一種Aus Man5A-CBM27融合酶的設(shè)計及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種新型地利用計算機技術(shù)與生物信息學(xué)方法對宇佐美曲霉Aus Man5A分子進行理性設(shè)計，并結(jié)合基因工程技術(shù)構(gòu)建一種底物親和力強、催化效率高的AusMan5A-CBM27融合酶的方法，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1，氨基酸序列為SEQ ID NO:2，相應(yīng)的基因命名為man5A-cbm27。本發(fā)明還公開了融合酶工程菌的構(gòu)建以及高效表達(dá)和純化的方法，制備的融合酶具有底物親和力強、催化效率高的特性，具有較大的工業(yè)化應(yīng)用潛力和經(jīng)濟價值。
【專利說明】-種Aus Man5A-CBM27融合酶的設(shè)計及制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及宇佐美曲霉Aus Man5A-CBM27融合酶基因的構(gòu)建和表達(dá)，以及該酶的 性質(zhì)和應(yīng)用研究，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] β -1，4-D-甘露聚糖酶（β -1，4-D-mannan mannohydrolase ;EC 3. 2. 1. 78)，簡稱 β -甘露聚糖酶（β -mannanase)，是指一類能夠水解含有β -1，4-D-甘露糖苷鍵的甘露聚 糖和異甘露聚糖的內(nèi)切水解酶，它在動植物和微生物中均廣泛存在。近年來，β_甘露聚糖 酶在食品、飼料、醫(yī)藥、制漿造紙、石油開采等多種行業(yè)都具有廣泛的應(yīng)用前景，受到很多研 究者的青睞。在食品領(lǐng)域中，β -甘露聚糖酶可用于生產(chǎn)功能性低聚糖，改善人體腸道菌群， 提高人體免疫力；也可以用于啤酒果汁的澄清，酒類釀造，速溶咖啡的生產(chǎn)等。在飼料工業(yè) 中，β -甘露聚糖酶的添加應(yīng)用，可降低甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高飼料的利用率。在造紙 工業(yè)中，β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶等半纖維素降解酶類協(xié)同使用，處理紙漿，能明顯 改善紙質(zhì)。將β_甘露聚糖酶運用紡織印染的漂白工藝中，能有效地去除產(chǎn)品上粘附的多 余染料，更可以減少氯和堿的用量以及它們帶來的環(huán)境污染問題，有利于生態(tài)環(huán)境的保護。 根據(jù)序列同源性和空間結(jié)構(gòu)分析，多數(shù)β -甘露聚糖酶都屬于糖苷水解酶第5、26和113家 族。目前，關(guān)于第5家族β -甘露聚糖酶的報道較多，它們的最適pH值為3. 0?7. 5,最適 溫度在45?92 °C。
[0003] 近年來，隨著對自然界中半纖維素資源的開發(fā)、飼糧中甘露聚糖抗?fàn)I養(yǎng)因子的消 除以及甘露寡糖生理功能的發(fā)現(xiàn)，β-甘露聚糖酶的需求量越來越大，導(dǎo)致對β-甘露聚 糖酶的研究和開發(fā)進入一個新高潮。但目前，已商品化的β_甘露聚糖酶，尤其是國內(nèi)公 司開發(fā)出的一些產(chǎn)品，在酶學(xué)性質(zhì)和生產(chǎn)水平等方面尚存在一定的缺陷，例如較低的底物 親和力和比酶活以及較差的對極端環(huán)境的耐受性等，這些都限制了它們在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛 和有效的應(yīng)用。如何不斷在新發(fā)現(xiàn)的微生物來源β-甘露聚糖酶中改造和篩選出底物親 和力強、比酶活高、極端環(huán)境耐受性好的優(yōu)良酶，并有效地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，已成為現(xiàn)在 面臨的最大挑戰(zhàn)。進入90年代，隨著基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，研究者 越來越注重于酶基因的克隆和表達(dá)以及酶活性位點的研究等方面。目前，雖已有一些有關(guān) β -甘露聚糖酶基因的克隆和表達(dá)的文獻和專利報道，但有關(guān)基于理性設(shè)計的甘露聚糖酶 的分子改造，尤其是關(guān)于融合酶基因設(shè)計和表達(dá)的研究更是鮮有報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種底物親和力強、催化效率高的Aus Man5A-CBM27融合酶 的設(shè)計與制備方法，對原有的宇佐美曲霉Man5A進行了分子改造。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案：將原有的宇佐美曲霉Man5A與海棲熱袍菌β-甘露聚糖酶中 所屬27家族的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBM)融合，構(gòu)建出Aus Man5A-CBM27融合酶，融合 酶的核苷酸序列為SEQ ID N0:1，相應(yīng)的基因命名為man5A-cbm27。
[0006] 所述的融合酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。
[0007] 攜帶有宇佐美曲霉Aus Man5A基因的重組質(zhì)粒pUCm-T-man5A由江南大學(xué)構(gòu)建和 保藏（專利申請?zhí)枺?01010550927. 4)。
[0008] CBM27的基因序列由上海生工合成。
[0009] 所述的融合酶的活性測定方法：
[0010] 于兩個25mL的具塞試管A和B中，分別加入用pH 3. 6、檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖 液配制的質(zhì)量濃度為0. 5%的角豆膠溶液2. 4mL，于50°C恒溫水浴中預(yù)熱IOmin后，在A管 中加入用緩沖液適當(dāng)稀釋的〇. ImL酶液，于50°C中準(zhǔn)確反應(yīng)15min ;立即在A和B兩管中各 加入2. 4mL 3, 5-二硝基水楊酸（DNS)試劑，在B管中再補加0. ImL滅活的酶液，A和B管 同時煮沸7min ;立即冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；以B管為空白對照，于540nm處測定A 管吸光度值，并從甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖（以甘露糖計）含量并折算成酶活 性單位。酶活性單位定義：在本測定條件下，以每分鐘產(chǎn)生1 μ mol還原糖所需的酶量定義 為1個β -甘露聚糖酶活性單位（U)。
[0011] 所述的融合酶的設(shè)計和制備方法：
[0012] (I)CBM27 數(shù)據(jù)庫的建立：基于在 Carbohydrate-Active enZYmes Database (http://www. cazy. org/)中收錄的各種CBM信息，選取CBM27家族（主要與甘露 聚糖結(jié)合）的成員構(gòu)建一個CBM27數(shù)據(jù)庫。
[0013] (2)CBM27進化樹的構(gòu)建：使用ClustalX軟件對構(gòu)建的CBM27數(shù)據(jù)庫中成員的 氨基酸序列進行多序列同源比對并結(jié)合進化樹繪制軟件MEGA4,構(gòu)建CBM27進化樹。其 制作方式為Neighbor-Joining法，計算模型選擇Poisson Correction,制作過程中引入 Bootstrap 檢測（Bootstrap Replications = 10000)以確保較高的可信度。
[0014] (3) CBM27與底物模型分子的分子對接和分子動力學(xué)模擬：根據(jù)CBM27進化樹，從 中選擇多個具有代表性的CBM成員，使用AutoDock 4. 2軟件將它們分別與甘露二糖模型分 子進行分子對接分析，再使用Gromacs 4. 5軟件進行分子動力學(xué)模擬分析，依據(jù)CBM與模型 分子間的結(jié)合模式和結(jié)合力大小，最終選定1個最優(yōu)的CBM即海棲熱袍菌甘露聚糖酶的CBM 融合到Aus Man5A的羧基端。
[0015] (4)融合酶Aus Man5A-CBM27基因的獲得：基于設(shè)計的嵌合酶基因序列，采用重疊 PCR技術(shù)將Aus Man5A與CBM27的基因序列融合。重疊 PCR涉及到的兩對引物分別為：
[0016] AMan5A-Fl: 5，-GAATTCTCCTTCGCCAGCACCTC-3，，
[0017] AMan5A-Rl: 5 ' -GTATCTTGCGCTACCTCCAGGCGGTG-3 '，
[0018] CBM-F2:5，-GGTAGCGCAAGATACGTGTTGGCAG-3，，
[0019] CBM-R2:5 ' -GCGGCCGCCTATGTTCTTTTATAAAGTCTCAC-3 '，
[0020] 先分別PCR合成待融合的上下游片段，將PCR產(chǎn)物分別用1 %的瓊脂糖凝膠電泳 分析，并將目的條帶割膠回收。接著以上下游片段互為引物和模板進行融合酶基因的初步 合成，最后向上述體系中分別加入AMan5A-Fl和CBM-R2引物進行融合酶基因的大量擴增。 用1 %瓊脂糖凝膠電泳將所得的PCR產(chǎn)物進行分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T連接 (pUCm-T-man5A-cbm27)，轉(zhuǎn)化JM109,經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。
[0021] 將測序結(jié)果正確的pUCm-T-man5A-cbm27與pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I和Not I 進行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質(zhì)粒 pPIC9K-man5A_cbm27 (圖I)，并對重組質(zhì)粒進行序列測定。
[0022] (5)GS115/man5A-cbm27的構(gòu)建、表達(dá)、產(chǎn)物純化及性質(zhì)測定：用Sal I對 PPIC9K-man5A-cbm27進行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊進行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的畢 赤酵母重組子GS115/man5A-cbm27 ;按照手冊上的標(biāo)準(zhǔn)流程進行誘導(dǎo)表達(dá)，用DNS法測定融 合酶的甘露聚糖酶活性；發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心、超濾、離子交換層析和凝膠過濾層析，得到電 泳純的融合酶,并測定其活性及酶學(xué)性質(zhì)。
[0023] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種宇佐美曲霉Aus Man5A_CBM27融合酶的設(shè) 計與制備方法。融合酶具有底物親和力強、催化效率高的優(yōu)點，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)、應(yīng)用 潛力和經(jīng)濟價值，為其它β -甘露聚糖酶的研究奠定了理論基礎(chǔ)，同時也為其它蛋白質(zhì)/酶 分子的定向改造提供技術(shù)平臺。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1 :重組質(zhì)粒pPIC9K-man5A_cbm27的構(gòu)建示意圖

【具體實施方式】
[0025] 以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳 細(xì)說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0026] 實施例1融合酶基因及其表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0027] 米用重疊 PCR技術(shù)構(gòu)造融合基因 man5A_cbm27,主要分為四步：以pUCm-T_man5A 為模板，以AMan5A-Fl和AMan5A-Rl為引物進行第一輪PCR，其反應(yīng)條件為：94°C 4min ;30 個循環(huán)（94°C 30s，56°C 30s，72°C 90s)，72°C lOmin，合成待融合的宇佐美曲霉 Aus Man5A 的基因片段；以PMD19-T-CBM27為模板，以CBM-F2和CBM-R2為引物進行第二輪PCR，其反 應(yīng)條件為：94°C 4min ;30 個循環(huán)（94°C 30s，56°C 30s，72°C 40s)，72°C lOmin，合成待融合 的CBM的基因片段。將兩輪PCR產(chǎn)物分別用I %瓊脂糖凝膠電泳進行分析，割膠回收目的 條帶，純化后分別以上述產(chǎn)物互為引物和模板，進行第三輪PCR，其反應(yīng)條件為：94°C 4min ; 10 個循環(huán)（94°C 30s，52°C 30s，72°C 100s)，72°C IOmin ;以第三輪 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物為模 板，以AMan5A-Fl和CBM-R2為引物進行第四輪PCR，反應(yīng)條件為：94°C 4min ;30個循環(huán) (94°C 30s，53°C 30s，72°C 100s)，72°C lOmin。將第四輪PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分 析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接（pUCm-T-man5A-cbm27)，轉(zhuǎn)化JM109,經(jīng)酶切鑒定 正確后送上海生工測序。將測序正確的pUCm-T-man5A-cbm27與pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I 和Not I進行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質(zhì)粒 pPIC9K-man5A_cbm27，并對重組表達(dá)質(zhì)粒進行序列測定。
[0028] 實施例2GS115/man5A-cbm27的構(gòu)建、表達(dá)、產(chǎn)物純化及酶活測定
[0029] 用Sal I對pPIC9K-man5A_cbm27進行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊進行電 轉(zhuǎn)化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/man5A-cbm27。該基因工程菌用1.0% 甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96h，采用DNS法測得發(fā)酵液中甘露聚糖酶活性達(dá)26U/mL。發(fā)酵液經(jīng)離心 后的上清液為融合酶的粗酶液，該粗酶液經(jīng)截留分子量為10, OOODa的超濾膜濃縮，再經(jīng) DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和Sephadex G-75凝膠過濾層析純化，純化后 經(jīng)SDS-PAGE檢測為單一條帶，并顯示融合酶的分子量為60kDa。該融合酶的最適作用溫度 65 °C，最適作用pH 4,該酶在pH 2. 0-9. O、68 °C以下穩(wěn)定。
【權(quán)利要求】
1. 一種底物親和力強、催化效率高的Aus Man5A-CBM27融合酶，其核苷酸和氨基酸序 列分別為：SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2。
2. 融合酶工程菌的構(gòu)建和表達(dá)方法： (1) CBM27 數(shù)據(jù)庫的建立：基于在 Carbohydrate-Active enZYmes Database(http:// www. cazy. org/)中收錄的各種CBM信息，選取CBM27家族（主要是甘露聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域） 的成員構(gòu)建一個CBM27數(shù)據(jù)庫； (2) CBM27進化樹的構(gòu)建：使用ClustalX軟件對構(gòu)建的CBM27數(shù)據(jù)庫中的成員進 行多序列同源比對并結(jié)合進化樹繪制軟件（MEGA4)，構(gòu)建CBM27進化樹。其制作方式為 Neighbor-Joining法，計算模型選擇Poisson Correction，制作過程中引入Bootstrap檢 測（Bootstrap Replications = 10000)以確保較高的可信度； (3) CBM27與底物模型分子的分子對接和分子動力學(xué)模擬：根據(jù)CBM進化樹從CBM27家 族選擇多個具有代表性的CBM，使用AutoDock 4. 2軟件將它們分別與甘露二糖模型分子進 行分子對接分析，再使用Gromacs 4. 5軟件進行分子動力學(xué)模擬分析，依據(jù)CBM與模型分子 間的結(jié)合模式和結(jié)合力大小，最終選定最優(yōu)的CBM即海棲熱袍菌甘露聚糖酶的CBM融合到 Aus Man5A的羧基端； (4) 融合酶基因及其表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：基于上述設(shè)計的融合酶基因序列，用重疊PCR技 術(shù)將Aus Man5A的基因序列與CBM27的核苷酸序列融合，重疊PCR涉及到的兩對引物分別 為： AMan5A-Fl:5' -GAATTCTCCTTCGCCAGCACCTC-3'， AMan5A-Rl:5' -GTATCTTGCGCTACCTCCAGGCGGTG-3'， CBM-F2:5 ' -GGTAGCGCMGATACGTGTTGGCAG-3 '， CBM-R2:5 ' -GCGGCCGCCTATGTTCTTTTATAAAGTCTCAC-3 '， 采用重疊PCR技術(shù)構(gòu)造融合基因man5A-cbm27,主要分為四步：以AMan5A-Fl和 AMan5A-Rl為引物進行第一輪PCR，合成待融合的宇佐美曲霉Aus Man5A的基因片段；以 CBM-F2和CBM-R2為引物進行第二輪PCR，合成待融合的CBM的基因片段；將兩輪PCR產(chǎn)物 分別用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶，分別以上述產(chǎn)物互為引物和模板，進 行第三輪PCR ;以第三輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，分別以AMan5A-Fl和CBM-R2為引物進行第 四輪PCR。將第四輪PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T 連接（pUCm-T-man5A-cbm27)，轉(zhuǎn)化JM109,經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序；將測序正確 的pUCm-T-man5A-cbm27與pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產(chǎn) 物在T4 DNA連接酶的作用下連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-man5A-cbm27,并對重組表達(dá)質(zhì)粒 進行序列測定； (5) GS115/man5A-cbm27的構(gòu)建、表達(dá)、產(chǎn)物純化及性質(zhì)測定：用Sal I對PPIC9K-man5A-cbm27進行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊進行電轉(zhuǎn)化、篩選，得到高拷貝的 畢赤酵母重組子GS115/man5A-cbm27 ;該基因工程菌用1. 0%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96h，采用DNS 法測得發(fā)酵液中甘露聚糖酶活性達(dá)26IU/mL ;發(fā)酵液經(jīng)離心后的上清液為融合酶的粗酶 液，該粗酶液經(jīng)截留分子量為l〇,〇〇〇Da的超濾膜濃縮，再經(jīng)DEAE-S印harose Fast Flow離 子交換層析和S印hadex G-75凝膠過濾層析純化，純化后經(jīng)SDS-PAGE檢測為單一條帶，并 顯示融合酶的分子量為60kDa ;該融合酶的最適作用溫度65°C，最適作用pH 4,該酶在pH 2. 0-9. 0、68 °C 以下穩(wěn)定。
【文檔編號】C12N9/42GK104404015SQ201410758722
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】李劍芳, 王春娟, 董運海, 鄔敏辰, 何瑤, 唐詩涵 申請人:江南大學(xué)