一種gh11耐熱木聚糖酶基因的異源表達的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種源自嗜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)GH11耐熱木聚糖酶的密碼子優(yōu)化基因在大腸桿菌中表達、活性測定和酶學性質(zhì)分析的方法。其基因命名為Syxyl11，它的核苷酸序列為SEQ ID NO:1，編碼的蛋白質(zhì)為SyXyl11，氨基酸序列為SEQ ID NO:2。該酶活性為47.5U/mL；其最適反應溫度為70℃，70℃下保溫60min，殘余酶活為78.3％，表明該酶的熱穩(wěn)定性比較好；其最適pH為6.0，在pH5.0～8.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定；金屬離子對該酶活性影響較小。這為該酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)，有較大的工業(yè)化應用潛力及經(jīng)濟價值。
【專利說明】一種GH11耐熱木聚糖酶基因的異源表達

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種來源于嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca)的糖苷水解酶11家族 耐熱木聚糖酶（SyXylll)基因的異源表達、活性測定和酶學性質(zhì)分析的方法，屬于生物工 程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素、半纖維素和木質(zhì)素是植物細胞壁的主要成分，而木聚糖是植物半纖 維素的重要組成部分，它是繼纖維素之后含量第二豐富的可再生生物資源。木聚糖酶 是降解木聚糖的一組酶的總稱，由于木聚糖的來源不同，其結(jié)構(gòu)的復雜性也不同，它的 完全降解需要多種水解酶的參與共同作用完成，如內(nèi)切木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、葡 糖糖醛酸酶以及a-L-阿拉伯呋喃糖酶等。其中最重要的是β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶 (endo-β -1，4-xylanase，EC 3. 2. 1. 8)，它能從木聚糖主鏈的內(nèi)部隨機切割木糖苷鍵，將其 降解成寡聚木糖、木二糖和少量木糖，是半纖維素類資源轉(zhuǎn)化和利用不可缺少的生物催化 齊U。根據(jù)催化結(jié)構(gòu)域氨基酸的同源性和疏水簇分析法可將木聚糖酶劃分為糖苷水解酶1〇 家族和11家族。木聚糖酶在造紙、食品、飼料、紡織等工業(yè)領(lǐng)域都有著重要的應用價值，但 由于紙漿漂白、飼料制粒等工藝均需要較高溫度，因此耐熱木聚糖酶的研究和開發(fā)受到了 很多研究者的關(guān)注。目前已發(fā)現(xiàn)了許多能產(chǎn)11家族耐熱木聚糖酶的微生物，其中許多耐熱 木聚糖酶基因已被克隆并表達在合適的宿主中。根據(jù)密碼子的偏好性，宿主細胞能夠以不 同的速度合成蛋白質(zhì)。編碼蛋白質(zhì)的基因中有些密碼子對應的tRNA含量少（即屬于稀有 密碼子），所以合成量較少，宿主以此來控制蛋白質(zhì)的合成速度。因此按照密碼子的偏好性， 對外源蛋白編碼基因進行密碼子優(yōu)化可以有效提高外源蛋白的表達量。目前大腸桿菌表達 系統(tǒng)以其成本低廉、生產(chǎn)率高、操作簡單等優(yōu)點備受青睞。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種來源于嗜熱裂孢菌的GHll耐熱木聚糖酶（SyXylll)基 因的異源表達、活性測定和酶學性質(zhì)分析方法，為該酶的異源高效表達和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定 理論基礎(chǔ)。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案：將源自嗜熱裂孢菌的GHll耐熱木聚糖酶的基因 xylll催化 域根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進行序列優(yōu)化，優(yōu)化后基因命名為Syxy 111，其核苷酸序列為 SEQ ID NO: 1，編碼的蛋白質(zhì)為SyXylll，其氨基酸序列為SEQ ID NO:2;將該優(yōu)化基因在大 腸桿菌（Escherichia coli)BL21(DE3)中表達，并對表達產(chǎn)物進行活性測定及酶學性質(zhì)分 析。
[0005] 所述的xylll是一種來源于嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca NTU22)的耐熱木聚 糖酶基因（GenBank登錄號為AY795559)，它的熱穩(wěn)定性非常好，具有適合于工業(yè)應用的理 想特性。
[0006] 所述的SyXylll的異源表達、活性測定和酶學性質(zhì)分析方法：
[0007] (1)重組質(zhì)粒pUCm-T-Syxylll的構(gòu)建：根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性，對來源 于嗜熱裂孢菌的耐熱木聚糖酶基因 xylll催化域（570bp)進行密碼子優(yōu)化，并在其催化 域基因兩端分別加入EcoR I、Not I位點，該基因命名為Syxylll ;人工合成該基因后克 隆至pUCm-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E. coli JM109,經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，獲得重組質(zhì)粒 pUCm-T-Syxylll〇
[0008] (2)重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建：將上述得到的重組質(zhì)粒pUCm-T-Syxylll進行EcoR I 和Not I雙酶切，割膠回收產(chǎn)物與經(jīng)同樣雙酶切的表達質(zhì)粒pET-28a(+)連接，經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化 法將pET-28a-Syxylll導入E. coli BL21(DE3)中，涂布于含卡那霉素的LB平板，經(jīng)PCR篩 選出陽性轉(zhuǎn)化子，送上海生工測序。測序正確的重組表達質(zhì)粒命名為pET-28a-Syxylll，陽 性轉(zhuǎn)化子命名為BL21-pET-28a-Syxylll。
[0009] (3)syxylll在大腸桿菌中的表達及產(chǎn)物純化：將陽性轉(zhuǎn)化子 BL21-pET-28a-Syxylll接種于2mL含Kan的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，以1%的接 種量轉(zhuǎn)接于30mL相同培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期（OD 6tltl = 0. 6?0. 8)，加入 IPTG至終濃度為0. 5mmol/L，在20°C誘導培養(yǎng)8h。將菌體沉淀，用檸檬酸-Na2HPO4緩沖液 (pH 6.0)懸浮，冰浴并超聲破碎細胞，離心得上清為粗酶液。用鎳金屬螯合層析柱純化目的 蛋白。
[0010] (4)木聚糖酶的活性測定及分析：木聚糖酶酶活測定采用改進的DNS試劑法。 2. 4mL 0. 5%樺木木聚糖溶液中加入0. ImL適當稀釋的酶液，最適溫度下反應15min，加入 2. 5mL DNS試劑，沸水浴顯色7min，測定OD54tl。在上述反應條件下，一個酶活性單位（U) 定義為每分鐘產(chǎn)生1 μ mol還原糖所需的酶量。蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍染色法 (Bradford法），并采用SDS-PAGE對表達產(chǎn)物進行分析及表觀分子量的測定。
[0011] (5)重組木聚糖酶酶學性質(zhì)測定及分析：
[0012] 酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性：取適當稀釋酶液于50?80°C條件下進行酶解反應，每 隔5°C，分別測定酶活，以酶活力最高者為100%，作溫度-相對酶活性曲線；將酶液于不同 溫度下保溫Ih后，按常規(guī)方法測定殘余酶活性，以保溫酶液的酶活性為100%，作溫度-相 對酶活性曲線。當殘余酶活達到85%以上，即定義為穩(wěn)定。
[0013] 酶的最適pH與pH穩(wěn)定性：在最適溫度下，測定不同pH值下木聚糖酶的酶活性。 以酶活力最高者為100%，作PH-相對酶活性曲線；將酶在不同的pH值條件下于40°C保溫 lh，再分別測定殘余酶活性，以未處理酶液的酶活性為100%，作pH-相對酶活性曲線。當殘 余酶活達到85%以上，即定義為穩(wěn)定。
[0014] 金屬離子對酶活性的影響：將酶液與不同金屬離子溶液混合，終濃度為5mmol/L， 40°C，保溫lh，然后按常規(guī)方法測定殘余酶活性，以不加金屬離子的酶活性定義為100%。
[0015] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種源自嗜熱裂孢菌的GHll耐熱木聚糖酶 (SyXylll)基因的異源表達、活性測定和酶學性質(zhì)分析方法，其相應的基因為Syxylll，重 組酶的最適反應溫度為70°C，在70°C下保溫60min，殘余酶活為78. 3%，表明該酶的熱穩(wěn)定 性比較好；本發(fā)明為該酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)，有較大的工業(yè)化應用潛力及經(jīng)濟 價值，也為其它耐熱木聚糖酶的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

【具體實施方式】
[0016] 以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳 細說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0017] 實施例1重組質(zhì)粒pUCm-T-Syxylll的構(gòu)建
[0018] 為實現(xiàn)來源于嗜熱裂孢菌的耐熱木聚糖酶基因 Xylll在E. COli中的高效表達， 對xylll催化域基因序列（570bp)進行大腸桿菌密碼子優(yōu)化，并在其催化域基因兩端分別 加入EcoR I、Not I位點，該基因命名為Syxylll，人工合成后克隆至pUCm-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化 E. coli JM109,經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，獲得重組質(zhì)粒pUCm-T-Syxylll。
[0019] 實施例2重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
[0020] 將上述得到的重組質(zhì)粒pUCm-T-Syxylll進行EcoR I和Not I雙酶切，割膠回收 約570bp的目的基因 Syxylll，與經(jīng)同樣雙酶切的表達質(zhì)粒pET-28a(+)連接，經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化 法將pET-28a-Syxylll導入E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞中。涂布于含卡那霉素的LB平 板，經(jīng)通用引物（T7-F和T7-R)菌液PCR篩選篩選出陽性轉(zhuǎn)化子后送上海生工測序，測序正 確的重組表達質(zhì)粒命名為pET-28a-Syxylll，陽性轉(zhuǎn)化子命名為BL21-pET-28a-Syxylll。
[0021] 實施例3Syxylll在Ε· coli BL21 (DE3)中的表達及產(chǎn)物純化
[0022] 將 BL21-pET-28a-Syxylll 接種于 2mL 含 100 μ g/mL 卡那霉素（Kan)的 LB 培養(yǎng)基 中，于37°C，220r/min振蕩培養(yǎng)12h，再以1 %的接種量轉(zhuǎn)接于30mL含Kan的新鮮LB培養(yǎng) 基中，220r/min，待OD6tltl達0. 8時，加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L，2(TC誘導培養(yǎng)8h。將 菌體沉淀，用15mL檸檬酸-Na2HPO4緩沖液（pH 6.0)懸浮，冰浴并超聲破碎細胞，離心得上 清為粗酶液，酶活性為47. 5U/mL。在4°C下，用2mL鎳金屬螯合層析柱純化目的蛋白，采用 Bradford法測定蛋白含量，比酶活性為55U/mg ;采用SDS-PAGE對表達產(chǎn)物進行分析，酶蛋 白的表觀分子量為24. 8kDa。
[0023] 實施例4重組木聚糖酶酶學性質(zhì)分析
[0024] 酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性：取適當稀釋酶液于50?80°C條件下進行酶解反應，每 隔5°C，分別測定酶活，以酶活力最高者為100 %，作溫度-相對酶活性曲線，其最適溫度為 70°C ;將酶液于不同溫度下保溫Ih后，按常規(guī)方法測定殘余酶活性，以未保溫酶液的酶活性 為100%，作溫度-相對酶活性曲線，該重組酶在70°C下保溫60min，殘余酶活為78. 3%。
[0025] 酶的最適pH與pH穩(wěn)定性：在最適溫度70°C下，分別測定不同pH值（0. 2mol/L朽1 檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液：pH 3. 0?8. 0和This-HCl緩沖液：pH 8. 5-9. 0)下木聚糖酶的 酶活性。以酶活力最高者為100%，作pH-相對酶活性曲線,其最適pH為6.0 ;將酶在不同 的PH值條件下于40°C保溫lh，再分別測定殘余酶活性，以未處理酶液的酶活性為100%，作 pH-相對酶活性曲線，顯示該酶在pH 5. 0?8. 0范圍穩(wěn)定。
[0026] 金屬離子對酶活性的影響：將酶液與不同金屬離子溶液（終濃度為5mmol/L) 混合，40°C，保溫lh，然后按常規(guī)方法測定殘余酶活性，以不加金屬離子的酶活性定義為 100%，結(jié)果顯示金屬離子對該酶活性的影響較小。
【權(quán)利要求】
1. 一種來源于嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca)NTU22菌株糖苷水解酶第11家族 (GH11)的耐熱木聚糖酶催化域優(yōu)化基因（Syxylll)，其對應的核苷酸序列和氨基酸序列分 別為 SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2。 2. SyXylll的異源表達、酶活性及酶學特性的測定： (1) 重組質(zhì)粒pUCm-T-Syxylll的構(gòu)建：根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性，對來源于嗜熱 裂孢菌的耐熱木聚糖酶基因xylll催化域（570bp)進行密碼子優(yōu)化，并在其催化域基因兩 端分別加入EcoR I、Not I位點，該基因命名為Syxylll ;人工合成該基因后克隆至pUCm-T 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E. coli JM109,經(jīng)PCR驗證后送上海生工測序，獲得重組質(zhì)粒pUCm-T-Syxylll ; (2) 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建：將上述得到的重組質(zhì)粒pUCm-T-Syxylll進行EcoR I和 Not I雙酶切，割膠回收產(chǎn)物與經(jīng)同樣雙酶切的表達質(zhì)粒pET-28a(+)連接，經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化法 將pET-28a-Syxylll導入E. coli BL21(DE3)中，涂布于含卡那霉素（Kan)的LB平板，經(jīng)PCR 篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，送上海生工測序；測序正確的重組表達質(zhì)粒命名為pET-28a-Syxylll， 陽性轉(zhuǎn)化子命名為BL21-pET-28a-Syxylll ; (3) Syxylll在大腸桿菌中的表達、產(chǎn)物純化及酶學特性的測定： 將陽性轉(zhuǎn)化子BL21-pET-28a-Syxylll接種于2mL含Kan的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培 養(yǎng)過夜，以1%的接種量轉(zhuǎn)接于30mL相同培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期（0D_ 為0. 6?0. 8)，加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L，20°C誘導培養(yǎng)8h。將菌體沉淀，用檸檬 酸-Na2HP04緩沖液（pH 6. 0)懸浮，冰浴并超聲破碎細胞，離心得上清為粗酶液；DNS法測 得粗酶液中重組木聚糖酶活性為47. 5U/mL ;用鎳金屬螯合層析柱純化目的蛋白，純化后經(jīng) SDS-PAGE檢測為單一條帶，并顯示重組木聚糖酶分子量為24. 8kDa ;采用Bradford法測定 蛋白含量，比酶活性為55U/mg ;該酶的最適反應溫度為70°C，70°C下保溫60min，殘余酶活 為78. 3% ;其最適pH為6.0,在pH 5.0?8.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定；金屬離子對該酶活性影響較 小。
【文檔編號】C12R1/01GK104388450SQ201410758794
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】鄔敏辰, 何瑤, 朱利娟, 李劍芳, 王春娟, 殷欣 申請人:江南大學