海藻糖基水解酶及其制備和用途，該酶可以從埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、酵母屬的微生物中獲得，能夠在高溫酸性條件下高效水解具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為一個(gè)末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵。該酶分子量約55000到65000道爾頓；等電點(diǎn)約為5.5到6.6。該酶很容易通過微生物發(fā)酵大量制備，并用于工業(yè)化制備海藻糖。該海藻糖可廣泛地用于食品、化妝品和藥品組合物中。
3、中國專利<申請?zhí)?amp;gt;01123521<發(fā)明名稱>新型嗜酸耐熱海藻糖基合成酶及其制備和用途<申請人>吳襟，北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號<文摘>本文公開了一種新型嗜酸耐熱海藻糖基合成酶及其制備和用途，該酶從埃希氏菌屬、酵母屬的微生物中獲得，能夠在高溫酸性條件下不需海藻糖為底物，而利用還原性淀粉部分水解物，高效合成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖。該酶分子量約75000到85000道爾頓；等電點(diǎn)約為6.2到7.2。該酶很容易通過微生物發(fā)酵大量制備，并用于工業(yè)化制備非還原性淀粉糖和海藻糖。該非還原性淀粉糖和海藻糖可廣泛地用于食品、化妝品和藥品組合物中。
4、透性化細(xì)胞海藻糖合酶特性的研究作者薛璐馬鶯機(jī)構(gòu)哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與工程系，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，刊名食品科學(xué).2003，24(3).關(guān)鍵詞海藻糖 透性化細(xì)胞海藻糖合酶 酶學(xué)特性文摘海藻糖是一種新型食品添加劑，目前多以微生物酶法生產(chǎn)。海藻糖合酶是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種海藻糖合成酶。本文研究了經(jīng)滲透細(xì)胞技術(shù)處理得到的透性化細(xì)胞海藻糖合酶的酶學(xué)特性。結(jié)果表明，該細(xì)胞酶的反應(yīng)最適溫度為35℃，最適pH7.4，Mg^2+及K^+對該細(xì)胞酶有明顯激活作用，Zn^2+，Mn^2+及Cu^2+則可強(qiáng)烈地抑制酶活力。該酶對底物特異性極強(qiáng)，能特異性地將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖。
5、海藻糖微生物酶法合成機(jī)制的研究作者王紹校 吳襟 高春霄 陳萌 蔡同一 張樹政機(jī)構(gòu)中國科學(xué)院微生物研究所，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院刊名微生物學(xué)通報(bào).2003，30(2).關(guān)鍵詞海藻糖 麥芽寡糖基海藻糖合酶 麥芽寡糖基海藻糖海藻基水解酶 淀粉 微生物酶法合成 二糖文摘來源于嗜酸熱古菌芝田硫化葉菌(Sulfolobus shibatae)B12的麥芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶(MTHase)基因在大腸桿菌中獲得表達(dá)。將獲得純化的兩個(gè)酶，分別以麥芽寡糖和淀粉為轉(zhuǎn)化底物，在pH5.5，60℃條件下合成海藻糖。從反應(yīng)產(chǎn)物分析結(jié)果可知，兩個(gè)酶合成海藻糖時(shí)能利用的最小底物是麥芽四糖，海藻糖產(chǎn)率與麥芽寡糖鏈長正相關(guān)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)兩個(gè)酶都具有輕微的□-1，4-葡萄糖苷酶活性，能在麥芽寡糖還原末端水解□-1，4糖苷鍵，生成葡萄糖分子，其反應(yīng)最小底物分別是麥芽三糖和四糖。推測海藻糖合成酶可能有兩個(gè)不同的催化活性中心。
6、釀酒酵母海藻糖合成酶基因的克隆和在大腸村菌中的表達(dá)作者楊波 戴秀玉等機(jī)構(gòu)中國科學(xué)院微生物研究所，刊名遺傳學(xué)報(bào).2001，28(4).關(guān)鍵詞TPS1基因 海藻糖 PCR克隆 表達(dá) 釀酒酵母 海藻糖合成酶文摘用PCR方法克隆了1.5kb的釀酒母Sacchromycescerevisiae海藻糖合成酶基因TPSI，將該片段連接到pUC19載體，通過轉(zhuǎn)化分別引入海藻糖合成酶基因缺失和缺陷的大腸桿菌Escherichia coli FF4169和FF4050，對轉(zhuǎn)化株的質(zhì)粒DNA酶切分析表明均含有1.5kb PCR克隆片段，生長曲線實(shí)驗(yàn)證明，帶有克隆片段的轉(zhuǎn)化株在含0.5mol/L NaCl的高滲透壓基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長良好；用高效液相色譜(HPLC)結(jié)合蒸發(fā)散射(ELSD)技術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)海藻糖實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)化株能夠合成海藻糖。
7、HPLC/RI與HPLC/ESI-MS方法研究細(xì)菌D-97酶合成海藻糖的過程作者榮紹豐 戴軍等機(jī)構(gòu)江南大學(xué)生物工程學(xué)院，中國發(fā)酵工業(yè)協(xié)會(huì)功能性低聚糖檢測室，刊名色譜.2002，20(3).關(guān)鍵詞細(xì)菌D-97酶合成 高效液相色譜 示差折光檢測 電噴霧電離質(zhì)譜 海藻糖 寡糖 定性分析 胞內(nèi)酶 定量分析文摘通過高效液相色譜/示差折光檢測系統(tǒng)(HPLC/RI)分析可獲得細(xì)菌D-97利用糊精或淀粉水解物合成海藻糖的基本生物學(xué)信息，包括微生物培養(yǎng)碳源對細(xì)菌D-97胞內(nèi)海藻糖合成酶系的影響以及該酶系利用不同種類或不同分子鏈長度的麥芽寡糖合成海藻糖的能力及作用過程。采用HPLC與RI及電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)聯(lián)用并結(jié)合其他生物學(xué)手段對由細(xì)菌D-97獲得的純酶組分(酶A)作用產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，從而基本明確了D-97胞內(nèi)合成海藻糖的過程。
8、腸桿菌海藻糖合成酶基因的克隆和表達(dá)作者戴秀玉 吳大鵬機(jī)構(gòu)中國科學(xué)院微生物研究所，刊名遺傳學(xué)報(bào).2000，27(2).關(guān)鍵詞OtsBA基因 海藻糖 細(xì)胞內(nèi)克隆 抗逆性 作物育種文摘利用Mu轉(zhuǎn)座子細(xì)胞內(nèi)克隆了大腸桿菌海藻糖合成酶ots BA基因，克隆頻率為1.45×10-3/Kanr轉(zhuǎn)導(dǎo)子。經(jīng)遺傳互補(bǔ)、酶切和部分序列分析表明ots BA基因位于克隆質(zhì)粒。亞克隆2.87kb的DNA片段到表達(dá)質(zhì)粒并分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌ots BA基因缺失菌株，轉(zhuǎn)化菌株恢復(fù)在0.5mol/L NACI培養(yǎng)基上生長的功能，高滲透壓誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)化株能夠合成海藻糖。
這些公開文獻(xiàn)雖然給出了一些通過微生物分離及克隆到與海藻糖合成相關(guān)的酶及技術(shù)方案，然后把這些酶用于制備海藻糖，但這些海藻糖合成酶的菌種來源不同，DNA序列和氨基酸序列相差甚遠(yuǎn)，酶活力不同，目前大部分還沒有得到應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人在分析上百種微生物的基因組時(shí)，發(fā)現(xiàn)可以用生物信息學(xué)的方法在一系列未注釋的脫氧核糖核酸中發(fā)現(xiàn)非常有用的信息。結(jié)合基因的克隆和異源基因表達(dá)技術(shù)，以及通過對表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行特性特征鑒定，發(fā)現(xiàn)了在蛋白質(zhì)的序列數(shù)據(jù)庫Genbank中注釋為“未知蛋白”或“推測是蛋白質(zhì)”的極為有用基因，其中包括至今為止人們并未發(fā)現(xiàn)的海藻糖合成酶基因(treS)，并用這種合成酶基因經(jīng)過克隆和培養(yǎng)，在麥芽糖漿或淀粉漿中用于制備得到產(chǎn)率極高的海藻糖。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所述的海藻糖合成酶基因選自褐色喜熱裂孢菌(Thermobifida fusca DSM 43792)。該菌種可以從微生物中心購買，也可以通過野外采集和其他途徑獲得。
從褐色喜熱裂孢菌(Thermobifida fusca DSM 43792)分離得到的海藻糖合成酶具有以下特征1、分子量為66kD2、等電點(diǎn)約為PI＝5.03、酶的最適反應(yīng)溫度為20～30℃4、酶的反應(yīng)的pH在6.5～8.5，優(yōu)選pH為6.5～7.0；5、當(dāng)Cu2+，Zn2+，Mn2+，Mg2+，Ca2+等二價(jià)金屬離子的濃度在5ppm時(shí)，該酶的活力不受影響。
6、酶對底物的轉(zhuǎn)化率會(huì)隨著反應(yīng)溫度的提高而逐漸降低，例如在60℃反應(yīng)的底物轉(zhuǎn)化率要比在25℃的轉(zhuǎn)化率低40％以上。
7、海藻糖合成酶在以麥芽糖漿為底物時(shí)，可催化底物生成40～70％的海藻糖。
8、該海藻糖合成酶在以麥芽糖為底物時(shí)，除了催化生成海藻糖外，還合成高達(dá)5～15％的葡萄糖。
9、葡萄糖對該酶的轉(zhuǎn)化率有較強(qiáng)的抑制作用，即葡萄糖存在時(shí)會(huì)影響海藻糖生成量。
本發(fā)明的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法，包括以下工藝步驟1)對選定的菌種接種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；2)從所獲得的擴(kuò)大菌種中克隆海藻糖合成酶基因(Tres)；3)將海藻糖合成酶基因(Tres)在大腸桿菌中表達(dá)；4)獲得重組海藻糖合成酶；5)以麥芽糖漿或淀粉漿為原料，用重組的海藻糖合成酶制造海藻糖。
在以上所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法中，對選定的菌種接種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的工藝是將褐色喜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)接種于以下原料液體培養(yǎng)基中(克/升)葡萄糖2.0-7.0，酵母粉(yeast extract)1.5-4.0，麥芽抽提液10.0，pH6.8-7.5，然后在48-55℃恒溫?fù)u床上振蕩18-36小時(shí)，于5000rpm離心10分鐘收集菌體。
在以上所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法中，從所獲得的擴(kuò)大菌種中克隆海藻糖合成酶基因(Tres)的工藝是先設(shè)計(jì)以下引物1、上游引物(Sense primer)5-5-GAGCCATGGCCCAGGCACACCCGGAGTGGT-3；2、下游引物(Antisense Primer)5-TGGTCTCTGCAGTCAATTCAACCGCAGCCAGTAATAG-3，然后用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)獲得目的基因，用Takara的專用試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行初步純化，然后用NcoI和hind III對PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，再與同樣用NcoI和hind III酶切過的pSE380質(zhì)粒連接，獲得重組質(zhì)粒pSE380-treS。
在以上所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法中，將海藻糖合成酶基因(Tres)在大腸桿菌中表達(dá)的工藝是制備大腸桿菌BL21的感受態(tài)細(xì)胞，然后用pSE380-treS轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，于30-37℃培養(yǎng)10-16小時(shí)，然后加入IPTG至終濃度為0.5mM，再繼續(xù)于28-32℃培養(yǎng)24-36小時(shí)。離心收集菌體后，即可進(jìn)行細(xì)胞破碎和重組海藻糖合成酶的提取和底物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。
在以上所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法中，收集含有重組海藻糖合成酶的工藝是將轉(zhuǎn)化試驗(yàn)合格的大腸桿菌菌體接種到500ml的LB培養(yǎng)基中氨芐青霉素50μg/ml，葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉3g/L。在33℃培養(yǎng)13小時(shí)，然后用2×500ml種子接種到含20升同樣培養(yǎng)基的40升發(fā)酵罐中。在33℃，200rpm，通氣量為0.9vvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)15小時(shí)。然后加入終濃度為0.5mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。再繼續(xù)培養(yǎng)17小時(shí)即終止。于5000rmp離心10分鐘以收集菌體。用等體積的去離子水洗滌細(xì)胞一次，同樣條件離心后重懸于二分之一體積的細(xì)胞破碎液液(含有3mg/ml溶菌酶，1％Triton-X100，0.05mM EDTA，用pH為6.9的磷酸緩沖液配制)中，在37℃振蕩反應(yīng)20小時(shí)，然后在45℃水浴中處理2小時(shí)。于3000g離心15分鐘，收集上清液得到重組海藻糖合成酶。
在以上所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法中，用重組海藻糖合成酶制造海藻糖的工藝是以麥芽糖漿或淀粉漿為原料，先加去離子水兌成含20～30％的溶液。取100升置于200升容積的不銹鋼反應(yīng)罐中，加入磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配成的緩沖液，使該緩沖液的終濃度為5mM，pH為6.9左右。取上述第1步中制得的海藻糖合成酶10升，加入到100升30％麥芽糖漿或淀粉漿中，然后在25-30℃條件下反應(yīng)24-36小時(shí)。用高效液相色譜儀(HPLC)如安捷倫Agilent 1100型對反應(yīng)液進(jìn)行測定其海藻糖含量。
以下給出本發(fā)明海藻糖合成酶的研究過程及制備方法本發(fā)明人在研究海藻糖合成酶的過程中，對褐色喜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)的基因組序列中的一段在Genbank中標(biāo)記為“糖苷酶基因”(Glycosidase)的基因作了深入細(xì)致的研究。發(fā)現(xiàn)這一段DNA序列與已發(fā)表的海藻糖合成酶基因(trehalose synthase)有較高的同源性，其DNA序列的平均同源性接近50％，而其編碼的假定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與已發(fā)表的海藻糖合成酶、糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的氨基酸同源性平均相差不大，一般57％，很難通過氨基酸序列確定其為何種酶。
本發(fā)明人用基因克隆方法，包括眾所周知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)、反向PCR技術(shù)(reverse PCR)，基因文庫建議和篩選技術(shù)(gene library screening)等把這一段標(biāo)記為“假定蛋白質(zhì)”(hypothetical protein)克隆到質(zhì)粒上，例如pGEM-3zf，pUC19等專用于克隆的商品質(zhì)粒上，然后再轉(zhuǎn)移到諸如pET5a、pSE380等表達(dá)質(zhì)粒上，再通過已成熟的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化技術(shù)，例如通過制備細(xì)胞膜的通透性大為增加的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞等技術(shù)，把質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中。后者在培養(yǎng)生長過程中就會(huì)把此段DNA所含的信息翻譯成為某種蛋白質(zhì)，而其DNA序列也一一對應(yīng)于該種蛋白質(zhì)的氨基酸序列。宿主大腸桿菌在一定生長條件下，特別是在有“誘導(dǎo)物”如IPTG、半乳糖、乳糖等存在的情況下，會(huì)大量地合成該種蛋白質(zhì)。
經(jīng)過細(xì)胞破碎，例如利用溶菌酶、超聲波或機(jī)械碾磨法等破碎細(xì)胞后，可以對該段DNA所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行特性特征研究，特別是鑒別出這段DNA所編碼的蛋白質(zhì)是一種什么東西？是一種酶還是結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)？如果是酶，又是一種什么酶？發(fā)明者經(jīng)過基因克隆，外源基因表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物的提取和純化，以及將目標(biāo)基因產(chǎn)物進(jìn)行酶學(xué)研究等多種復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)步驟，證實(shí)這一段“假定蛋白質(zhì)”編碼的是一種特性特征與前人發(fā)現(xiàn)的完全不同的海藻糖合成酶。這些不同的特性特征包括了氨基酸序列和DNA序列的不同，酶的分子大小不同，酶的最適反應(yīng)溫度不同，酶的最適pH反應(yīng)條件不同以及酶對底物麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖比例的差異等特性，因此判定是一種新的發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明所述的海藻糖合成酶的基因是來自褐色喜熱裂孢菌，拉丁學(xué)名是Thermobifidafusca。該種細(xì)菌主要生長于堆積的草堆中，過去只知道它能夠分泌一組纖維素酶，主要用于植物細(xì)胞壁的降解。通過本發(fā)明才知道該細(xì)菌還含有編碼海藻糖合成酶基因，并且能產(chǎn)生海藻糖合成酶，該酶在天然的褐色喜熱裂孢菌中是一種酶內(nèi)酶，需要用細(xì)胞破碎的方法才能檢查到；該天然生長緩慢，不易培養(yǎng)，天然菌中該酶的含量也非常低，經(jīng)過高達(dá)500～800倍濃縮都不一定檢驗(yàn)到海藻糖合成酶的活力。而應(yīng)用基因重組菌來表達(dá)本發(fā)明所述的海藻糖合成酶基因，可以使酶的活力比天然菌株高數(shù)千倍。
編碼本發(fā)明所述的海藻糖合成酶的基因(treS)是一段以前未知的DNA片段，長度為1833個(gè)堿基對，編碼610個(gè)氨基酸?；虻膲A基組成是表1 褐色喜熱裂孢菌DSM43792(ATCC27730)的海藻糖合成酶基因的堿基組成

表2.克隆自T.fusca的海藻糖合成酶基因DNA及氨基酸序列T.fusca的海藻糖合成酶基因DNA序列GTGGAGAAGT CGATGACCAC ACAGCCGGCT CCTGGTGCGC GCCCGACGCC GACCGGGTCC GTTCCCGACACGTTCACCCA CGCAAAGCCG CGCGACCCCT ACTGGTACAA GCACGCGGTG TTCTACGAAG TCCTCGTCCGCGGCTTCTAC GACTCCAACG GGGACGGCAC CGGCGACTTG CGGGGCCTCA TCGAAAAACT GGACTACCTGCAGTGGCTCG GCATCGACTG CCTCTGGCTG CTGCCGATCT ACGAGTCCCC GCTCCGCGAC GGCGGCTACG
ACGTCTCCGA CTACATGAAG ATCCTGCCCG AGTTCGGCCG GATCTCCGAC TTCGTGGAAC TCGTCGAAAAAGCCCACCAG CGGGGCATCC GGGTCATCAC CGACCTGGTC ATGAACCACA CCAGCGACCA GCACCCGTGGTTCCAAGCCT CCCGGCACGA CCCCGACGGA CCGTACGGCA ACTTCTACGT CTGGTCGGAC ACCACGGAACGCTACAGCGA CGCGCGCATC ATCTTCATCG ACACCGAGCA GTCCAACTGG ACCTACGACG AAGTGCGCGGACAGTACTAC TGGCACCGCT TCTTCTCCCA CCAGCCCGAC CTCAACTTCG AGAACCCGGA CGTCCAGGACGCCATCCTCG AAGTGATGCG GTTCTGGCTG GACCTTGGCA TCGACGGTTT CCGCTTGGAC GCCGTGCCCTACCTGTACGA GCGGGAAGGC ACGAACTGCG AGAACCTCAA GGAGACCCAC GAGTTCCTCA AACGCATCCGCGCCGAAGTC GACCGGCTCT ACCCCGACCG GGTCCTGCTC AGCGAAGCCA ACCAGTGGCC CGCCGACGTCGTCGACTACT TCGGCGACTA CGAATCCGGC GGCGACGAAT GCCACATGAA CTTCCACTTC CCGCTGATGCCGCGCATGTT CATGGCGGTC CGGCGCGAAC AGCGCTACCC CATCTCGGAA ATCCTCGCGC AGACCCCGCCTATTCCGCGC AACTGCCAGT GGGCGATCTT CCTGCGCAAC CACGACGAGC TGACCTTGGA GATGGTCAGCGATGAAGAGC GGGACTACAT GTACTCCGAA TACGCCAAAG ACCCGCGGAT GCGCGCCAAC ATGGGGATCCGCCGCCGGCT GGCACCCCTC CTGGAAAACG ACCTCAACCA GATCAAACTG TTCACCGCGC TGCTGCTGTCGCTGCCCGGC TCCCCGGTGC TCTACTACGG CGACGAGATC GGGATGGGCG ACAACATCTG GCTGGGGGACCGCGACAGCG TGCGCACCCC CATGCAGTGG ACCCCGGACC GCAACGCCGG ATTCTCCCGC TGCGACCCGGGCCGCCTCTA CCTGCCGGTG ATCATGGACC CGATCTACGG GTACCAGGCG ATCAACGTCG AAGCACAGCAGAACAACCCG AACTCGCTGC TGAACTGGAC CCGCAACATG ATCCAGATCC GCAAGCAGCA CCCGGTGTTCGGGACGGGGG ACTTCACCGA ACTCCACGCG AGCAACCCCA GCGTGTTCGC GTTCGTGCGC GAATACGGCGACGACCGGAT GCTGTGCGTC AACAACCTGT CCCGGTTTCC CCAACCGGTG GAACTGGACC TCCGCCGCTTCGAAGGGATC ACCCCGATCG AATGCACGGG GGGAGTGCAC TTCCCGCCCA TCGGGGAACT GCCCTACCTGCTGACTCTCC CCGGGCACGG CTTCTACTGG TTCCAGCTTC CGCCCGTCGC CGAAGAGCAG CCGCTCGCCCAGCCCGTCAC CACCGTCCCC GCAGCCCCGC AGCCTCCTGC TCCGGCAGAC CGTCCCGCGT CCGACCCGACCCAGCGGTCC TGAT.fusca的海藻糖合成酶基因的氨基酸序列Val Glu Lys Ser Met Thr Thr Gln Pro Ala Pro Gly Ala Arg Pro Thr Pro Thr Gly SerVal Pro Asp Thr Phe Thr His Ala Lys Pro Arg Asp Pro Tyr Trp Tyr Lys His Ala ValPhe Tyr Glu Val Leu Val Arg Gly Phe Tyr Asp Ser Asn Gly Asp Gly Thr Gly Asp LeuArg Gly Leu Ile Glu Lys Leu Asp Tyr Leu Gln Trp Leu Gly Ile Asp Cys Leu Trp LeuLeu Pro Ile Tyr Glu Ser Pro Leu Arg Asp Gly Gly Tyr Asp Val Ser Asp Tyr Met LysIle Leu Pro Glu Phe Gly Arg Ile Ser Asp Phe Val Glu Leu Val Glu Lys Ala His GlnArg Gly Ile Arg Val Ile Thr Asp Leu Val Met Asn His Thr Ser Asp Gln His Pro TrpPhe Gln Ala Ser Arg His Asp Pro Asp Gly Pro Tyr Gly Asn Phe Tyr Val Trp Ser AspThr Thr Glu Arg Tyr Ser Asp Ala Arg Ile Ile Phe Ile Asp Thr Glu Gln Ser Asn TrpThr Tyr Asp Glu Val Arg Gly Gln Tyr Tyr Trp His Arg Phe Phe Ser His Gln Pro AspLeu Asn Phe Glu Asn Pro Asp Val Gln Asp Ala Ile Leu Glu Val Met Arg Phe Trp LeuAsp Leu Gly Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Pro Tyr Leu Tyr Glu Arg Glu GlyThr Asn Cys Glu Asn Leu Lys Glu Thr His Glu Phe Leu Lys Arg Ile Arg Ala Glu ValAsp Arg Leu Tyr Pro Asp Arg Val Leu Leu Ser Glu Ala Asn Gln Trp Pro Ala Asp ValVal Asp Tyr Phe Gly Asp Tyr Glu Ser Gly Gly Asp Glu Cys His Met Asn Phe His PhePro Leu Met Pro Arg Met Phe Met Ala Val Arg Arg Glu Gln Arg Tyr Pro Ile Ser GluIle Leu Ala Gln Thr Pro Pro Ile Pro Arg Asn Cys Gln Trp Ala Ile Phe Leu Arg AsnHis Asp Glu Leu Thr Leu Glu Met Val Ser Asp Glu Glu Arg Asp Tyr Met Tyr Ser GluTyr Ala Lys Asp Pro Arg Met Arg Ala Asn Met Gly Ile Arg Arg Arg Leu Ala Pro LeuLeu Glu Asn Asp Leu Asn Gln Ile Lys Leu Phe Thr Ala Leu Leu Leu Ser Leu Pro GlySer Pro Val Leu Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Gly Asp Asn Ile Trp Leu Gly AspArg Asp Ser Val Arg Thr Pro Met GLn Trp Thr Pro Asp Arg Asn Ala Gly Phe Ser ArgCys Asp Pro Gly Arg Leu Tyr Leu Pro Val Ile Met Asp Pro Ile Tyr Gly Tyr Gln AlaIle Asn Val Glu Ala Gln Gl nAsn Asn Pro Asn Ser Leu Leu Asn Trp Thr Arg Asn Met
Ile Gln Ile Arg Lys Gln His Pro Val Phe Gly Thr Gly Asp Phe Thr Glu Leu His AlaSer Asn Pro Ser Val Phe Ala Phe Val Arg Glu Tyr Gly Asp Asp Arg Met Leu Cys ValAsn Asn Leu Ser Arg Phe Pro Gln Pro Val Glu Leu Asp Leu Arg Arg Phe Glu Gly IleThr Pro Ile Glu Cys Thr Gly Gly Val His Phe Pro Pro Ile Gly Glu Leu Pro Tyr LeuLeu Thr Leu Pro Gly His Gly Phe Tyr Trp Phe Gln Leu Pro Pro Val Ala Glu Glu GlnPro Leu Ala Gln Pro Val Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Gln Pro Pro Ala Pro Ala AspArg Pro Ala Ser Asp Pro Thr Gln Arg Ser本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步是與日本林原研究所報(bào)道的來自Pimerlobacter sp.R48的海藻糖合成酶相比，本發(fā)明的酶的氨基酸個(gè)數(shù)多了13個(gè)，而又比同樣是林原研究所報(bào)道的來自水棲嗜熱菌Thermus aquaticus的海藻糖合酶又少353個(gè)氨基酸，但催化的又是同一個(gè)反應(yīng)。酶的分子少353個(gè)氨基酸這意味著小分子的蛋白質(zhì)更加容易地通過基因重組與表達(dá)技術(shù)來進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，因而更有市場競爭力。
本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的海藻糖合成酶具有以下特征1、分子量為66kD2、等電點(diǎn)約為PI＝5.03、酶的最適反應(yīng)溫度為23～25℃4、酶的最適反應(yīng)的pH是在6.5～8.5范圍內(nèi)，酶的活力均表現(xiàn)為最高。
5、它能夠在正常的生化反應(yīng)條件下將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，該酶的底物轉(zhuǎn)化率會(huì)隨著反應(yīng)溫度的降低而升高。
具體實(shí)施例方式
以下是本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)和實(shí)例，下述實(shí)驗(yàn)和實(shí)例所述內(nèi)容屬于本發(fā)明的主要內(nèi)容，但并不僅僅限于這些內(nèi)容。有些可以顯而易見地?cái)U(kuò)展的內(nèi)容雖然并未在本專利說明書中出現(xiàn)，但也應(yīng)屬于本發(fā)明的專利請求范圍。
實(shí)施例1一、海藻糖合成酶基因(treS)的克隆將褐色喜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)接種于以下液體培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖4.0，酵母粉(yeast extract)4.0，麥芽抽提液10.0，pH7.2，然后在50℃恒溫?fù)u床上振蕩24小時(shí)，于5000rpm離心10分鐘收集菌體。然后按《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(第二版)》(Sambrook，et al.1989，Molecular Cloninga Laboratory Manual)中所述的方法進(jìn)行褐色喜熱裂孢菌的總DNA提取。
設(shè)計(jì)以下引物1、上游引物(Sense primer)
5-GAGCCATGGCCCAGGCACACCCGGAGTGGT-32、下游引物(Antisense Primer)5-TGGTCTCTGCAGTCAATTCAACCGCAGCCAGTAATAG-3’然后按PCR Cloning Protocols中所講的步驟進(jìn)行94℃60秒，然后進(jìn)行27個(gè)環(huán)徑95℃45秒，55℃60秒，72℃10分鐘。
用Takara的專用試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行初步純化，然后用NcoI和hind III對PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，再與同樣用NcoI和hind III酶切過的pSE380質(zhì)粒連接，獲得重組質(zhì)粒pSE380-treS。
二、海藻糖合成酶基因(Tres)在大腸桿菌中的表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒pSE380-treS構(gòu)建完畢，先轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，大量制備pSE380-treS表達(dá)質(zhì)粒，所得質(zhì)?？捎靡徊糠钟糜贒NA測序以確認(rèn)讀碼框的正確性，另一部分則可以用來進(jìn)行海藻糖合成酶基因表達(dá)試驗(yàn)。
按《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(1989年第二版)所述的方法，制備大腸桿菌BL21的感受態(tài)細(xì)胞，然后用pSE380-treS轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，于37℃培養(yǎng)10～16小時(shí)，然后加入IPTG至終濃度為0.5mM，再繼續(xù)于32℃培養(yǎng)24～36小時(shí)。離心收集菌體后，即可進(jìn)行細(xì)胞破碎和重組海藻糖合成酶的提取和底物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。
取100ml上述發(fā)酵液，在5000r/min離心10分鐘，用pH6.5的5mM磷酸緩沖液洗滌一次。然后將懸于100ml含有2mg/ml溶菌酶的5mM磷酸緩沖液中，于37℃水溶中進(jìn)行破胞12小時(shí)。于8000r/min離心15分鐘，取上清液1ml，與1ml 30％的麥芽糖溶液混合，置于25℃中反應(yīng)24小時(shí)，還原糖下降至原來的60％，徑HPLC檢測，25℃反應(yīng)24小時(shí)后溶液中含有海藻糖、麥芽糖和葡萄糖的濃度如下

*HPLC檢測樣品稀釋20倍，進(jìn)樣10μl，30℃、壓力46bar，流動(dòng)相為乙腈∶水(84∶16)三、從麥芽糖漿制造海藻糖1、基因重組海藻糖合成酶的制備按《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(第二版)所述方法，將連接有海藻糖合成酶基因(序列如表1所示)的表達(dá)質(zhì)粒pSE380-treS轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。在每毫升含有100微克氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基涂布并分離出單菌落。將單菌落接種到5ml含有10g/L葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，在33℃培養(yǎng)12小時(shí)，然后接種到500ml的下述培養(yǎng)基中氨芐青霉素50μg/ml，葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉3g/L。在33℃培養(yǎng)13小時(shí)，然后用2×500ml種子接種到含20升同樣培養(yǎng)基的40升發(fā)酵罐中。在33℃，200rpm，通風(fēng)量為0.9vvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)15小時(shí)。然后加入終濃度為0.5mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。再繼續(xù)培養(yǎng)17小時(shí)即終止。于5000rmp離心10分鐘以收集菌體。用等體積的去離子水洗滌細(xì)胞一次，同樣條件離心后重懸于二分之一體積的細(xì)胞破碎液液(含有3mg/ml溶菌酶，1％Triton-X100，0.05mM EDTA，用pH為6.9的磷酸緩沖液配制)中，在37℃振蕩反應(yīng)20小時(shí)，然后在45℃水浴中處理2小時(shí)。于3000g離心15分鐘。收集含有重組海藻糖合成酶的上清液。
1、麥芽糖漿轉(zhuǎn)化為海藻糖取70％的市售麥芽糖漿，加去離子水兌成含30％麥芽糖的溶液。取100升置于200升容積的不銹鋼反應(yīng)罐中，加入磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配成的緩沖液，使該緩沖液的終濃度為5mM，pH為6.9左右。取上述第1步中制得的海藻糖合成酶10升，加入到100升30％麥芽糖漿中，然后在25℃條件下反應(yīng)32小時(shí)。用高效液相色譜儀(HPLC)如安捷倫Agilent 1100型對反應(yīng)液進(jìn)行測定，結(jié)果如下來自T.fusca的海藻糖合成酶催化麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖

即底物麥芽糖中有63％轉(zhuǎn)化為海藻糖(由于底物濃度是30％/(100升+10升)＝27.27％，總的轉(zhuǎn)化率便是17.2％/27.27％＝63％)。也就是說，在110升總反應(yīng)體積中共形成了18.92千克海藻糖。
實(shí)施例2以木薯淀粉為出發(fā)原料，經(jīng)α淀粉酶液化后再由β-淀粉酶作用后生成的麥芽糖，將獲得的麥芽糖按實(shí)例1進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)表明100公斤淀粉可以得到約40公斤的海藻糖，除去淀粉中水份和雜質(zhì)，轉(zhuǎn)化效率和利用直接用麥芽糖做底物的轉(zhuǎn)化效率相同。
權(quán)利要求
1.一種海藻糖合成酶，其特征在于該海藻糖合成酶基因從褐色喜熱裂孢菌(Thermobifidafusca)中獲得。
2.如權(quán)利要求1所述的海藻糖合成酶，其特征在于其基因DNA序列和氨基酸序列如下所示T.fusca的海藻糖合成酶基因DNA序列GTGGAGAAGT CGATGACCAC ACAGCCGGCT CCTGGTGCGC GCCCGACGCC GACCGGGTCC GTTCCCGACACGTTCACCCA CGCAAAGCCG CGCGACCCCT ACTGGTACAA GCACGCGGTG TTCTACGAAG TCCTCGTCCGCGGCTTCTAC GACTCCAACG GGGACGGCAC CGGCGACTTG CGGGGCCTCA TCGAAAAACT GGACTACCTGCAGTGGCTCG GCATCGACTG CCTCTGGCTG CTGCCGATCT ACGAGTCCCC GCTCCGCGAC GGCGGCTACGACGTCTCCGA CTACATGAAG ATCCTGCCCG AGTTCGGCCG GATCTCCGAC TTCGTGGAAC TCGTCGAAAAAGCCCACCAG CGGGGCATCC GGGTCATCAC CGACCTGGTC ATGAACCACA CCAGCGACCA GCACCCGTGGTTCCAAGCCT CCCGGCACGA CCCCGACGGA CCGTACGGCA ACTTCTACGT CTGGTCGGAC ACCACGGAACGCTACAGCGA CGCGCGCATC ATCTTCATCG ACACCGAGCA GTCCAACTGG ACCTACGACG AAGTGCGCGGACAGTACTAC TGGCACCGCT TCTTCTCCCA CCAGCCCGAC CTCAACTTCG AGAACCCGGA CGTCCAGGACGCCATCCTCG AAGTGATGCG GTTCTGGCTG GACCTTGGCA TCGACGGTTT CCGCTTGGAC GCCGTGCCCTACCTGTACGA GCGGGAAGGC ACGAACTGCG AGAACCTCAA GGAGACCCAC GAGTTCCTCA AACGCATCCGCGCCGAAGTC GACCGGCTCT ACCCCGACCG GGTCCTGCTC AGCGAAGCCA ACCAGTGGCC CGCCGACGTCGTCGACTACT TCGGCGACTA CGAATCCGGC GGCGACGAAT GCCACATGAA CTTCCACTTC CCGCTGATGCCGCGCATGTT CATGGCGGTC CGGCGCGAAC AGCGCTACCC CATCTCGGAA ATCCTCGCGC AGACCCCGCCTATTCCGCGC AACTGCCAGT GGGCGATCTT CCTGCGCAAC CACGACGAGC TGACCTTGGA GATGGTCAGCGATGAAGAGC GGGACTACAT GTACTCCGAA TACGCCAAAG ACCCGCGGAT GCGCGCCAAC ATGGGGATCCGCCGCCGGCT GGCACCCCTC CTGGAAAACG ACCTCAACCA GATCAAACTG TTCACCGCGC TGCTGCTGTCGCTGCCCGGC TCCCCGGTGC TCTACTACGG CGACGAGATC GGGATGGGCG ACAACATCTG GCTGGGGGACCGCGACAGCG TGCGCACCCC CATGCAGTGG ACCCCGGACC GCAACGCCGG ATTCTCCCGC TGCGACCCGGGCCGCCTCTA CCTGCCGGTG ATCATGGACC CGATCTACGG GTACCAGGCG ATCAACGTCG AAGCACAGCAGAACAACCCG AACTCGCTGC TGAACTGGAC CCGCAACATG ATCCAGATCC GCAAGCAGCA CCCGGTGTTCGGGACGGGGG ACTTCACCGA ACTCCACGCG AGCAACCCCA GCGTGTTCGC GTTCGTGCGC GAATACGGCGACGACCGGAT GCTGTGCGTC AACAACCTGT CCCGGTTTCC CCAACCGGTG GAACTGGACC TCCGCCGCTTCGAAGGGATC ACCCCGATCG AATGCACGGG GGGAGTGCAC TTCCCGCCCA TCGGGGAACT GCCCTACCTGCTGACTCTCC CCGGGCACGG CTTCTACTGG TTCCAGCTTC CGCCCGTCGC CGAAGAGCAG CCGCTCGCCCAGCCCGTCAC CACCGTCCCC GCAGCCCCGC AGCCTCCTGC TCCGGCAGAC CGTCCCGCGT CCGACCCGACCCAGCGGTCC TGAT.fusca的海藻糖合成酶基因的氨基酸序列Val Glu Lys Ser Met Thr Thr Gln Pro Ala Pro Gly Ala Arg Pro Thr Pro Thr Gly SerVal Pro Asp Thr Phe Thr His Ala Lys Pro Arg Asp Pro Tyr Trp Tyr Lys His Ala ValPhe Tyr Glu Val Leu Val Arg Gly Phe Tyr Asp Ser Asn Gly Asp Gly Thr Gly Asp LeuArg Gly Leu Ile Glu Lys Leu Asp Tyr Leu Gln Trp Leu Gly Ile Asp Cys Leu Trp LeuLeu Pro Ile Tyr Glu Ser Pro Leu Arg Asp Gly Gly Tyr Asp Val Ser Asp Tyr Met LysIle Leu Pro Glu Phe Gly Arg Ile Ser Asp Phe Val Glu Leu Val Glu Lys Ala His GlnArg Gly Ile Arg Val Ile Thr Asp Leu Val Met Asn His Thr Ser Asp Gln His Pro TrpPhe Gln Ala Ser Arg His Asp Pro Asp Gly Pro Tyr Gly Asn Phe Tyr Val Trp Ser AspThr Thr Glu Arg Tyr Ser Asp Ala Arg Ile Ile Phe Ile Asp Thr Glu Gln Ser Asn TrpThr Tyr Asp Glu Val Arg Gly Gln Tyr Tyr Trp His Arg Phe Phe Ser His Gln Pro AspLeu Asn Phe Glu Asn Pro Asp Val Gln Asp Ala Ile Leu Glu Val Met Arg Phe Trp LeuAsp Leu Gly Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Pro Tyr Leu Tyr Glu Arg Glu GlyThr Asn Cys Glu Asn Leu Lys Glu Thr His Glu Phe Leu Lys Arg Ile Arg Ala Glu ValAsp Arg Leu Tyr Pro Asp Arg Val Leu Leu Ser Glu Ala Asn Gln Trp Pro Ala Asp ValVal Asp Tyr Phe Gly Asp Tyr Glu Ser Gly Gly Asp Glu Cys His Met Asn Phe His PhePro Leu Met Pro Arg Met Phe Met Ala Val Arg Arg Glu Gln Arg Tyr Pro Ile Ser GluIle Leu Ala Gln Thr Pro Pro Ile Pro Arg Asn Cys Gln Trp Ala Ile Phe Leu Arg AsnHis Asp Glu Leu Thr Leu Glu Met Val Ser Asp Glu Glu Arg Asp Tyr Met Tyr Ser GluTyr Ala Lys Asp Pro Arg Met Arg Ala Asn Met Gly Ile Arg Arg Arg Leu Ala Pro LeuLeu Glu Asn Asp Leu Asn Gln Ile Lys Leu Phe Thr Ala Leu Leu Leu Ser Leu Pro GlySer Pro Val Leu Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Gly Asp Asn Ile Trp Leu Gly AspArg Asp Ser Val Arg Thr Pro Met Gln Trp Thr Pro Asp Arg Asn Ala Gly Phe Ser ArgCys Asp Pro Gly Arg Leu Tyr Leu Pro Val Ile Met Asp Pro Ile Tyr Gly Tyr Gln AlaIIe Asn Val Glu Ala Gln Gln Asn Asn Pro Asn Ser Leu Leu Asn Trp Thr Arg Asn MetIle Gln Ile Arg Lys Gln His Pro Val Phe Gly Thr Gly Asp Phe Thr Glu Leu His AlaSer Asn Pro Ser Val Phe Ala Phe Val Arg Glu Tyr Gly Asp Asp Arg Met Leu Cys ValAsn Asn Leu Ser Arg Phe Pro Gln Pro Val Glu Leu Asp Leu Arg Arg Phe Glu Gly IleThr Pro Ile Glu Cys Thr Gly Gly Val His Phe Pro Pro Ile Gly Glu Leu Pro Tyr LeuLeu Thr Leu Pro Gly His Gly Phe Tyr Trp Phe Gln Leu Pro Pro Val Ala Glu Glu GlnPro Leu Ala Gln Pro Val Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Gln Pro Pro Ala Pro Ala AspArg Pro Ala Ser Asp Pro Thr Gln Arg Ser
3.如權(quán)利要求1所述的海藻糖合成酶，其特征在于分子量為66kD；等電點(diǎn)約為PI＝5.0；酶的最適反應(yīng)溫度為20～30℃；酶的反應(yīng)的pH在6.5～8.5；當(dāng)Cu2+，Zn2+，Mn2+，Mg2+，Ca2+等二價(jià)金屬離子的濃度在5ppm時(shí)，該酶的活力不受影響；海藻糖合成酶在以麥芽糖漿為底物或以淀粉為反應(yīng)物時(shí)，可生成40～70％的海藻糖；該海藻糖合成酶在以麥芽糖為底物時(shí)，除了催化生成海藻糖外，同時(shí)還合成高達(dá)5～15％的葡萄糖；葡萄糖對該酶的轉(zhuǎn)化律有較強(qiáng)的抑制作用。
4.如權(quán)利要求1所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法，其特征在于包括以下工藝步驟1)對選定的菌種接種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；2)從所獲得的擴(kuò)大菌種中克隆海藻糖合成酶基因；3)將海藻糖合成酶基因在大腸桿菌中表達(dá)；4)收集含有重組海藻糖合成酶；5)以麥芽糖漿或淀粉漿為原料，用海藻糖合成酶制造海藻糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法，其特征在于對選定的菌種接種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的工藝是將褐色喜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)接種于以下原料液體培養(yǎng)基中葡萄糖2.0-7.0克/升，酵母粉1.5-4.0克/升，麥芽抽提液10.0克/升，pH6.8-7.5，然后在48-55℃恒溫?fù)u床上振蕩18-36小時(shí)，于5000rpm離心10分鐘收集菌體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法，其特征在于從所獲得的擴(kuò)大菌種中克隆海藻糖合成酶基因的工藝是先設(shè)計(jì)以下引物1、上游引物5-GAGCCATGGCCCAGGCACACCCGGAGTGGT-3；2、下游引物5-TGGTCTCTGCAGTCAATTCAACCGCAGCCAGTAATAG-3，然后用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)獲得目的基因，然后用Takara的專用試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行初步純化，然后用NcoI和hind III對PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，再與同樣用NcoI和hind III酶切過的pSE380質(zhì)粒連接，獲得表達(dá)質(zhì)粒pSE380-treS。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法，其特征在于將海藻糖合成酶基因在大腸桿菌中表達(dá)的工藝是制備大腸桿菌BL21的感受態(tài)細(xì)胞，然后用重組質(zhì)粒pSE380-treS轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，于30-37℃培養(yǎng)10-16小時(shí)，然后加入IPTG至終濃度為0.5mM，再繼續(xù)于28-32℃培養(yǎng)24-36小時(shí)，離心收集菌體后，即可進(jìn)行細(xì)胞破碎和重組海藻糖合成酶的提取和底物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法，其特征在于收集含有重組海藻糖合成酶的工藝是將轉(zhuǎn)化試驗(yàn)合格的大腸桿菌菌體接種到500ml的下述培養(yǎng)基中氨芐青霉素50μg/ml，葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉3g/L，在33℃培養(yǎng)13小時(shí)，然后用2×500ml種子接種到含20升同樣培養(yǎng)基的40升發(fā)酵罐中，在33℃，200rpm，通風(fēng)量為0.9vvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)15小時(shí)，然后加入終濃度為0.5mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，再繼續(xù)培養(yǎng)17小時(shí)即終止，于5000rmp離心10分鐘以收集菌體，用等體積的去離子水洗滌細(xì)胞一次，同樣條件離心后重懸于二分之一體積的含有3mg/ml溶菌酶，1％Triton-X100，0.05mM EDTA，用pH為6.9的磷酸緩沖液配制的細(xì)胞破碎液中，在37℃振蕩反應(yīng)20小時(shí)，然后在45℃水浴中處理2小時(shí)，于3000g離心15分鐘，收集上清液得到重組海藻糖合成酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的海藻糖合成酶基因制備海藻糖的方法，其特征在于用重組海藻糖合成酶制造海藻糖的工藝是以麥芽糖漿或淀粉漿為原料，先加去離子水兌成含30％的溶液，取100升置于200升容積的不銹鋼反應(yīng)罐中，加入磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配成的緩沖液，使該緩沖液的終濃度為5mM，pH為6.9左右，取上述第1步中制得的海藻糖合成酶10升，加入到100升30％麥芽糖漿或淀粉漿中，然后在20-30℃條件下反應(yīng)24-36小時(shí)，用高效液相色譜儀如安捷倫Agilent 1100型對反應(yīng)液進(jìn)行測定其海藻糖含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種全新的海藻糖合成酶基因的克隆及其在相關(guān)宿主中的表達(dá)，該酶的基因基因克隆自Thermobifida菌屬，它能夠在正常的生化反應(yīng)條件下將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，該酶的底物轉(zhuǎn)化率會(huì)隨著反應(yīng)溫度的降低而升高，它可以利用麥芽糖或淀粉為原料，再由克隆得到的酶轉(zhuǎn)化為α，α－1，1－海藻糖。這種海藻糖可應(yīng)用于食品工業(yè)，海產(chǎn)品冷藏以及藥物的活性保持等領(lǐng)域。
文檔編號C12P19/12GK1563372SQ20041001300
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月8日
發(fā)明者韋宇拓, 黃日波, 蒙健宗, 盧福燊, 龐中文, 朱綺霞, 陳發(fā)忠, 羅兆飛, 盧運(yùn)琨, 王青艷, 黃鯤 申請人:廣西大學(xué)