一種熱穩(wěn)定性碳酸酐酶的異源表達(dá)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種熱穩(wěn)定性碳酸酐酶的異源表達(dá)及應(yīng)用，以及該碳酸酐酶在CO2吸收領(lǐng)域的應(yīng)用，通過本技術(shù)的碳酸酐酶，具有好的有機(jī)胺耐受性，并能夠促進(jìn)有機(jī)胺對CO2吸收。本發(fā)明還涉及分離的氨基酸編碼熱穩(wěn)定性碳酸酐酶，核苷酸的核酸構(gòu)建及表達(dá)方式。
【專利說明】一種熱穩(wěn)定性碳酸酐酶的異源表達(dá)及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物酶領(lǐng)域，具體是指一種熱穩(wěn)定性碳酸酐酶的異源表達(dá)及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] C02等溫室氣體的減排越來越受到國際社會的廣泛關(guān)注，已成為國際能源領(lǐng)域研 發(fā)的熱點(diǎn)。全世界每年共排放三百多億噸C02，造成了嚴(yán)重的溫室效應(yīng)。因此，0)2的捕捉和 儲存（CarbonCaptureandStorage，簡稱CCS)已經(jīng)刻不容緩。
[0003]目前主要有三種不同類型的C02捕捉系統(tǒng)，即燃燒前脫碳（Pre-combustion)、富 氧燃燒脫碳（〇xy-fuel combustion)和燃燒后脫碳（Post-combustion),其中最成熟的是 燃燒后脫碳，即在燃燒排放的煙氣中捕捉C02。目前常用的C02捕捉技術(shù)主要有化學(xué)吸收法 (利用酸堿性吸收）和物理吸收法（變溫或變壓吸附），此外還有膜分離技術(shù)是公認(rèn)的在能 耗和設(shè)備緊湊性方面具有非常大潛力的技術(shù)，目前正處于開發(fā)階段。化學(xué)吸收法因其吸收 效果好得到廣泛研究，其中最常用的是有機(jī)胺溶液吸收法。不同種類的胺液在C02吸收過 程中，由于其吸收機(jī)理不同，表現(xiàn)出的特性也不同，各自存在優(yōu)勢和局限性。伯胺（如乙醇 胺MEA)、仲胺（如二乙醇胺DEA)具有較大的吸收速率，但是吸收量不大，解吸能耗也偏高； 而叔胺（如N-甲基二乙醇胺MDEA)雖然具有吸收量大、易于解吸的優(yōu)點(diǎn)，但整體吸收速率 太低。所以，采用單一的醇胺對C02進(jìn)行吸收具有很大的缺陷。較為理想的吸收劑就應(yīng)該同 時具有較大的吸收能力又僅需較低的再生能量，如活化的叔胺溶液，這樣形成新的混合胺 溶液既保持了叔胺解吸能耗低的優(yōu)點(diǎn)，又改善了單一叔胺溶液吸收速率低的特點(diǎn)。然而，由 于現(xiàn)有化學(xué)吸附技術(shù)主要采用的吸收溶液為一乙醇胺（Monoethanolamine，MEA)，存在著較 多的弊端，如捕捉效率較低，需要較大的設(shè)備（較長的管道）來達(dá)到較高的捕捉率，固定資 產(chǎn)投資較大；主體吸收劑MEA不夠穩(wěn)定，循環(huán)使用次數(shù)少且會降解；而且MEA對管道的腐蝕 較強(qiáng)，需添加額外的鈍化劑；同時，MEA法捕捉C02后在釋放C02階段，需要較高的溫度（約 110°C)來解吸附C02，能耗很高等，導(dǎo)致捕捉項目成本過高，無法進(jìn)行工業(yè)化推廣。
[0004] 基于此，近年來開發(fā)了一種新型的方法即采用生物酶-碳酸酐酶來加快co2捕捉 速率。碳酸酐酶（CarbonicAnhydrase，簡稱CA)作為一種Zn+依賴的金屬酶，能夠可逆地催 化CO^PHCOf之間的轉(zhuǎn)化，作用機(jī)制見圖 1(AlainC.Pierre，ISRNChemicalEngineering， 2012)，鑒于此種催化特性，可以利用CA與有機(jī)胺類溶液結(jié)合應(yīng)用于C02捕捉，見圖2(Alain C.Pierre,ISRNChemicalEngineering, 2012)，從而加快(1)2捕捉速率，提高捕捉效率；同 時，在C02釋放階段，利用生物酶催化方法來實現(xiàn)在較低溫度下的C02釋放和再生，從而降低 能耗和設(shè)備制造成本。
[0005] 然而，運(yùn)用碳酸酐酶進(jìn)行C02捕捉目前仍處于研發(fā)階段，未有中試示范裝置建設(shè)和 工業(yè)化應(yīng)用的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種熱穩(wěn)定性碳酸酐酶，該酶具有較好的熱穩(wěn)定性和高濃度 有機(jī)胺溶液耐受性，具有極大的工業(yè)化應(yīng)用潛力和良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
[0007] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0008] -種熱穩(wěn)定性碳酸酐酶的異源表達(dá)，所述熱穩(wěn)定性碳酸酐酶是，
[0009] 具有如下氨基酸序列的多肽，該氨基酸序列與SEQIDN0 :2的氨基酸序列具有至 少90%同一性。
[0010] 編碼權(quán)利要求1所述的多肽的基因。
[0011] 其核苷酸序列如SEQIDN0 :1所示。
[0012] 根據(jù)上述的穩(wěn)定性碳酸酐酶，所述碳酸酐酶的核苷酸序列編碼，實現(xiàn)在大腸桿菌 中異源可溶性表達(dá)。
[0013] 一種熱穩(wěn)定性碳酸酐酶的應(yīng)用，所述熱穩(wěn)定性碳酸酐酶應(yīng)用于co2吸收領(lǐng)域。
[0014] 所述C02為氣體形態(tài)。
[0015] 所述熱穩(wěn)定性碳酸酐酶應(yīng)用于有機(jī)胺co2吸收領(lǐng)域。
[0016] 在添加有所述熱穩(wěn)定性碳酸酐酶的有機(jī)胺溶液中，C02吸收率隨著有機(jī)胺濃度的 增大而減小。
[0017] 所述有機(jī)胺包括有脂肪胺類、醇胺類、酰胺類、脂環(huán)胺類、芳香胺類或萘系胺類中 的一種或幾種組合。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是：
[0019] 本技術(shù)方案的碳酸酐酶，能夠加快C02捕捉速率，提高捕捉效率；同時，在C02釋放 階段，利用生物酶催化方法來實現(xiàn)在較低溫度下的C02釋放和再生，從而降低能耗和設(shè)備 制造成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為碳酸酐酶可逆地催化C02和HCCV之間的轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制；
[0021] 圖2為碳酸酐酶與有機(jī)胺類結(jié)合應(yīng)用于C02捕捉的原理圖；
[0022] 圖3為碳酸酐酶熱穩(wěn)定性檢驗圖；
[0023] 圖4為碳酸酐酶的MDEA耐受性對照圖；
[0024] 圖5為碳酸酐酶促進(jìn)MDEA吸收的對照圖；
[0025] 圖6為MDEA濃度對碳酸酐酶促進(jìn)C02吸收的影響圖；
[0026] 圖7為碳酸酐酶促進(jìn)MDEA吸收混合氣中的C02趨勢圖。

【具體實施方式】
[0027] 以下通過實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案，以下的實施例僅是示例性的，僅 能用來解釋和說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能解釋為是對本發(fā)明技術(shù)方案的限制。
[0028] 本發(fā)明提供一種熱穩(wěn)定性碳酸酐酶的異源表達(dá)，所述熱穩(wěn)定性碳酸酐酶是，
[0029] 具有如下氨基酸序列的多肽，該氨基酸序列與SEQIDN0 :2的氨基酸序列具有至 少90%同一性。更優(yōu)選為至少具有98%同一性，最優(yōu)選為具有100%同一性。
[0030] 編碼權(quán)利要求1所述的多肽的基因。
[0031] 其核苷酸序列如SEQIDN0 :1所示。
[0032] 碳酸酐酶的核苷酸序列編碼，實現(xiàn)在大腸桿菌中異源可溶性表達(dá)。
[0033] 所述碳酸酐酶在pH值6. 0-9. 0環(huán)境下保持活性。
[0034] 所述碳酸酐酶在低于80°C的范圍內(nèi)具有好的溫度穩(wěn)定性。
[0035] 所述碳酸酐酶對有機(jī)胺具有好的耐受性。
[0036] 所述碳酸酐酶具有促進(jìn)有機(jī)胺吸收C02的效果，此技術(shù)能夠吸收的C02為氣態(tài)C02。
[0037] 在添加有所述碳酸酐酶的有機(jī)胺溶液中，C02吸收率隨著有機(jī)胺濃度的增大而減 小。
[0038] 所述有機(jī)胺包括有脂肪胺類、醇胺類、酰胺類、脂環(huán)胺類、芳香胺類或萘系胺類中 的一種或幾種組合。
[0039] 在申請中的碳酸酐酶，應(yīng)用于C02吸收領(lǐng)域，此處的C02是指各種生產(chǎn)領(lǐng)域所產(chǎn)生 的含有C02氣體的領(lǐng)域。
[0040] 本申請的具有熱穩(wěn)定性的碳酸酐酶，是通過以下方法制備的：
[0041] 培養(yǎng)基制備
[0042] LB培養(yǎng)基，在每升LB培養(yǎng)基中，酵母提取物（Yeastextract)5g/L;胰蛋白胨 (Tryptone) 10g/L;NaCl10g/L，LB培養(yǎng)基的pH為 7. 0,在 121°C滅菌 20min。
[0043] 碳酸酐酶的基因序列重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)
[0044] 首先，根據(jù)Blast比對得到碳酸酐酶核苷酸序列（SDQIDNo:1，命名為PaCA)編 碼區(qū)域的基因片段，經(jīng)優(yōu)化后進(jìn)行全基因合成，在5'和3'端分別帶有Ndel和HindIII酶 切位點(diǎn)，該基因片段和質(zhì)粒口￡121&"(^^611)分別用制61和把11(1111限制性內(nèi)切酶（他界 EnglandBiolabs，NEB)雙酶切后在連接反應(yīng)液中進(jìn)行連接反應(yīng)，連接反應(yīng)液在本實施例中 為l〇y1,其中，T4DNA連接酶（Takara) 1ii1 ;10XT4BufTer(10XLigationBuffer) 1ii1 ;基 因片段與質(zhì)粒8iil，在本實施例中，基因片段與質(zhì)粒的摩爾比5 : 1，連接反應(yīng)液在16°C水 浴反應(yīng)8-16h。
[0045] 然后，取連接反應(yīng)液5iU進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗證是否連接成功，驗證成功的將 剩余反應(yīng)液5ill加到100ill的E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞（大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞， 購于天根生化科技（北京）有限公司）中，置于冰上30分鐘，42°C熱激90s，迅速放在冰上 冷卻2min，接著加入無菌的800yl的LB液體培養(yǎng)基，在37°C，160rpm培養(yǎng)lh;然后培養(yǎng)液 在3000rpm離心2min，吸掉700yl的上清液，用移液槍輕輕吹打重懸菌體；然后涂布到含 有50yg/ml氨芐的LB培養(yǎng)基固體平板上，培養(yǎng)12-16h。挑取單菌落打入10ylddH20 (重 蒸水），進(jìn)行菌落PCR(polymerasechainreaction)驗證，篩選出陽性克隆單菌落。菌落 PCR反應(yīng)體系在本實施例中用量為25iU，其中，單菌落懸液liU，r-Taq聚合酶（5U/iU， Takara)0.5iil，dNTPMixture(2.5mMeach，Takara)2iil，10XPCRBuffer2.5iil，引物 丁7(2011]?)和17七61'(2011]\0各0.5111，（1(11120 18111。？〇?驗證條件是：941：預(yù)變性5111111; 94°C變性30s;55°C退火lmin;72°C延伸lmin;30循環(huán)；72°C10min。瓊脂糖凝膠電泳驗證 陽性克隆的單菌落接種到5ml的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12h，取lml送測序同時留樣保存在 15%甘油的EP管中。
[0046] 最后，把重組質(zhì)粒PaCA_pET21a轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞（購于天根生化科 技（北京）有限公司）。在37°C，200rpm培養(yǎng)菌液0D_達(dá)到0. 4-0. 6 ;0D_指的是某種溶液 在600nm波長處的吸光值。然后加入0.ImM的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)，溫度調(diào)至30°C 低溫誘導(dǎo)12h;菌體破壁后去上清液檢測酶活可知是可溶性表達(dá)。
[0047]PaCA粗酶液制備
[0048] 培養(yǎng)基配方
[0049] 種子培養(yǎng)基配方：在每升種子培養(yǎng)基中，酵母提取物（Yeastextract) 5g/L;胰蛋 白胨（作5^1：0116)1(^/1;似〇11(^/1。
[0050] 發(fā)酵培養(yǎng)基配方：在每升發(fā)酵培養(yǎng)基中，（NH4)2S041. 93g/L;MgS04 ? 7H203. 87g/L; KOH2. 5g/L；KH2P0414. 65g/L；Glucose20g/L〇
[0051] 微量元素母液：每升微量元素母液中，F(xiàn)eS04 ? 7H20 2. 8g/L，MnCl2 ? 4H202g/L， CoCl2 ? 2. 8g/L，CuCl2 ? 2H20 0? 2g/L，ZnS04 ? 7H20 0? 3g/L，上述微量元素母液溶于lmol/L HC1。
[0052] 補(bǔ)料：60%葡萄糖，工業(yè)氨水
[0053] 滅菌和接種
[0054] 校正pH和溫度電極的零點(diǎn)和斜率，校正溶氧電極的零點(diǎn)，加入發(fā)酵培養(yǎng)基，定 容至5L，115°C，保壓滅菌20min。開啟循環(huán)水冷卻至100°C以下，開攪拌250rpm，培養(yǎng)基 降溫穩(wěn)定至37°C，開啟氨水自動調(diào)節(jié)pH至7. 0,調(diào)節(jié)壓縮空氣的通氣比為1:1，維持罐壓 0. 045MPa，標(biāo)定溶氧 100 %。
[0055]搖瓶種子液0D_達(dá)到1-2之間時接種，接種量為5 %，添加終濃度100mg/L的氨 芐，按照lml/L比例添加過濾除菌的微量元素母液。
[0056] 過程調(diào)控
[0057] 通過提高轉(zhuǎn)速和通氣量維持D0高于25%，pH用氨水自動調(diào)節(jié)。期間溶氧突 變上升后開始補(bǔ)60 %葡萄糖水溶液，根據(jù)pH和D0變化來調(diào)控補(bǔ)糖速率，當(dāng)0D_增長至 40±2時，降溫穩(wěn)定至30°C后添加終濃度ImMIPTG誘導(dǎo)，在本申請的其它實施例中，穩(wěn)定至 20°C-37°C，均是可溶性表達(dá)，其中可選擇 20°C、25°C、28°C、30°C、32°C、35°C、37°C，其中以 30°C為最優(yōu)選擇。
[0058] 發(fā)酵24h后，0D_趨于穩(wěn)定，降溫至20°C以下，過程中逐步降低通氣和攪拌，放罐 收集菌體。
[0059] 粗酶液制備
[0060]菌體用PB(50mM，pH7. 0)緩沖液清洗兩遍后，加入2:1菌體重量的PB(50mM，pH 7.0)緩沖液重懸菌體，攪拌均勻后用高壓勻漿破碎機(jī)破壁，離心收集上清，加入終濃度1% 的聚乙烯亞胺絮凝攪拌lh，在12000rpm30min離心取上清即得到粗酶液。
[0061] 粗酶液低溫冷凍干燥可得到凍干粉。
[0062] 碳酸酐酶活性檢測
[0063] 根據(jù)Wilbur-Anderson方法檢測碳酸酐酶的水合C02活性，100iiL的酶液（稀釋 至T大于30s)加入到5ml冰浴的Tris-Hcl(20mM，pH8. 3)緩沖液中，再加入1. 5ml冰浴的 飽和C02水溶液開始計時pH從8. 3降到6. 3所需時間，酶活定義為（TfT) /T，I；為不加酶 所需時間，T為加酶所需時間。
[0064]PaCA的熱穩(wěn)定性檢測
[0065] 取10ml上述粗酶液分別放在60°C、70°C和80°C水浴，分別在lh、6h、24h取樣測碳 酸酐酶水合C02活性。以初始的酶活為基準(zhǔn)，測得殘余相對酶活見圖3,可知70°C處理24h 后殘余酶活為60 %，且去除了大量雜蛋白，純度從10 %提高到了 46. 9 %。說明該酶有很好 的溫度穩(wěn)定性，適合應(yīng)用于高溫反應(yīng)。
[0066]PaCA的MDEA耐受性檢測
[0067] 配置不同濃度的MDEA溶液（濃度分別為1M、2M、3M、4M、5M、6M)各100mL，加入 8000U/ml的PaCA，分別混勻靜置24h，48h。通過吸收實驗研究CA對不同濃度MDEA的耐受 性，反應(yīng)器為500ml帶夾套玻璃反應(yīng)器（高徑比為8:1)，反應(yīng)體系為270mL3MMDEA+30ml 靜置處理后的酶混合液，C02通入速率為0. 6L/min(氣石通入），溫度維持在25°C，空白對照 是添加800U/ml未處理的PaCA，在線檢測反應(yīng)過程中體系質(zhì)量的變化，S卩C02的吸收量。測 得lOmin吸收C02速率，如圖4所示，處理24h和48h的C02吸收速率與對照相差不大，說明 該酶對MDEA有比較好的耐受性。
[0068] PaCA促進(jìn)MDEA吸收的檢測試驗
[0069] 反應(yīng)器為500ml帶夾套玻璃反應(yīng)器（高徑比為8:1)，反應(yīng)體系為300ml3MMDEA 添加不同濃度的PaCA，空白對照不加PaCA，C02通入速率為0. 6L/min(氣石通入），反應(yīng)溫 度維持在25°C。在線檢測反應(yīng)過程中體系質(zhì)量的變化，即0)2的吸收量。測得lOmin吸收 C〇2速率，如圖5所示。可知添加酶的C02吸收速率比對照高，且添加800U/ml的酶效果更 好。
[0070]MDEA濃度對PaCA促進(jìn)C02吸收的影響試驗
[0071] 選取800U/mlPaCA分別添加到不同溶度的MDEA中進(jìn)行吸收C02反應(yīng)，反應(yīng)體系為 300ml不同濃度的MDEA加800U/mlPaCA，空白對照不加PaCA，C02通入速率為0. 6L/min(氣 石通入），反應(yīng)溫度維持在25°C。在線檢測C02的吸收量，根據(jù)MDEA與C02吸收比為1: 1， 可計算吸收率a(a=C02吸收量/理論C02吸收量）。計算吸收30min的吸收率作圖得 到圖6?？芍S著MDEA濃度的增大，a越低。用3M的MDEA做吸收反應(yīng)時，加CA的效果最 好。
[0072]PaCA促進(jìn)MDEA吸收混合氣中的C02試驗
[0073]為了模仿捕捉電廠排出來的尾氣，用PaCA和MDEA混合液捕捉混合氣中的C02(15%C02,85%N2)。反應(yīng)體系跟上述一樣，300ml3MMDEA，加上 800U/mlPaCA，在線檢測 C02的吸收量（圖7)，60min內(nèi)加PaCA的C02吸收量和吸收速率比對照高，說明PaCA對捕 捉混合氣中的C02有明顯的促進(jìn)作用。
[0074] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾 也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種熱穩(wěn)定性碳酸酐酶的異源表達(dá)，其特征在于：所述熱穩(wěn)定性碳酸酐酶是 具有如下氨基酸序列的多肽，該氨基酸序列與SEQ ID NO :2的氨基酸序列具有至少 90%同一性。
2. 編碼權(quán)利要求1所述的多肽的基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的熱穩(wěn)定性碳酸酐酶的異源表達(dá)，其特征在于：所述碳酸酐酶的核苷酸序列編碼，實現(xiàn)在大腸桿菌中異源可溶性表達(dá)。
5. 根據(jù)上述權(quán)利要求項1-4中任一項所述的熱穩(wěn)定性碳酸酐酶的應(yīng)用，其特征在于： 所述熱穩(wěn)定性碳酸酐酶應(yīng)用于C02吸收領(lǐng)域。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的熱穩(wěn)定性碳酸酐酶的應(yīng)用，其特征在于：所述C02為氣體形 態(tài)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的熱穩(wěn)定性碳酸酐酶的應(yīng)用，其特征在于：所述熱穩(wěn)定性碳酸 酐酶應(yīng)用于有機(jī)胺C02吸收領(lǐng)域。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的熱穩(wěn)定性碳酸酐酶的應(yīng)用，其特征在于：在添加有所述熱穩(wěn) 定性碳酸酐酶的有機(jī)胺溶液中，C02吸收率隨著有機(jī)胺濃度的增大而減小。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的熱穩(wěn)定性碳酸酐酶的應(yīng)用，其特征在于：所述有機(jī)胺包括有 脂肪胺類、醇胺類、酰胺類、脂環(huán)胺類、芳香胺類或萘系胺類中的一種或幾種組合。
【文檔編號】C12N15/70GK104328105SQ201410531671
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月10日
【發(fā)明者】?？? 余允東, 龍輝, 周曉青, 張燕, 張敏, 汪浩, 陳婷婷 申請人:上海立足生物科技有限公司