專利名稱：：經修飾的蛋白酶的制作方法
技術領域：
：物中蛋白酶生產的方法。具體地，本發(fā)明涉及改變蛋白酶在微生物(例如芽孢桿菌種)中的表達的方法。本發(fā)明公開了經修飾的多核苷酸、載體、經修^飾的多肽和增強蛋白酶生產的方法。
背景技術：
：微生物，例如是芽孢桿菌屬成員的革蘭氏陽性微生物，已被用于大規(guī)模的工業(yè)發(fā)酵，這部分是因為它們能將其發(fā)酵產物分進其培養(yǎng)基。分泌的蛋白穿過細胞膜和細胞壁被輸出，隨后再釋放進外部培養(yǎng)基。多肽分泌進周質空間或其培養(yǎng)基依賴于多個參數(shù)，在工業(yè)發(fā)酵中需要對它們詳加考慮。事實上，異源多肽的分泌是工業(yè)界廣泛使用的技術。典型地，用編碼待表達且待分泌的目的異源多肽的核酸轉化細胞，以生產大量的想要的多肽。該技術已用于生產大量的多肽。已可通過對編碼想要的蛋白質的多核苷酸進行遺傳操作，來控制想要的多肽的表達和分泌。雖然蛋白質生產方法已有若干*，但是本領域中仍需要提供細胞外蛋白質分泌的有效方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及經修飾的多核苷酸，其編碼經修飾的蛋白酶，本發(fā)明還涉及改變微生物中蛋白酶生產的方法。特別地，本發(fā)明涉及改變蛋白酶在微生物(例如芽孢桿菌種)中的生產的方法。本發(fā)明公開了經修飾的多核苷酸、載體、經修飾的多肽和增強蛋白酶生產的方法。本發(fā)明涉及經過遺傳操作以增強經修飾蛋白質生產的多核苷酸、多肽和細胞。特別地，本發(fā)明涉及具有引入其中的外源核^列的革蘭氏陽性微生物以及在此類宿主細胞(例如芽孢桿菌屬的成員)中生產蛋白質的方法。更具體地，本發(fā)明涉及蛋白酶的生產以及經過遺傳操作從而具有改變的生產表達的蛋白質的能力的細胞。特別地，本發(fā)明提供了微生物對蛋白酶的增強的生產。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了分離的經修飾的多核苷酸，其編碼經修飾的全長蛋白酶，其中，多核苷酸序列中編碼全長前體蛋白酶的前區(qū)域(proregion)的部分包含編碼選自下述位置的至少一處氨基酸位置上的取代的突變，所述位置等同于SEQIDNO:5、13和244的氨基酸位置28-108和109。在一些實施方式中，經修飾的全長蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，其中，多核苷酸序列中編碼全長前體蛋白酶的前區(qū)域的部分包含編碼選自下述位置的至少一處氨基酸位置上的取代的突變，所述位置等同于SEQIDNO:5、13和244的氨基酸位置28-108和109。在其他實施方式中，全長蛋白酶是源于野生型或變體前體堿性絲氨酸蛋白酶的堿性絲氨酸蛋白酶，其中，多核苷酸序列中編碼全長前體蛋白酶的前區(qū)域的部分包含編碼選自下述位置的至少一處氨基酸位置上的取代的突變，所述位置等同于SEQIDNO:5、13和244的氨基酸位置28-108和109。在其它一些實施方式中，全長蛋白酶是源于野生型或變體前體堿性絲氨酸蛋白酶(其是克勞氏芽孢桿菌(B.Clausii)或緩慢葡萄球菌(S.lentus)堿性絲氨酸蛋白酶)的堿性絲氨酸蛋白酶，其中，多核苷酸序列中編碼全長前體蛋白酶的前區(qū)域的部分包含編碼選自下述位置的至少一處氨基酸位置上的取代的突變，所述位置等同于SEQIDNO:5、13和244的氨基酸位置28-108和109。在一些實施方式中，經分離的經j務飾的多核苷酸包含SEQIDNOS:l、9或240所示的多核苷酸序列。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了經分離的經修飾的多核苷酸，其編碼經修飾的全長蛋白酶，其中，多核苷酸序列中編碼全長前體蛋白酶的前區(qū)域的部分包含編碼選自下述位置的至少一處氨基酸位置上的取代的突變，所述位置等同于SEQIDNO:5、13和244的氨基酸位置28-108和109，其中，所述至少一處取代是在選自SEQIDNO:5、13或244的E33、E43、A44、E47、V49、E57、A59、E63、E70、E74、E84和E88的一處氨基酸位置進行的。在其它一些實施方式中，E33的氨基酸取代選自E33D、E33I、E33S、E33N、E33K、E33H、E33Q和E33R。在其它一些實施方式中，E57的氨基酸取代選自E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H和E57N。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了經分離的經修飾的多核苷酸，其包含已被突變?yōu)榫幋a選自下述位置的至少一處氨基酸位置上的取代的前體前序列，所述位置等同于SEQIDNO:5、13或244的氨基酸位置28-108和109。在另外一些實施方式中，經分離的經修飾的多核苷酸還包含編碼包含成熟區(qū)域的全長蛋白酶的多核苷酸，其中，編碼蛋白酶成熟區(qū)域的多核苷酸與SEQIDNOS:8、16或247有至少大約70%同一性。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了包含經修飾的多核苷酸的至少一種載體，所述多核苷酸編碼經千務飾的全長蛋白酶，其中，多核苷酸序列中編碼全長前體蛋白酶的前區(qū)域的部分包含編碼選自下述位置的至少一處氨基酸位置上的取代的突變，所述位置等同于SEQIDNO:5、13和244的氨基酸位置28-108和109，或者，提供了包含經分離的經修飾的多核苷酸的至少一種載體，所述多核苷酸包含已被突變?yōu)榫幋a選自下述位置的至少一處氨基酸位置上的取代的前體前序列，所述位置等同于SEQIDNO:5、13或244的氨基酸位置28-108和109。在其它一些實施方式中，本發(fā)明提供了經包含本發(fā)明的經修飾的多核苷酸的載體轉化的宿主相比。在一些優(yōu)選的實施方式中，經轉化的宿主細胞是微生物。例如，在一些實施方式中，本發(fā)明提供了下述宿主細胞，所述宿主細胞經包含經修飾的下述多核苷酸的至少一種載體轉化，所述多核苷酸編碼經4務飾的全長蛋白酶，其中，多核苷酸序列中編碼全長前體蛋白酶的前區(qū)域的部分包含編碼選自下述位置的至少一處氨基酸位置上的取代的突變，所述位置等同于SEQIDNO:5、13和244的氨基酸位置28-108和109，或者，所述宿主細胞經分離的經l務飾的下述多核苷酸轉化，所述多核苷酸包含已被突變?yōu)榫幋a選自下述位置的至少一處氨基酸位置上的取代的前體前序列，所述位置等同于SEQIDNO:5、13或244的氨基酸位置28-108和109。在一些實施方式中，經本發(fā)明的多核苷酸轉化的宿主細胞是選自芽孢桿菌屬(Bacillussp)、鏈霉菌屬(Streptomycessp.)、埃希氏菌屬(Escherichiasp.)和曲霉屬(Aspergillussp.)構成的組的微生物。在一些其它實施方式中，宿主細胞是枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的經轉化的宿主細胞生產的蛋白酶。本發(fā)明還提供了在微生物中生產異源蛋白酶的方法，其中所述方法包含下述步驟(a)在合適的條件下培養(yǎng)芽孢桿菌宿主細胞，其中，所述芽孢桿菌宿主細胞包含經修飾的多核苷酸，所述多核苷酸編碼經修飾的蛋白酶；以及(b)通過所述微生物來生產蛋白酶。在一些實施方式中，通過芽孢桿菌宿主生產的蛋白酶被回收。本文提供的經修飾的多核苷酸中任何一種都可用于本發(fā)明的方法。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了在微生物中生產異源堿性絲氨酸蛋白酶的方法，其中，所述方法包括下述步驟(a)在合適的條件下培養(yǎng)芽孢桿菌宿主細胞，其中，所述芽孢桿菌宿主細胞包含經修飾的多核苷酸，所述多核苷酸編碼經修飾的蛋白酶；以及(b)通過所迷孩支生物來生產蛋白酶。本發(fā)明還提供了在微生物中生產異源蛋白酶的下迷方法，其中，所述方法包括下述步驟(a)在合適的條件下培養(yǎng)芽孢桿菌宿主細胞，其中，所述芽孢桿菌宿主細胞包含經修飾的多核苷酸，所述多核苷酸編碼經修飾的蛋白酶，所述經修飾的蛋白酶包含與SEQIDNOS:8、16或247有至少大約70%同一性的成熟區(qū)域；以及(b)通過所述微生物來生產蛋白酶。在一些實施方式中，芽孢桿菌宿主生產的蛋白質被回收。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了在微生物中生產異源蛋白酶的下述方法，其中，所述方法包括下述步驟(a)在合適的條件下培養(yǎng)芽孢桿菌宿主細胞，其中，所述芽孢桿菌宿主細胞包含經4務飾的多核苷酸，所述多核苷酸編碼經修飾的蛋白酶，所述經修飾的蛋白酶包含下述前區(qū)域，所述前區(qū)域包含編碼選自下述位置的至少一處氨基酸位置上的取代的突變，所述位置等同于SEQIDNO:5、13或244的氨基酸位置28-108和109;以及(b)通過所述微生物來生產蛋白酶。在其它一些實施方式中，所述至少一處氨基酸取代選自E33D、E33I、E33S、E33N、E33K、E33H、E33Q、E33R、E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H和E57N。本發(fā)明還提供了在微生物中生產是克勞氏芽孢桿菌或遲緩芽孢桿菌(B.lentus)蛋白酶的異源蛋白酶的方法，其中，所述方法包括下述步驟:(a)在合適的條件下培養(yǎng)芽孢桿菌宿主細胞，其中，所述芽孢桿菌宿主細胞包含經修飾的多核苷酸，所述多核苷酸編碼經修飾的蛋白酶；以及(b)通過所述微生物來生產蛋白酶。本發(fā)明還提供了在微生物中生產異源蛋白酶的下述方法，其中，所述方法包括下述步驟(a)在合適的條件下培養(yǎng)選自地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(B.Amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪桿菌(B.stearothermophilus)、克勞氏芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、耐鹽芽孢桿菌(B.halodurans)、凝固芽孢桿菌(B.coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)和蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)的芽孢桿菌宿主細胞，其中，所述芽孢桿菌宿主細胞包含經修飾的多核苷酸，所述多核苷酸編碼經修飾的蛋白酶；以及(b)通過所述微生物來生產蛋白酶。在一些實施方式中，所述宿主細胞是枯草芽孢桿菌宿主細胞。本發(fā)明還提供了在樣史生物中生產異源蛋白的下述方法，其中，所述方法包括下述步驟(a)在合適的條件下培養(yǎng)芽孢桿菌宿主細胞，其中，所述芽孢桿菌宿主細胞包含經修飾的多核苷酸，所述多核苷酸編碼經修飾的蛋白酶；以及(b)通過所述微生物來生產蛋白酶，并且，其中，所述異源蛋白酶展示出至少1的生產比例。附圖簡述圖1A顯示了來自克勞氏芽孢桿菌的野生型蛋白酶的全長多核苷^列(SEQIDNO:l)。該序列中編碼蛋白酶的前區(qū)域的部分以粗體字母顯示。圖1B、C和D顯示了多核苦酸序列(SEQIDNO:2、3和4)，它們分別編碼SEQIDNO:5的全長克勞氏芽孢桿菌蛋白酶的信號肽(SEQIDNO:6)、前區(qū)域(SEQIDNO:7)和成熟形式(SEQIDNO:8)。圖2A顯示了來自克勞氏芽孢桿菌的野生型蛋白酶的全長多肽序列(SEQIDNO:5)。該序列中編碼蛋白酶的前區(qū)域的部分以粗體字母顯示。圖2B、C和D顯示了分別編碼SEQIDNO:5的全長克勞氏芽孢桿菌蛋白酶的信號肽(SEQIDNO:6)、前區(qū)域(SEQIDNO:7)和成熟形式(SEQIDNO:8)的多肽序列。圖3A顯示了來自克勞氏芽孢桿菌的變體蛋白酶V049的全長多核苷酸序列(SEQIDNO:9)。該序列中編碼蛋白酶的前區(qū)域的部分以粗體字母顯示。圖3B、C和D顯示了多核苷酸序列(SEQIDNO:10、11和12)，它們分別編碼SEQIDNO:13的全長變體克勞氏芽孢桿菌蛋白酶的信號肽(SEQIDNO:14)、前區(qū)域(SEQIDNO:15)和成熟形式(SEQIDNO:16)。圖4A顯示了來自克勞氏芽孢桿菌的變體蛋白酶V049的全長多肽序列(SEQIDNO:13)。該序列中編碼蛋白酶的前區(qū)域的部分以粗體字母顯示。圖4B、C和D顯示了分別編碼SEQIDNO:13的全長變體克勞氏芽孢桿菌蛋白酶的信號肽(SEQIDNO:14)、前區(qū)域(SEQIDNO:15)和成熟形式(SEQIDNO:16)的多肽序列。圖5顯示了對SEQIDNO:5的克勞氏芽孢桿菌野生型絲氨酸蛋白酶、SEQIDNO:13的克勞氏芽孢桿菌變體絲氨酸蛋白酶和SEQIDNO:244的遲緩芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列的比對。氨基酸的區(qū)別被下劃線示出。圖6提供了包含SEQIDNO:9的變體絲氨酸蛋白酶的pXX-049質粒載體的圖譜。圖7A-D顯示了用于本發(fā)明的pXX-049質粒載體的多核苷酸序列(SEQIDNO:17)。圖8A顯示了來自遲緩芽孢桿菌的蛋白酶的全長多核苷酸序列(SEQIDNO:240)。該序列中編碼蛋白酶的前區(qū)域的部分以粗體字母顯示。圖8B、C和D顯示了多核苷酸序列(SEQIDNO:241、242和243)，它們分別編碼SEQIDNO:244的遲緩芽孢桿菌前體蛋白酶的信號肽(SEQIDNO:245)、前區(qū)域(SEQIDNO:246)和成熟形式(SEQIDNO:247)。圖9A顯示了來自克勞氏芽孢桿菌的變體蛋白酶GG36的全長多肽序列(SEQIDNO:244)。該序列中編碼蛋白酶的前區(qū)域的部分以粗體字母顯示。圖9B、C和D顯示了分別編碼SEQIDNO:244的全長遲緩芽孢桿菌蛋白酶的信號肽(SEQIDNO:245)、前區(qū)域(SEQIDNO:246)和成熟形式(SEQIDNO:247)的多肽序列。發(fā)明描述本發(fā)明涉及經修飾的多核苷酸，其編碼經修飾的蛋白酶，本發(fā)明還涉及改變微生物中蛋白酶生產的方法。特別地，本發(fā)明涉及改變蛋白酶在微生物(例如芽孢桿菌的種)中的表達的方法。本發(fā)明公開了經修飾的多核苷酸、載體、經修飾的多肽和增強蛋白酶生產的方法。本發(fā)明提供了經修飾的多核苷酸，其編碼具有經突變的前區(qū)域的蛋白于生產它們的方法。經修飾的蛋白酶多核苷酸適于在微生物中表達經修飾的蛋白酶以及以比相應前體蛋白酶更高的水平對成熟形式進行加工。產生的蛋白酶可用于對適用于多種工業(yè)(包括但不限于:清潔、動物飼料和紡織品加工工業(yè))的酶的工業(yè)生產。本發(fā)明還提供了生產這些酶的手段。在一些優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的蛋白酶是純的或相對純的形式。除非另有指明，本發(fā)明的實踐涉及分子生物學、微生物學、蛋白質純化、蛋白質工程、蛋白質和DNA測序以及重組DNA領域通常所用的常規(guī)技術，它們在本領域技術范圍內。此類技術是本領域技術人員已知的，它們被描述于大量的教材和參考文獻中(見，例如Sambrooketal.，"MolecularCloning:ALaboratoryManual",SecondEdition(ColdSpringHarbor)，1989]和Ausubeletal""CurrentProtocolsinMolecularBiology"[1987)。本文中(包括上文和下文中)提到的所有專利、專利申請、文章和出版物都通過引用明確并入本文。除非另有指明，本文使用的所有技術和科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常的理解相同的含義。例如，SingletonandSainsbury,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology,2dEd.，JohnWileyandSons,NY(1994);和HaleandMarkham，TheHarperCollinsDictionaryofBiology,HarperPerennial,NY(1991)為本領域技術人員提供了本發(fā)明所用的很多術語的一般性詞典解釋。雖然與本文的描述相似或等同的任何方法和材料都可用于本發(fā)明的實施，但本文描述了優(yōu)選的方法和材料。因此，通過參考說明書整體能更完整地理解下文即將定義的術語。此外，在本文中使用時，除非上下文另有清楚指示，單數(shù)術語"一個/種"和"這個/種"("a"、"an"和"the")也包括復數(shù)指代。數(shù)值范圍包括界定該范圍的數(shù)字。除非另有指明，分別地，核酸是按照5，至3，的方向從左到右書寫的；氨基酸是按照氨基到羧基的方向從左到右書寫的。應當理解，本發(fā)明并不限于所述的特定的方法、方案和試劑，它們可4艮據(jù)本領域技術人員使用它們的背景而有所改變。此外，本文提供的標題并非是對本發(fā)明的多個方面或實施方式的限制，它們可參照說明書整體而得到。因此，通過參考說明書整體能更完整地理解下文即將定義的術語。但是，為了協(xié)助理解本發(fā)明，下文定義了多個術語。定義"經修飾的蛋白酶"是具有下述氨基酸序列的全長蛋白酶，所述氨基酸序列源于全長"前體蛋白酶"的氨基酸序列。前體蛋白酶也可被稱為"未經修飾的蛋白酶"。經修飾的蛋白酶在前區(qū)域與其前體蛋白酶有所不同。前體蛋白酶可以是天然存在的，即野生型的蛋白酶，或者其可以是變體蛋白酶。野生型或變體蛋白酶的前區(qū)域經過修飾，以產生經修飾的蛋白酶。經修飾的蛋白酶的氨基酸序列被認為是通過對前體氨基酸序列的前區(qū)域中一個或多個氨基酸的取代、缺失或插入而"源于"所述前體蛋白酶氨基酸序列。在一些優(yōu)選的實施方式中，前體蛋白酶的前區(qū)域的一個或多個氨基酸被取代，以產生經修飾的蛋白酶。此類修飾是對編碼前體蛋白酶氨基酸序列的"前體DNA序列，，的修飾，而非對前體蛋白酶本身進行的操作。本文中，經修飾的蛋白酶包括在前體蛋白酶的前區(qū)域的任何一處氨基酸殘基處用19種天然存在的氨基酸中的任何一種進行的取代。在本文上下文中，"經修飾的"和"前體"蛋白酶都是包含信號肽、前區(qū)域和成熟區(qū)域的全長蛋白酶。編碼經修飾的序列的多核苷酸被稱為"經修飾的多核苷酸"，編碼前體蛋白酶的多核苷酸被稱為"前體多核普酸"。"前體多肽，，和"前體多核苷酸"可分別互換地稱作"未經修飾的前體多肽"或"未經修飾的前體多核苷酸"。"天然存在的，，或"野生型"指具有與自然界中所發(fā)現(xiàn)的相同的未經修飾的氨基酸序列的蛋白酶或編碼所述蛋白酶的多核苷酸。天然存在的酶包括天然的酶，即在特定^L生物中天然表達或發(fā)現(xiàn)的那些酶。野生型的或天然存在的序列指變體所源自的序列。野生型序列可編碼同源或異源蛋白質。在本文中使用時，"變體"指通過在C-末端和N-末端中任一或兩者添加一個或多個氨基酸，在氨基酸中的一個或多個不同位點取代一個或多個氨基酸，在蛋白質的任一末端或兩個末端或氨基酸序列的一個或多個位點缺失一個或多個氨基酸，和/或在氨基酸序列的一個或多個位點插入一個或多個氨基酸，而與其相應野生型蛋白質有所不同的前體蛋白質。本發(fā)明上下文中，通過克勞氏芽孢桿菌蛋白酶V049(SEQIDNO:13)來示例變體蛋白質，其是天然存在的蛋白質Maxacal(SEQIDNO:5)的變體。變體的前體蛋白可以是野生型或變體蛋白。在本文中使用時，"等同于"指蛋白質或肽的列舉的位置上的殘基或者與蛋白質或肽的列舉殘基類似、同源或相應的殘基。在提到蛋白酶時，術語"生產"包括對全長蛋白酶的兩個加工步驟，包括:l.除去信號肽，這已知在蛋白質分泌期間發(fā)生，和2.除去前區(qū)域，這產生了酶的活性成熟形式，并且已知在成熟過程期間發(fā)生(Wangetal.，Biochemistry37:3165-3171(1998);Poweretal"ProcNatlAcadSciUSA83:3096-3100(1986))。在提到成熟蛋白酶時，術語"經加工的"指全長蛋白質(例如蛋白酶)所經歷以成為活性成熟酶的成熟過程。術語"活性比例，，和"生產比例"可互換使用，用于表示從經修飾的蛋白酶加工的成熟蛋白酶的酶促活性與從未經修飾的蛋白酶加工的成熟蛋白酶的酶促活性之比。術語"全長蛋白質，，在本文中表示基因的一級基因產物，其包含信號肽、前序列和成熟序列。術語"信號序列"或"信號肽"指可參與蛋白質的成熟或前體形式分泌的核苷酸和/或氨基酸的任何序列。信號序列的該定義是功能性定義，其意欲包括參與實現(xiàn)蛋白質分泌的蛋白質基因N-末端部分編碼的所有那些氨基酸序列。術語"前序列"或"前區(qū)域"是信號序列和成熟序列之間的氨基*列，其對于蛋白酶的分泌/生產來說是必要的。將前序列切割掉將產生成熟活性蛋白酶。舉例而言，本發(fā)明的蛋白酶的前區(qū)域至少包括與SEQIDNO:5、13或244的28-111位殘基相同的氨基酸序列。術語"成熟形式"或"成熟區(qū)域，，指蛋白質的最終功能性部分。舉例而言，本發(fā)明的蛋白酶的成熟形式至少包括與SEQIDNO:5、13或244的112-380位殘基相同的氨基酸序列。在本文上下文中，"成熟形式""加工自"全長蛋白酶，其中，對全長蛋白酶的加工包括除去信號肽和除去前區(qū)域。在本文中使用時，術語"異源蛋白"指不在宿主細胞中天然存在的蛋白質或多肽。相似地，"異源多核苷酸"指不在宿主細胞中天然存在的多核苷酸。在本文中使用時，"同源蛋白"指在細胞中是天然的或天然存在的蛋白質或多肽。相似地，"同源多核苷酸"指在細胞中是天然的或天然存在的多核苷酸。在本文中使用時，術語"啟動子"指指導下游基因轉錄的核酸序列。在一些優(yōu)選的實施方式中，啟動子適合于其中將要表達靶基因的宿主細胞。啟動子與其它轉錄和翻譯調控核酸序列(也稱為"控制序列，，)一起，是表達給定基因所必需的。通常，轉錄和翻譯調控序列包括但不限于:啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強子或活化序列。當核酸相對另一核酸序列以功能性關系放置時，其被稱為"有效連接的"。例如，如果啟動子或增強子能影響編碼序列的轉錄，它們就是與編碼序列有效連接的；或者，如果核糖體結合位點被放置為能協(xié)助翻譯，它就是與編碼序列有效連接的。通常，"有效連接的"指相連的DNA序列是毗鄰的。在本文中使用時，術語"蛋白酶"和"蛋白水解活性"指展示出能水解肽或具有肽鍵的底物的能力的蛋白質或肽。已有很多公知方法用于測量蛋白質水解活性(Kalisz，"MicrobialProteinases,"In:Fiechter(ed.)，AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,[1988)。例如，可通過比較檢驗(分析產生的蛋白酶水解商業(yè)底物的能力)來確定蛋白水解活性?？捎糜诖祟惖鞍酌富虻鞍姿饣钚苑治鲋械氖纠缘孜锇ǖ幌抻?二甲基酪蛋白(SigmaC-9801)、牛膠原蛋白(SigmaC-9879)、牛彈性蛋白(SigmaE-1625)和牛角蛋白(ICNBiomedical902111)。利用這些底物的比色檢驗是本領域公知的(見，例如，WO99/34011和美國專利號6,376,450，它們都通過引用并入本文)。AAPF檢驗(見，例如DelMaretal.，Anal.Biochem"99:316-3201979)也可用于測定成熟蛋白酶的生產。該檢驗測量該酶水解可溶的合成底物一一琥珀酰丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對硝基苯胺(sAAPF-pNA)時釋放對硝基苯胺的速率。在分光光度計上于410urn測量從水解反應產生黃色的速率，其與活性酶濃度成比例。在本文中使用時，"芽孢桿菌屬"包括本領域技術人員已知的"芽孢桿菌"屬中的所有種，其包括但不限于，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、凝固芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、-爛芽孢桿菌(B.lautiis)和蘇云金芽孢桿菌。應當認識到，芽孢桿菌屬還將繼續(xù)經歷分類重構。因此，該屬包括已經被重新分類的物種，這包括但不限于嗜熱脂肪桿菌等生物，其現(xiàn)在被稱為"Geobacillusstearothermophilus，，。存在氧時產生抗性內生孢子被認為是芽孢桿菌屬的界定特征，雖然該特征也適用于近來命名的脂環(huán)酸桿菌屬(Alicyclobacillus)、雙芽孑包桿菌屬(Amphibacillus)、Aneurinibacillus、Anoxybacillus、Brevibacillus、Filobacillus、Gracilibacillus、Halobacillus、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、Salibacillus、熱桿菌屬(Thermobacillus)、Ureibacillus和Virgibacillus。術語"多核苷酸"和"核酸"在本文中可互換使用，它們指任何長度的核苷酸聚合形式。這些術語包括但不限于，單鏈DNA、雙鏈DNA、基因組DNA、cDNA或包含嘌呤和嘧咬堿基或其它天然的、經化學修飾的、經生化修飾的、非天然的或衍生的核苷酸堿基的聚合物。多核苷酸的非限制性例子包括基因、基因片段、染色體片段、ESTs、外顯子、內含子、mRNA、tRNA、rRNA、核糖體、cDNA、重組多核苷酸、帶分支的多核苷酸、質粒、載體、任何序列的經分離DNA、任何序列的經分離RNA、核酸探針和引物。在本文中使用時，術語"DNA構建體"和"轉化DNA"可互換使用，以表示用于將序列引入宿主細胞或生物的DNA。DNA可通過PCR或本領域技術人員已知的任何其它合適技術體外產生。在一些特別優(yōu)選的實施方式中，DNA構建體包含目的序列(例如，經修飾的序列)。在一些實施方式中，所述序列與另外的元件，例如，控制元件(例如啟動子等)有效連接。在一些實施方式中，DNA構建體包含與宿主細胞染色體同源的序列。在其它一些實施方式中，DNA構建體包含非同源序列。一旦DNA構建體被體外裝配，其即可用于突變宿主細胞染色體的區(qū)域(即，用異源序列代替內源序列)。在本文中使用時，術語"載體"指設計來向一種或多種細胞類型中引入核酸的多核苷酸構建體。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體和質粒。在一些實施方式中，多核苷酸構建體包含編碼全長蛋白酶的DNA序列(例如，經修飾的蛋白酶或未經修^飾的前體蛋白酶)。在本文中使用時，術語"質粒"指用作為克隆載體的環(huán)狀雙鏈(ds)DNA構建體，其在一些真核生物或原核生物中形成染色體外的自主復制遺傳元件，或整合進宿主染色體。在本文中使用時，在向細胞中引入核,列的上下文中，術語"引入，，表示適用于將核酸序列轉入細胞的任何方法。用于引入的此類方法包括但不限于原生質體融合、轉染、轉化、接合和轉導(見，例如，F(xiàn)errarietal.，"Genetics,"inHardwoodetal，(eds.)，Bacillus.PlenumPublishingCorp.,pages57-72，1989)。在本文中使用時，術語"經轉化的"和"穩(wěn)定轉化的"指這樣的細胞，它們具有整合進其基因組中的或作為保持了至少兩代的游離型質體存在的非天然(異源)多核苷酸序列。本發(fā)明提供了經分離的經修飾的編碼氨基,列的多核苷酸，其編碼經修飾的蛋白酶。通過對前體蛋白酶的多核苷酸序列加以突變，獲得經修飾的蛋白酶。具體地，對編碼前體蛋白酶的前區(qū)域的多核苷酸序列進行一處或多處突變，以提供本發(fā)明的經修飾的多核苷酸。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及經修飾的多核苷酸，其編碼經修飾的蛋白酶，本發(fā)明還涉及改變微生物中蛋白酶生產的方法。特別地，本發(fā)明涉及改變蛋白酶在微生物(例如芽孢桿菌屬的種)中的表達的方法。本發(fā)明公開了經修飾的多核苷酸、載體、經4務飾的多肽和增強蛋白酶生產的方法。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了編碼經修飾的蛋白酶的經修飾的多核苷酸，所述經修飾的蛋白酶源于動物、植物或微生物來源的野生型或變體前體蛋白酶。編碼源于微生物的前體蛋白酶的多核苷酸是優(yōu)選的，其包含編碼野生型前體蛋白酶和變體前體蛋白酶(源于野生型形式)的多核苷酸。在一些實施方式中，本發(fā)明的經修飾的多核苷酸源于編碼微生物來源的前體蛋白酶的多核苷酸。本發(fā)明還包括源于編碼蛋白工程化的前體的多核苷酸的、編碼經修飾蛋白酶的多核苷酸。編碼絲氨酸蛋白酶的多核苷酸是優(yōu)選的前體蛋白酶多核苷酸，其中堿性微生物蛋白酶多核苷酸是特別優(yōu)選的。絲氨酸蛋白酶是催化其中在活性位點有關鍵絲氨酸殘基的肽鍵水解的酶。絲氨酸蛋白酶具有大約25,000至30,000范圍內的分子量(見Priest，Bacteriol.Rev.，41:711-1977)。在一些優(yōu)選的實施方式中，編碼枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)和枯草桿菌蛋白酶變體的多核苷酸是優(yōu)選的前體絲氨酸蛋白酶多核苷酸。在一些實施方式中，本發(fā)明包括編碼經修飾的蛋白酶的下述多核苷酸，它們源于^L生物，例如地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌和耐鹽芽孢桿菌的多核苷酸。編碼枯草桿菌蛋白酶的多種芽孢桿菌多核苷酸已被鑒定和測序，例如，枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶BPN，、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶309(見，例如EP414279B;WO89/06279和Stahletal"J.Bacteriol"159:811-818[1984，它們每篇都通過引用整體并入本文)。在本發(fā)明的一些實施方式中，突變體(例如變體)蛋白酶多核苷酸作為編碼本發(fā)明的經修飾的蛋白酶所源自的蛋白質的前體多核苷酸。多篇參考文獻提供了變體蛋白酶的例子(見，例如，WO99/20770;WO99/20726;WO99/20769;WO89/06279;RE34,606;美國專利號4,914,031;美國專利號4,980,288;美國專利號5,208,158;美國專利號5,310,675;美國專利號5,336,611;美國專利號5,399,283;美國專利號5，441，882;美國專利號5,482,849;美國專利號5,631，217;美國專利號5,665,587;美國專利號5,700,676;美國專利號5,741，694;美國專利號5，858，757;美國專利號5,880,080;美國專利號6，197，567和美國專利號6,218,165;它們每篇都通過引用整體并入本文)。在其它一些實施方式中，本發(fā)明所包括的多核苷酸包括:源于編碼可商業(yè)獲得的蛋白酶的多核苷酸的經修飾的多核苷酸。例如，可商業(yè)獲得的蛋白酶包括但不限于ALCALASETM、SAVINASETM、PRIMASETM、DURALASEtm、ESPERASEtm和KANNASEtm(NovoNordiskAJS)、MAXATASEtm、MAXACAL頂、MAXAPEMTM、PROPERASETM、PURAFECTtm和PURAFECTOXPTM(GenencorInternationalInc.)。在一些實施方式中，本發(fā)明包括源于編碼來自克勞氏芽孢桿菌的前體蛋白酶的多核苷酸的經修飾的多核苷酸。在其它一些實施方式中，本發(fā)明包括源于編碼來自遲緩芽孢桿菌的前體蛋白酶的多核苷酸的經修飾的多核苷酸。在一些實施方式中，本發(fā)明的經修飾的全長多核苷酸包含編碼已突變的前體蛋白酶前區(qū)域的序列。編碼任何合適的前體蛋白酶的前區(qū)域的多核苷酸序列可用于產生本發(fā)明的一種或多種經修飾的多核苷酸。在一些優(yōu)選的實施方式中，前體多核苷酸序列的編碼前區(qū)域的部分被突變，以編碼位于下述位置的一處或多處氨基酸取代，所述位置等同于SEQIDNO:5、13或244的1-109位。在一些實施方式中，經修飾的前體多核苷酸編碼前區(qū)域中位于下述位置的至少一處氨基酸取代，所述位置等同于SEQIDNO:5、13或244的E33、E43、A44、E47、V49、E57、A59、E63、E70、E74、E84和E88。在一些實施方式中，編碼等同于E33的位置處的氨基酸的多核苷酸序列被突變?yōu)榫幋a取代E33D、E33I、E33S、E33N、E33K、E33H、E33Q或E33R中的至少一種。在一些其它實施方式中，編碼等同于E57的位置處的氨基酸的多核苷酸序列被突變?yōu)榫幋a取代E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H和/或E57N之一。在一些實施方式中，前體克勞氏芽孢桿菌蛋白酶多核苷酸(例如SEQIDNO:l)編碼野生型蛋白酶(MAXACALtm;SEQIDNO:5)。(SEQIDNO:l)ATGAAGAAACCGTTGGGGAAAATTGTCGCAAGCACCGCACTACTCATTTCTGTTGCT丌TAGTTCATCGATCGCATCGGCTGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAG丌TGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGMGTCGAAATTGAATTGCTTCATGAATTTGAAACGATTCCTGTTTTATCCGTTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGCTTGAACTCGATCCAGCGATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATGGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTA丌TCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCTGGGACGATTGCTGCTTTAAACAA丌CGA丌GGCGTTCTTGGCGTAGCACCGAACGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGMCAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGGAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCGGCAACACGCTAA(SEQIDNO:5)MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAA圓SIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLWAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIR亂KNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR在其它一些實施方式中，前體克勞氏芽孢桿菌蛋白酶多核苷酸(例如SEQIDNO:9)編碼變體蛋白酶(例如，SEQIDNO:13)(SEQIDNO:13)VRSKKLWIVASTALUSVAFSSSIASAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPMHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAA圓SIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNVMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLWAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR在其它實施方式中，前體蛋白酶多核苷酸是遲緩芽孢桿菌的多核苷酸(例如SEQIDNO:240)，其編碼SEQIDNO:244的蛋白酶GG36。(SEQIDNO:240)TGCAACTCGT(SEQIDNO:244)MRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVE舊LLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLWAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIR眺K眼TSLGSTNLYGSGLVNAEAATR在一些實施方式中，本發(fā)明提供了源于SEQIDNO:9的全長前體多核苷酸的經修飾的全長多核苷酸。(SEQIDNO:9)GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCGTCGCGTCGACCGCACTACTCATTTCTGTTGCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCTGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTTGAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATGGCGCAATCGGTACCATGGGGAATTAGCCGTGTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCTGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCACCGAACGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGTTATGCACGTTGCTAAT丌GAGTTTAGGACTGCAGGCACCMGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGCCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCGGCAACACGTTAASEQIDNO:9的多核苷醋列包含序列(SEQIDNO:IO),當其表達時，被用來編碼信號序列肽(SEQIDNO:14),其跨越SEQIDNO:13的l-27位氨基酸；N-末端前序列(SEQIDNO:ll)，其編碼前區(qū)域序列(SEQIDNO:15)，其跨越SEQIDNO:13的28-111位氨基酸殘基；以及成熟的絲氨酸蛋白酶序列(SEQIDNO:12)，其編碼SEQIDNO:13的112-380位氨基酸殘基(即，SEQIDNO:16)。編碼SEQIDNO:13的蛋白酶的信號肽的前8個氨基酸的多核苷酸序列是編碼枯草芽孢桿菌AprE蛋白酶的前8個氨基酸的序列。(SEQIDNO:10)GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCGTCGCGTCGACCGCACTACTCATTTCTGTTGCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCT(SEQIDNO:15)AEEAKEKYUGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISY舊EDAEVTTM(SEQIDNO:14)VRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASA(SEQIDNO:ll)GCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTMTTGGC丌TAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGT丌GTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGGATGTGGACGCGCTTGAACTCGATCCAGCGATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATG(SEQIDNO:12)GCGCAATCGGTACCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCTGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCACCGAACGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGTTATGCACGTTGCTAATTTGAGT丌AGGACTGCAGGCACCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGGAA丌CAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCGGCAACACGTTAA(SEQIDNO:16)AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNVMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLWAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR在其它一些實施方式中，本發(fā)明提供了源于SEQIDNO:l的野生型全長前體多核苷酸的經^"飾的全長多核苷酸。SEQIDNO:l的多核苷酸包含:序列SEQIDNO:2，當表達時，其用于編碼信號序列肽(SEQIDNO:6)，其編碼SEQIDNO:5的1-27位氨基酸；N-末端前序列(SEQIDNO:3),其編碼SEQIDNO:5的28-111位氨基酸殘基(即，SEQIDNO:7)和野生型成熟絲氨酸蛋白酶序列(SEQIDNO:4)，其編碼SEQIDNO:5的112-380位氨基酸殘基(即，SEQIDNO:8)。(SEQIDNO:2)ATGAAGAAACCGTTGGGGAAAATTGTCGCAAGCACCGCACTACTCATTTCTGTTGCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCT(SEQIDNO:6)MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA(SEQIDNO:3)GCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGT丌GTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGCGACAATG(SEQIDNO:7)AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTM(SEQIDNO:4)GCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATA丌CGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCTGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCACCGAACGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACG丌GCTACCGGCCCG丌ATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGAC丌GTCAATGCAGAAGCGGCAACACGCTAA(SEQIDNO:8)RVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLWAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR在其它一些實施方式中，本發(fā)明提供了源于SEQIDNO:240的變體全長前體多核苷酸的經4務飾的全長多核普酸。SEQIDNO:240的多核苷酸包含:SEQIDNO:241的序列，當表達時，其用于編碼信號序列肽(SEQIDNO:245)，編碼SEQIDNO:244的1-27位氨基酸；N-末端前序列(SEQIDNO:242)，其編碼SEQIDNO:244的28-111位氨基酸殘基(即，SEQIDNO:246);和野生型成熟絲氨酸蛋白酶序列(SEQIDNO:243)，其編碼SEQIDNO:244的112-380位氨基酸殘基(即，SEQIDNO:247)。編碼SEQIDNO:244的前體蛋白酶的信號肽的前8個氨基酸的多核苷*列是編碼枯草芽孢桿菌AprE蛋白酶的前8個氨基酸的序列。前體GG36的前蛋白和成熟部分由GG36野生型序列編碼。(SEQID脆241)CGATCGCATCGGCT(SEQIDNO:245)MRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASA(SEQIDNO:242)CTCGATCCAGCGATTTCTTATA丌GAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATG(SEQIDNO:246)AEEAKEKYUGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTM(SEQIDNO:243)CTGCAACTCGTTA(SEQIDNO:247)AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSS1AQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLWAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR在一些優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的經修飾的全長多核苷酸包含編碼已被突變的前體蛋白酶前區(qū)域的序列。編碼任何合適的前體蛋白酶的前區(qū)域的多核苷酸序列可用于產生本發(fā)明的一種或多種經修飾的多核苷酸。在一些優(yōu)選的實施方式中，前體多核苷酸序列的編碼前區(qū)域的部分被突變，以編碼位于下述位置的一處或多處氨基酸取代，所述位置等同于SEQIDNO:13的蛋白酶的1-109位。在其它一些實施方式中，在等同于SEQID25NO:5的蛋白酶的1-109位的位置進行取代。在其它一些實施方式中，在等同于SEQIDNO:244的蛋白酶的1-109位的位置進行取代。在一些實施方式中，經修飾的前體多核苷酸編碼位于下述位置的至少一處氨基酸取代，所述位置等同于SEQIDNO:5、13或244的E33、E43、A44、E47、V49、E57、A59、E63、E70、E74、E84和E88。在一些實施方式中，編碼等同于E33的位置的氨基酸的多核苷酸序列被突變，以編碼取代E33D、E33I、E33S、E33N、E33K、E33H、E33Q或E33R中的至少一種。在一些其它實施方式中，編碼等同于E57的位置的氨基酸的多核苷酸序列被突變，以編碼取代E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H和/或E57N中的一種。如上文所討論的，在一些實施方式中，編碼任何前體蛋白酶的多核苷酸被突變，以產生至少一種經^"飾的多核苷酸，其編碼具有突變的前區(qū)域的至少一種經修飾的蛋白酶。在一些特別優(yōu)選的實施方式中，編碼絲氨酸蛋白酶的全長多核苷酸可用于產生本發(fā)明的經修飾的多核苷酸。在一些備選的特別優(yōu)選的實施方式中，可使用編碼堿性絲氨酸蛋白酶的全長多核苷酸。如上文所討論的，編碼前體蛋白酶的多核苷酸來自微生物，包括但不限于:地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌和耐鹽芽孢桿菌。本發(fā)明提供了任何一種。在一些實施方式中，編碼全長經修飾蛋白酶的本發(fā)明的經修飾的多核苷酸包含編碼蛋白酶的成熟形式的序列，所述成熟形式與前體蛋白酶的成熟形式的氨基酸序列有至少大約65%的氨基酸序列同一性，優(yōu)選至少大約70%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約75%的氨基酸序列同一性，還更優(yōu)選至少大約80%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約85%的氨基酸序列同一性，進一步更優(yōu)選至少大約卯％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約92%的氨基#列同一性，還更優(yōu)選至少大約95%的氨基#列同一性，更優(yōu)選至少大約97%的氨基酸序列同一性，還更優(yōu)選至少大約98%的氨基酸序列同一性，以及最優(yōu)選至少大約99%的氨基酸序列同一性，并且較之前體多肽而言具有相當?shù)幕蛟鰪姷纳a活性。在一些實施方式中，熟形式的序列，所述成熟形式與SEQIDNO:8、SEQIDNO:16或SEQIDNO:247的氨基酸序列有至少大約65%的氨基酸序列同一性，優(yōu)選至少大約70%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約75%的氨基*列同一性，還更優(yōu)選至少大約80%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約85%的氨基酸序列同一性，進一步更優(yōu)選至少大約卯％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約92%的氨基酸序列同一性，還更優(yōu)選至少大約95%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約97%的氨基酸序列同一性，還更優(yōu)選至少大約98。/。的氨基酸序列同一性，以及最優(yōu)選至少大約99%的氨基酸序列同一性。在一些實施方式中，經修飾的多核苷酸編碼的全長氨基酸序列與前體蛋白酶的氨基酸序列有高達65%的氨基酸序列同一性，優(yōu)選高達大約70%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選高達大約75%的氨基#列同一性，還更優(yōu)選高達大約80%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選高達大約85%的氨基酸序列同一性，進一步更優(yōu)選高達大約卯％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選高達大約92%的氨基*列同一性，還更優(yōu)選高達大約95%的氨基#列同一性，更優(yōu)選高達大約97%的氨基酸序列同一性，還更優(yōu)選高達大約98%的氨基酸序列同一性，以及最優(yōu)選高達大約99。/。的氨基,列同一性，并且較之前體多肽而言具有相當?shù)幕蛟鰪姷纳a活性。如技術人員將理解的，由于遺傳密碼的簡并性，多種經修飾的多核苷酸編碼經修飾的蛋白。在本發(fā)明的一些其它實施方式中，提供了包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列與SEQIDNOS:4、12或243的多核苷酸序列具有至少大約70%的序列同一性，至少大約75%的序列同一性，至少大約80%的序列同一性，至少大約85%的序列同一性，至少大約90%的序列同一性，至少大約92%的序列同一性，至少大約95%的序列同一性，至少大約97%的序列同一性，至少大約98%的序列同一性以及至少大約99%的序列同一性。在一些實施方式中，多核苷酸序列具有的百分比同一性是通過本領域已知的方法比對序列并確定同一性，從而對分子之間的序列信息直接加以比較來測定的。在一些實施方式中，百分比同一性(例如氨基酸序列、核酸序列和/或基因序列)是這樣測定的:通過比對序列，計算被比對的兩條序列間的精確匹配數(shù)量，除以較短序列的長度并將所得結果乘以100，從而對兩條分子間進行序列信息的直接比較。容易獲得的計算機程序可用于這些分析，包括上文所述的那些。用于測定核苷酸序列同一性的程序是WisconsinSequenceAnalysisPackage,Version8(GeneticsComputerGroup,Madison,Wl)中可獲得的，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，它們也依賴于Smith和Waterman算法。采用制造商推薦的以及上文提到的WisconsinSequenceAnalysisPackage中描述的默認參數(shù)，易于利用這些程序。適用于測定序列相似性的一種算法的例子是BLAST算法，其被描述于AItschul，etal"丄Mol.Biol"215:403-410(19卯)中。用于進行BLAST分析的軟件是公眾可通過NationalCenterforBiotechnologyInformation獲得的。該算法包括:首先通過在查詢序列中鑒定出長度為W的短字(其與數(shù)據(jù)庫序列中同樣長度的字比對時匹配或滿足一定的正值閾值分數(shù)T時)來鑒定高得分序列對(HSPs)。這些初始相鄰字命中作為起點以尋找含有它們的更長的HSPs。只要累積比對分數(shù)得以增加，字命中就一直沿著被比較的兩條序列每條的兩個方向擴展。當累積比對分數(shù)從獲得的最大值降低了數(shù)量X;累積分數(shù)達到零或更低；或者到達了任一序列的末端時，字命中延伸停止。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的靈敏性和速度。BLAST程序采用字長(W)=11，BLOSUM62計分矩陣(見Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))，比對(B)=50，期望(E)=10，M，5、N，-4和兩條鏈的比較作為默認設置。然后，BLAST算法進行兩條序列間相似性的統(tǒng)計分析(見，例如，KarlinandAltschul，Proc.NatlAcad.Sci.USA90:5873-5787[1993)。BLAST算法提供的一種相似性測量是最小和概率(P(N)),這提供了對兩條核苷酸或氨基酸序列間偶然發(fā)生匹配的概率的指示。例如，如果測試核酸與本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶核酸的比較中最小和概率小于大約0.1，更優(yōu)選小于大約O.Ol，最優(yōu)選小于大約0.001，那么該核*列就被認為與本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶核酸相似。當測試核酸編碼絲氨酸蛋白酶核酸時，如果比較產生了小于大約0，5，更優(yōu)選小于大約0.2的最小和概率，那么就認為所述測試核酸與指定的絲氨酸蛋白酶核酸相似。在本發(fā)明的一些實施方式中，通過BLAST和蛋白翻譯序列工具來分析序列。在一些實-驗中，優(yōu)選的版本是BLAST(BasicBLAST版本2.0)。選擇的程序是"BlastX"，選擇的數(shù)據(jù)庫是"nr"。使用標準/默認參數(shù)值。本領域已知若干方法適于產生本發(fā)明的經修飾的多核苷酸序列，其包括但不限于位點飽和誘變、掃描誘變、插入誘變、缺失誘變、隨機誘變、位點定向誘變和定向進化以及多種其它重組方法。在一些實施方式中，本發(fā)明的經修飾的多核苷列包含對編碼蛋白酶前區(qū)域的序列的修飾，其是采用位點定向誘變在至少一個密碼子處產生的。在其它一些優(yōu)選的實施方式中，位點定向誘變是針對兩個或多個密碼子進行的。在另一些實施方式中，編碼經修飾蛋白酶的前區(qū)域的經修飾的多核苷酸序列具有與編碼前體多肽的前區(qū)域的多核苷酸(例如SEQIDNOS:3、11或242)高達大約40%，高達大約45%,高達大約50%,高達大約55%，高達大約60%，高達大約65%，高達大約70%,高達大約75%，高達大約80%,高達大約85%，高達大約卯％,高達大約95%，高達大約98%或高達大約99%的同源性。在一些備選的實施方式中，經修飾的多核苷酸是使用任何已知的誘變方法(例如放射、亞硝基胍等)在體內產生的。然后想要的經修飾的多核苷酸被分離，并被用于本文提供的方法。在一些優(yōu)選的實施方式中，通過使用包含誘變引物的組合物來完成對前體蛋白酶多核苷酸前區(qū)域的位點飽和誘變。誘變引物并不精確匹配前體多核苷酸，引物的一處或多處錯配被用于向模板多核苷酸中引入想要的突變。精確匹配前體多核普酸的非誘變引物也包括在引物組合物內。通過加入誘變引物和對應于誘變引物中至少一條的非誘變引物的混合物，產生了核酸文庫，其中存在多種突變模式。例如，如果需要突變核酸文庫成員中的一些在某些位置保持其前體序列，而其它成員在此此類位點是突變的話，員的能力。本發(fā)明的方法利用通常長度為大約10至大約50個，更優(yōu)選長度為大約15至大約45個堿基的誘變和非誘變寡核苷酸。在相應誘變和非誘變引物的方面，相應寡核苷酸無須相同長度，只要在對應于待添加突變的區(qū)域重疊即可。在一些實施方式中，引物以預先確定的比例添加。例如，如果想要得到的文庫某特定突變水平顯著而在相同或不同的位點處的不同的突變的量較小，可通過調節(jié)加入的引物的量，來產生具有想要的偏好的文庫?；蛘?，通過加入更少或更多量的非誘變引物，對突變體核酸文庫中產生相應突變的頻率加以調節(jié)。包含用于位點定向誘變的引物的組合物的試劑盒是可商業(yè)獲得的，其包括QuikChange⑧位點定向誘變試劑盒(Stratagene，SanDiego，CA)。在一些實施方式中，還進一步對前體多核苷酸加以修飾，以編碼在前區(qū)域包含兩處或多處氨基酸取代的經修飾的蛋白酶。用于進行多位點定向誘變的試劑盒也是可商業(yè)獲得的(例如QuikChangeMultisite，Stratagene,SanDiego,CA)。在一些實施方式中，使用位點飽和方法來產生本發(fā)明的經修飾的多核苷酸。在其它一些實施方式中，每種經修飾的多核苷酸在前區(qū)域包含至少一處氨基酸取代。本發(fā)明提供了本發(fā)明的任一種經修飾的多核苷酸編碼的經修飾的全長前體蛋白酶。本發(fā)明提供了下述蛋白酶的成熟形式，當從經修飾的前體蛋白酶加工而來時，它們能夠以比對未經修飾的前體蛋白進行加工獲得的水平更高的水平產生。本發(fā)明包括已通過在前體蛋白酶前區(qū)域突變至少一處氨基酸進行過修飾的全長蛋白酶。在一些實施方式中，在前區(qū)域中與SEQIDNO:13的全長前體蛋白酶的前區(qū)域(SEQIDNO:15)、SEQIDNO:5的全長前體蛋白酶的前區(qū)域(SEQIDNO:7)或SEQIDNO:244的全長前體蛋白酶的前區(qū)域(SEQIDNO:246)的28-109位氨基酸等同的前區(qū)域的一處或多處氨基酸處對前體蛋白酶加以突變。在一些實施方式中，在與克勞氏芽孢桿菌V049前體蛋白酶(SEQIDNO:13)、克勞氏芽孢桿菌野生型蛋白酶(SEQIDNO:5)或野生型遲緩芽孑包桿菌蛋白酶(SEQIDNo:244)的E33、E43、A44、E47、V49、E57、A59、E63、E70、E74、E84和/或E88等同的位置進行氨基酸取代。在一些實施方式中，等同于E33的位置的氨基酸的取代包括但不限于:E33D、E33I、E33S、E33N、E33K、E33H、E33Q或E33R。在其它一些實施方式中，E57的取代包括但不限于E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57G、E57S、E57H或E57N。本發(fā)明包括下述經修-飾的蛋白酶，其中，在位于等同于SEQIDNO:5、13或244的氨基酸位置28-109的氨基酸位置中的每一處進行的任一氨基酸取代是用19種天然存在的L-氨基酸中的任一種來進行的，以增強經修飾的蛋白酶較之前體蛋白酶而言的生產/分泌(見，表2和實施例4)。本文中采用通常使用和理解的單字母代碼來表示氨基酸(見，例如，Dale,M.W.(1989)，MolecularGeneticsofBacteria.JohnWiley&Sons,Ltd.)。在一些實施方式中，經修飾的前體蛋白酶多肽包含成熟區(qū)域，其與SEQIDNO:8、16和247所示的氨基#列有至少大約65%的氨基酸序列同一性，優(yōu)選至少大約70%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約75%的氨基酸序列同一性，還更優(yōu)選至少大約80%的氨基#列同一性，更優(yōu)選至少大約85%的氨基酸序列同一性，進一步更優(yōu)選至少大約90%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約92%的氨基酸序列同一性，還更優(yōu)選至少大約95%的氨基*列同一性，更優(yōu)選至少大約97%的氨基#列同一性，還更優(yōu)選至少大約98%的氨基酸序列同一性，最優(yōu)選至少大約99%的氨基*列同一性，并且具有較之前體多肽而言相當或增強的生產活性。如上文所述，在一些實施方式中，本發(fā)明提供了包含前述多核苷酸的載體。在一些優(yōu)選的實施方式中，載體是表達載體，其中，編碼本發(fā)明蛋白酶的DNA序列與DNA轉錄所需的額外片段有效連接。在一些優(yōu)選的實31施方式中，表達栽體源于質粒或病毒DNA，或者在一些備選的實施方式中，表達載體含有這兩者的元件。示例性的載體包括但不限于pXX、pC194、pJH101、pE194、pHP13(HarwoodandCutting(eds)，MolecularBiologicalMethodsforBacillus,JohnWiley&Sons,〖19901，特別是第3章；針對枯草芽孢桿菌的合適復制質粒包括第92頁列出的那些；Perego，M.(1993)lntegrationalVectorsforGeneticManipulationsinBacillussubtilis，p.615-624;A.LSonenshein，J.A.Hoch，andR.Losick(ed.),BacillussubtHisandotherGram-positivebacteria:biochemistry,physiologyandmoleculargenetics,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C)在一些優(yōu)選的實施方式中，載體pXX可用于構建包含本文所述的多核苷酸的載體(例如pXX-049;見，圖6)。必須注意，本文所述的每種載體都可用于本發(fā)明。在一些實施方式中，構建體存在于復制質粒(例如pHP13)上，而在其它一些實施方式中，其以一個或多個拷貝整合進染色體。用于整合的示例性位點包括但不限于aprE、amyE、veg或pps區(qū)域。事實上，本領域技術人員已知的其它位點也可用于本發(fā)明。在一些實施方式中，啟動子是所選擇的前體蛋白酶的野生型啟動子。在其它一些實施方式中，啟動子是前體蛋白酶異源的，但是在宿主細胞中有功能性。具體地，適用于細菌宿主細胞的啟動子的例子包括但不限于pSPAC、pAprE、pAmyE、pVeg、pHpall啟動子，嗜熱脂肪桿菌麥芽糖淀粉酶基因、解淀粉芽孢桿菌(BAN)淀粉酶基因、枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因、克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基因、短小芽孢桿菌木糖苷酶基因、蘇云金芽孢桿菌cryIIIA和地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因的啟動子。其它啟動子包括但不限于A4啟動子以及噬菌體1Pr或PL啟動子以及大腸桿菌lac、trp或tac啟動子。在一些優(yōu)選的實施方式中，表達載體含有多個克隆位點，其優(yōu)選包含載體所特有的至少一種限制性內切酶位點，以協(xié)助核酸操作易于進行。在一些進一步優(yōu)選的實施方式中，載體還包含一種或多種選擇標記(例如，抗微生物標記，例如，紅霉素、放線菌素、氯霉素和/或四環(huán)素)。還在其它一些實施方式中，可使用本領域已知的方法，用多拷貝復制質粒來將質粒整合進芽孢桿菌基因組DNA。為在細胞中表達和生產目的蛋白質；例如蛋白酶，在適于表達所述蛋白質的條件下，向細胞中轉化進至少一種表達載體，所述表達載體包含編碼經修飾蛋白酶的多核苷酸的至少一個拷貝，優(yōu)選包含多個拷貝。在一些特別優(yōu)選的實施方式中，編碼目的蛋白(例如蛋白酶)的序列(以及載體中包括的其它序列)被整合進宿主細胞的基因組，而在其它一些實施方式中，質粒作為自主染色體外元件保持在細胞中。因此，本發(fā)明既提供了染色體外元件又提供了整合進宿主細胞基因組的進入序列。前體蛋白酶和經修飾的蛋白酶在任何合適的革蘭氏陽性微生物(包括細菌和真菌)的宿主細胞中生產。例如，在一些實施方式中，在真菌和/或細菌來源的宿主細胞中生產經修飾的蛋白酶。在一些實施方式中，宿主細胞是芽孢桿菌、鏈霉菌(Streptomycessp.)、埃希氏菌(Escherichiasp.)或曲霉(Aspergillussp.)。在一些優(yōu)選的實施方式中，經修飾的蛋白酶是芽孢桿菌屬的宿主細胞生產的?？捎糜谏a本發(fā)明的經修飾的蛋白質的芽孢桿菌宿主細胞的例子包括但不限于地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪桿菌、嗜堿芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌以及芽孢桿菌屬中的其它生物。在一些特別優(yōu)選的實施方式中，可使用枯草芽孢桿菌宿主細胞。美國專利5,264,366和4,760,025(RE34,606)描述了可用于本發(fā)明的多種芽孢桿菌宿主菌林，但是其它合適的菌林也可用于本發(fā)明?？捎糜诒景l(fā)明的工業(yè)菌林包括非重組的(即野生型)芽孢桿菌菌林以及天然存在的菌林和/或重組菌林的變體。在一些優(yōu)選的實施方式中，宿主菌林是重組菌林，其中，編碼目的多肽的多核苷酸已被引入宿主。在一些優(yōu)選的實施方式中，宿主菌林是枯草芽孢桿菌宿主菌林，特別是重組的芽孢桿菌宿主菌林。已知大量枯草芽孢桿菌菌林，這包括但不限于1A6(ATCC3卯85)、168(IAOI)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC39,087)、ATCC21332、ATCC6051、MI113、DE100(ATCC39,094)、GX4931、PBT110和PEP211菌林(見，例如Hochetal.，Genetics,73:215-228[1973)(還見美國專利號4,450,235;美國專利號4,302,544和EP0134048，每篇都通過引用整體并入本文)。用枯草芽孢桿菌作為表達宿主細胞是本領域公知的(見，例如，見Palvaetal.，Gene19:81-81982；FahnestockandFischer,J.Bacteriol.，165:796-804[1986和Wangetal"Gene69:39-47[1988])。在一些實施方式中，一種優(yōu)選的芽孢桿菌宿主是在下述基因中的至少一種中包括突變或缺失的芽孢桿菌，所述基因是:degU、degS、degR和degQ。優(yōu)選地，所述突變處于degU基因中，更優(yōu)選地，所述突變是degU(Hy)32(見，例如，Msadeketal"J.Bacteriol.，172:824-834[1990和Olmosetal.，Mol.Gen.Genet"253:562-567[1997)。一種更特別優(yōu)選的宿主菌林是攜帶degU32(Hy)突變的枯草芽孢桿菌。在另一些實施方式中，芽孢桿菌宿主在scoC4(見，例如Caldwelletal"J.Bacteriol.，183:7329-73402001)、spoIIE(見，例如Arigonietal.，Mol.Microbiol.,31:1407-1411999)和/或oppA或opp操縱子的其它基因中包含突變或缺失(見，例如Peregoetal"Mol.Microbiol"5:173-185[1991])。事實上，opp操縱子中導致與oppA基因中突變相同的表型的任何突變可用于本發(fā)明的改變的芽孢桿菌菌林的一些實施方式。在一些實施方式中，這些突變單獨存在，而在其它一些實施方式中，存在突變的組合。在一些實施方式中，可用于產生本發(fā)明的經修^飾蛋白酶的經改變的芽孢桿菌是已經在一種或多種上迷基因中包括突變的芽孢桿菌宿主菌林(在一些實施方式中，還存在其它基因中的突變)。在一些備選的實施方式中，可使用這樣的經改變的芽孢桿菌，其被進一步改造，以包括一種或多種上文所述基因的突變。使用本領域已知的任何合適方法，用編碼本發(fā)明的經修飾蛋白酶的經修飾的多核苷酸來轉化宿主細胞。經修飾的多核苷酸整合進載體或在沒有質粒DNA的情況下使用，其被引入微生物中，在一些實施方式中，優(yōu)選引入大腸桿菌細胞或感受態(tài)芽孢桿菌細胞。將DNA引入芽孢桿菌細胞的方法(涉及質粒構建體和質粒向大腸桿菌中的轉化)是公知的。在一些實施方式中，隨后從大腸桿菌分離質粒，并將其轉化進芽孢桿菌。但是，并不必須使用中介微生物(例如大腸桿菌)，在一些實施方式中，DNA構建體或載體被直接引入芽孢桿菌宿主。本領域技術人員熟知將多核苷酸序列引入芽孢桿菌細胞的方法(見，例如，F(xiàn)errarietal""Genetics,"inHarwoodetal"(ed.)，芽孑包桿菌，PlenumPublishingCorp.1989，pages57-72;Saundersetal"J.Bacteriol"157:718-726[1984；Hochetal"J.Bacteriol.，93:1925-1937[1967；Mannetal"CurrentMicrobiol"13:131-135[1986和Holubova，F(xiàn)oliaMicrobiol"30:97[1985；Changetal"Mol.Gen.Genet"168:11-115[1979；Vorobjevaetal"FEMSMicrobiol.Lett"7:261-21980；Smithetal"Appl.Env.Microbiol"51:631986；Fisheretal"Arch.Microbiol"139:213-217[1981和McDonald,J.Gen.Microbiol"130:203[1984)。事實上，此類方法，例如轉化，包括原生質體轉化和中板集合(congression)，轉導和原生質體融合是已知的，并且適用于本發(fā)明。轉化的方法對于將本發(fā)明提供的DNA構建體引入宿主細胞來說是特別優(yōu)選的。除了通常使用的方法之外，在一些實施方式中，直接轉化宿主細胞(即，在引入宿主細胞之前，不用中間細胞來擴增或加工DNA構建體)。將DNA構建體引入宿主細胞包括本領域已知用來將DNA引入宿主細胞而不插入質?；蜉d體的那些物理和化學方法。此類方法包括但不限于氯化鉀沉淀、電穿孔、棵DNA、脂質體等。在另一些實施方式中，DNA構建體與質粒共轉化，而不插入質粒中。在另外一些實施方式中，通過本領域已知的方法從經改變的芽孢桿菌菌林缺失選擇性標記(見，例如，Stahletal.，J.Bacteriol.,158:411-418[1984和Palmerosetal"Gene247:255-264[2000])。如上文所述，在本發(fā)明的一些實施方式中，編碼至少一種經修飾的目的多肽的核酸經由能在宿主細胞中復制的表達載體被引入宿主細胞。用于芽孢桿菌的合適的復制和整合質粒是本領域已知的(見，例如，HarwoodandCutting(eds),MolecularBiologicalMethodsforBacillus,JohnWiley&Sons,19卯j,特別是第3章，用于枯草芽孢桿菌的合適的質粒包括第92頁列出的那些)。雖然存在技術困難，但是本領域技術人員知道有若干種策略可用于在芽孢桿菌中直接克隆DNA。本領域中已知用于轉化芽孢桿菌的方法包括質粒標記挽救轉化等方法，其涉及由攜帶有部分同源的常駐質粒的感受態(tài)細胞攝入供體質粒(Contenteetal"Plasmid2:555-51979；Haimaetal"Mol.Gen.Genet"223:185-191[1990；Weinrauchetal"J.Bacteriol.，154:1077-1087[1983和Weinrauchetal"J.Bacteriol"169:1205-1211[1987)。在該方法中，進入供體質粒在模擬染色體轉化的過程中與常駐的"輔助"質粒的同源區(qū)重組。涉及通過原生質體轉化進行的轉化的其它方法是本領域已知的(見，例如，ChangandCohen,Mol.Gen.Genet"168:111-115[1979；Vorobjevaetal"FEMSMicrobiol.Lett.,7:261-21980];Smithetal"Appl.Env.Microbiol.，51:631986];Fisheretal"Arch.Microbiol.,139:213-217[1981];McDonald[1984J.Gen.Microbiol"130:203[1984]和Bakhietetal"49:577[1985)。此外，Mannetal.(Mannetal.，Curr.Microbiol"13:131-131986)描述了芽孢桿菌原生質體的轉化，Holubova(Holubova，Microbiol.,30:97[1985)描述了使用含DNA的脂質體將DNA引入原生質體的方法。在一些優(yōu)選的實施方式中，使用標記基因，以指示目的基因是否存在于宿主細胞中。除了這些方法之外，在其它一些實施方式中，宿主細胞被直接轉化。在"直接轉化"中，在引入宿主(如芽孢桿菌)細胞之前，不用中間細胞來擴增或加工經修"沛的多核苷酸。將經修飾的多核苷酸引入宿主細胞包括本領域已知用來將經修飾的多核苷酸引入細胞而不插入質?；蜉d體的那些物理和化學方法。此類方法包括但不限于使用感受態(tài)細胞以及使用"人工手段"例如氯化4丐沉淀、電穿孔等，以將DNA引入細胞。因此，本發(fā)明可使用棵DNA、脂質體等。還在其它一些實施方式中，經修飾的多核苷酸與質粒一起共轉化而不被插入質粒。更具體地，本發(fā)明提供了包含本文所述的多核苷酸的構建體、載體，經此類載體轉化的宿主細胞，此類宿主細胞表達的蛋白酶，表達方法以及用于生產源于微生物(特別地，芽孢桿菌屬的成員)的同源或異源絲氨酸蛋白酶的系統(tǒng)。在一些實施方式中，編碼經修飾的絲氨酸蛋白酶的經修飾的多核苷酸被用于生產適于表達經修飾的絲氨酸蛋白酶的重組宿主細胞。在一些優(yōu)選的實施方式中，表達宿主能增強經修飾的蛋白酶的成熟形式的分泌，由此增加蛋白酶的商業(yè)生產。在一些實施方式中，本發(fā)明的宿主細胞和經轉化的細胞被培養(yǎng)于常規(guī)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中。合適的特定培養(yǎng)條件，例如溫度、pH等是本領域技術人員已知的。此夕卜，可在科學文獻，例如Hopwood(2000)PracticalStreptomvcesGenetics.JohnlnnesFoundation,NorwichUK;Hardwoodetal.，(1990)MolecularBiologicalMethodsforBacillus,JohnWileyandfromtheAmericanTypeCultureCollection(ATCC)中找到一些優(yōu)選的培養(yǎng)條件。在一些實施方式中，在適于被編碼蛋白表達以及從細胞培養(yǎng)物中對其加以回收的條件下，培養(yǎng)被編碼經修飾蛋白酶的多核苷酸序列轉化過的宿主細胞。包含本發(fā)明的經修飾蛋白酶的重組宿主細胞生產的蛋白質被分泌進培養(yǎng)基。在一些實施方式中，其它一些重組構建將異源或同源多核苷酸序列連接至編碼蛋白酶多肽結構域的核苷酸序列，其方便純化可溶蛋白(KrollDJetal(1993)DNACellBiol12:441-53)。此類純化協(xié)助結構域包括但不限于:金屬螯合肽，例如，允許在被固定的金屬上進行純化的組氨酸-色氨酸模塊(PorathJ(1992)ProteinExprPurif3:263-281)、允許在被固定的免疫球蛋白上進行純化的A蛋白結構域以及用于FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)的結構域(ImmunexCorp,SeattleWA)。將可切割的接頭序列，例如FactorXA或腸激酶(Invitrogen，SanDiegoCA)包括到純化結構域和異源蛋白之間也可用于協(xié)助純化。在一些優(yōu)選的實施方式中，在適于表達被編碼蛋白和從細胞培養(yǎng)基中對其回收的條件下，培養(yǎng)用編碼異源或同源蛋白的多核苷酸序列轉化的細胞或內源具有所述蛋白質的細胞。在一些實施方式中，其它一些重組構建苷酸序列(例如，多種標記)(Krolletal"DNACell.Biol"12:441-53[1993)。此類純化協(xié)助結構域包括但不限于:金屬螯合肽，例如，允許在被固定的金屬上進行純化的組氨酸-色氨酸模塊(PorathJ(1992)ProteinExprPurif3:263-281)、允許在被固定的免疫球蛋白上進行純化的A蛋白結構域以及用于FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)的結構域(ImmunexCorp，SeattleWA)。將可切割的接頭序列，例如FactorXA或腸激酶(Invitrogen，SanDiegoCA)包括到純化結構域和異源蛋白質之間也可用于協(xié)助純化。在一些優(yōu)選的實施方式中，在允許表達本發(fā)明蛋白酶的條件下，在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的經轉化的宿主細胞，之后從培養(yǎng)物中回收得到的蛋白酶。用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基包含適于宿主細胞生長的任何常規(guī)培養(yǎng)基，例如基本培養(yǎng)基或含有合適補充物的復雜培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應者獲得，或者可以按照公開的配方(例如，在AmericanTypeCultureCollection的目錄中)來制備。在一些實施方式中，通過常規(guī)方法從細胞培養(yǎng)基中回收細胞生產的蛋白酶，這包括但不限于:通過離心或過濾從培養(yǎng)基分離宿主細胞，通過鹽(例如硫酸銨)沉淀上清液或濾液的蛋白質性組分，層析純化(例如，離子交換、凝膠過濾、親和等)。因此，適于回收本發(fā)明蛋白酶的任何方法都可用于本發(fā)明。事實上，本發(fā)明不受任何特定純化方法的限制。如上文所述，本發(fā)明的多肽以比從其相應的未經修飾的前體多肽加工的成熟酶更高的水平作為成熟酶產生。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方式中，較之從在相同條件下芽孢桿菌菌林生產的前體蛋白酶加工得到的相應成熟蛋白酶而言，前體多肽的前區(qū)域中的突變增強了成熟多肽的分泌/表達。增強的一種量度可作為活性比例來測量，這可表示為從經修飾的蛋白酶加工來的成熟形式的酶促活性與從前體蛋白酶加工來的成熟形式的酶促活性之比。等于或高于1的比例表明經修飾的蛋白酶的成熟形式以等于或高于前體蛋白酶成熟形式產生的水平產生。例如，1.5的活性比例表示:從經修飾的蛋白酶加工得到的成熟蛋白酶的生產水平是從前體蛋白酶加工得到成熟蛋白酶的水平的1.5倍，即，經修飾的蛋白酶比未經修飾的前體蛋白酶產生多50%的成熟蛋白酶。在一些實施方式中，活性比例為至少1，至少大約1.05，大約至少大約l.l，至少大約1.2，至少大約1.3,至少大約1.4，至少大約1.5，至少大約1.6,至少大約1.7，至少大約1.8，至少大約1,9，以及至少大約2。在其它一些實施方式中，活性比例為至少大約2.1,至少大約2.2，至少大約2.3，至少大約2.4，至少大約2.5，至少大約2.6,至少大約2.7，至少大約2.8，至少大約2.9以及至少大約3。在其它一些實施方式中，活性比例為至少大約3.5，至少大約4.0以及至少大約5。因此，在一些實施方式中，較之從未經修飾的前體蛋白酶加工來的相應成熟蛋白酶，從經修飾的蛋白酶加工來的成熟蛋白酶的生產增強了至少大約0.5%,大約1.0%，大約1.5%，大約2.0%，大約2,5%，大約3.0%，大約4.0%,大約5.0%，大約8.0%,大約10%,大約15%，大約20%，大約25%，大約30%，大約40%，大約50%，至少大約60%,至少大約70%，至少大約80%，至少大約90%，至少大約100%或更多。在其它一些實施方式中，較之從未經^f，務飾的前體蛋白酶加工來的蛋白酶成熟形式的相應生產而言，從經修飾的蛋白酶加工來的蛋白酶成熟形式的生產增強了至少大約110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、1卯％以及多至至少大約200%或者更多。在一些實施方式中，經修飾的蛋白酶的增強的生產是基于從經修飾的蛋白酶加工來的成熟形式的蛋白水解活性較之相應未經加工的前體蛋白酶的成熟形式的蛋白水解活性的比例來確定的。白質的其它手段包括但不限于:使用特異于該蛋白質的多克隆或單克隆抗體的方法。例子包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、熒光免疫測定(FIA)和熒光激活細胞分選(FACS)。這些和其它一些測定法是本領域/>知的(見，例如Maddoxetal.，J.Exp.Med.，39158:1211[19831)。在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方式中，使用本文提供的方法和組合物時，分泌比使用同樣的方法或組合物但沒有引入肽轉運蛋白或肽轉運操縱子的基因產物的情況下更高。本領域技術人員已知多種測定法，用于檢測和測量本發(fā)明的多肽活性。特別地，可獲得下述測定法來檢測蛋白酶活性，所述測定法基于酸可溶性肽從酪蛋白或血紅蛋白的釋放，這是使用Folin方法通過作為280nm處的吸光度或比色方式來測量的(見，例如，Bergmeyeretal.，"MethodsofEnzymaticAnalysis"vol.5，Peptidases,ProteinasesandtheirInhibitors,VerlagChemie，Weinheim[1984)。一些其它測定法涉及生色底物的溶解(見，例如，Ward,"Proteinases,"inFogarty(ed.).，MicrobialEnzymesandBiotechnology,AppliedScience,London,[1983，pp251-317)。其它一些示例性的測定法包括但不限于琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-對硝基苯胺測定法(SAAPFpNA)和2，4，6-三硝基苯磺酸鈉鹽測定(TNBS測定)。本領域已知的許多其它參考文獻提供了合適的方法(見，例如，Wellsetal.,NucleicAcidsRes.11:7911-7925[1983];Christiansonetal"Anal.Biochem.，223:119-129[1994和Hsiaetal"AnalBiochem.，242:221-227[1999)。這并不意味著本發(fā)明受限于任何特定的測定方法。在一些實施方式中，使用從經修飾的前體蛋白酶加工來的成熟蛋白酶的活性與從未經^務飾的前體蛋白酶加工來的成熟蛋白酶的活性的比例，來測定微生物對經修飾的蛋白酶的生產。在一些特別優(yōu)選的實施方式中，1或更高的比例是想要的。用于測定目的蛋白(例如蛋白酶)在宿主細胞中的生產水平以及用于檢測表達的蛋白質的其它手段包括用特異于該蛋白質的多克隆或單克隆抗體進行免疫測定。例子包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、熒光免疫測定(FIA)和熒光激活細胞分選(FACS)。但是，本領域已知其它一些方法，它們也可用于評估目的蛋白(見，例如，Hamptonetal"SerologicalMethods,ALaboratoryManual,APSPress,St.Paul,MN[l闊和Maddoxetal"J.Exp.Med"158:1211[1983)。在一些優(yōu)選的實施方式中，在使用本發(fā)明獲得的經改變的菌株中，目的蛋白的分泌要比在相應未經改變的宿主中更高。如本領域中所知的，在適于表達和從細胞培養(yǎng)物中回收目的多肽的條件下，保持和培養(yǎng)使用本發(fā)明生產的經改變的芽孢桿菌細胞(見，例如，HardwoodandCu"in2(eds.)MolecularBiologicalMethodsforBacillus,JohnWiley&Sons[1990])。這并不意味著本發(fā)明受限于任何特定的測定方法。本文提到的所有出版物和專利都通過引用并入本文。本領域技術人員將顯而易見對描述的本發(fā)明的方法和系統(tǒng)的多種修改和變動，而不偏離本發(fā)明的范圍和宗旨。雖然已經參照特定的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明進行了描述，但是應當理解，本發(fā)明不應被不恰當?shù)叵薅檫@些具體的實施方式。事實上，本領域和/或相關領域技術人員顯而易見的用于實施本發(fā)明的所描述模式的多種修改都將在本發(fā)明的范圍內。實驗提供下述實施例來展示和進一步闡述本發(fā)明的某些優(yōu)選的實施方式和方面，并不應被解釋為限制其范圍。在下文實驗/>開的內容中，應用了下述縮寫:ppm(每百萬分之)；M(摩爾的)；mM(毫摩爾的)；nM(微摩爾的)；nM(納摩爾的)；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；pmol(微摩爾)；nmol(納摩爾)；gm(克)；mg(毫克)；fig(微克)；pg(皮克)；L(升)；ml和mL(毫升)；jil和jiL(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；jim(微米)；nm(納米)；U(單位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分鐘/分鐘);h(s)和hr(s)(小時/小時)；°C(攝氏度)；QS(足夠量);ND(未進行)；NA(不適用)；rpm(每分鐘轉數(shù))；H20(水)；dH20(去離子水)；HC1(氫氯酸)；aa(氨基酸)；bp(堿基對)；kb(千堿基對)；kD(千道爾頓)；cDNA(拷貝或互補DNA);DNA(脫氧核糖核酸)；ssDNA(單鏈DNA);dsDNA(雙鏈DNA);dNTP(三磷酸脫氧核糖核苷酸)；RNA(核糖核酸)；MgCl2(氯化鎂)；NaCl(氯化鈉)；w/v(質量體積比)；v/v(體積體積比)；g(重力)；OD(光密度)；Dulbecco's礴酸鹽緩沖液(DPBS);OD28。(280nm處的光密度)；OD綱(600nm處的光密度)；A4()5(405nm處的吸光度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)；PBS(磷酸緩沖鹽水[150mMNaCl，lOmM磷酸鈉緩沖液，pH7.2]);PBST(PBS+0.25%TWEEN-20);PEG(聚乙二醇)；PCR(聚合酶鏈式反應)；SDS(十二烷基硫酸鈉)；Tris(三(羥曱基)氨基曱烷)；HEPES(N-[2-羥乙基哌嗪-N-P-乙磺酸)；HBS(HEPES緩沖鹽水)；SDS(十二烷基硫酸鈉)；bME、BME和|5ME(卩-巰基乙醇或2-巰基乙醇)；Tris-HCI(三[羥甲基]氨基甲烷-鹽酸鹽)；Tricine(N-[三-(羥甲基)-甲基-甘氨酸)；DMSO(二甲亞砜)；Taq(水生棲熱菌(Thermusaquaticus)DNA聚合酶)；Klenow(DNA聚合酶I大(Klenow)片段)；rpm(每分鐘轉數(shù))；EGTA(乙二醇-雙(卩-氨基乙醚)N，N，N'，N'畫四乙酸)；EDTA(乙二胺四乙酸)；bla(卩-內酰胺酶或氨千青霉素抗性基因)；DNA2.0(DNA2.0，MenloPark,CA);OXOID(Oxoid，Basingstoke,Hampshire,UK);Corning(CorningLifeSciences,Coming,NY);ATCC(AmericanTypeCultureCollection,Rockville，MD);Gibco/BRL(Gibco/BRL,GrandIsland，NY);Sigma(SigmaChemicalCo.，St.Louis,MO);Pharmacia(PharmaciaBiotech,Pisacataway,NJ);NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation);AppliedBiosystems(AppliedBiosystems,FosterCity,CA);Clontech(CLONTECHLaboratories,PaloAlto,CA);OperonTechnologies(OperonTechnologies,Inc.,Alameda,CA);Bachem(BachemBioscience,Inc.,KingofPrussia,PA);Difco(DifcoLaboratories,Detroit,Ml);GIBCOBRL或GibcoBRL(LifeTechnologies,Inc.,Gaithersburg,MD);Millipore(Millipore,Billerica，MA);Bio-Rad(Bio-Rad，Hercules,CA);Invitrogen(InvitrogenCorp"SanDiego,CA);NEB(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA);Sigma(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO);Pierce(PierceBiotechnology,Rockford，IL);Takara(TakaraBioInc.Otsu，Japan);Roche(Hoffmann-LaRoche,Basel,Switzerland);EMScience(EMScience,Gibbstown，NJ);Qiagen(Qiagen，Inc.,Valencia,CA);MolecularDevices(MolecularDevices,Corp"Sunnyvale,CA);R&DSystems(R&DSystems,Minneapolis,MN);Stratagene(StratageneCloningSystems,LaJoIIa，CA)和Microsoft(Microsoft,Inc.,Redmond,WA)。實施例1對克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶V049的SigP和前序列的位點掃描誘變使用QuickChange⑧位點定向誘變試劑盒(QC;Stratagene)，按照廠商提供的說明書，進行對克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶V049前體蛋白酶的前序列的位點飽和誘變。產生位點飽和文庫，以包括編碼克勞氏芽孢桿菌蛋白酶變體V049的前體多核苷酸的經修飾的多核苷酸序列。pXX-V049質粒中含有的編碼V049多核苷酸的前區(qū)域的序列(圖5和6;SEQIDNO:17)被突變，以產生多核苷酸文庫，其每種包含前體蛋白酶前區(qū)域的一個密碼子的突變。V049的前區(qū)域的每種密碼子(例如NNG/C)被突變，以被編碼20種天然存在的氨基酸的32種可能的核香酸三聯(lián)體取代。針對每種目的密碼子，設計互補重疊引物(其中NNS密碼子側翼有18個堿基)，表l中給出了引物的序列(SEQIDNO:18-239)。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>TCTTTTAAGTAAGTCTACTCTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCGTCGCGTCGACCGCACTACTCATTTCTG丌GCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCTGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAA丌GGCTTTMTGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACMGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTCATGAATTTGAAACGATTCCTGTTTTATCCGTTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGCTTGAACTCGATCCAGCGATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATGGCGCAATCGGTACCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCTGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCACCGAACGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGTTATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGACTGCAGGCACCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGGAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGMCGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCGGCAACACGTTAATCAATAAAAAAACGCTGTGCGGTTAAAGGGCACAGCGTTTTTTTGTGTATGAATCGGGATCCTCGATCGAGACTAGAGTCGATTTTTACAAGAATTAGCTTTATATAATTTCTGTTTTTCTAAAGTTTTATCAGCTACAAAAGACCAACTTAGTTTTCACAAACTATGACAATAAAAAAAGTTGCTTTTTCCCCTTTCTATGTATGTTCAAGATAAGAAAGAAAAGGATTTTTCGCTACGCTCAAATCCTTTAAAAAAACACAAAAGACCGGATAAAGTGGGATATTTTTAAAATATATATTTATGTTACAGTAATATTGAC丌TTAAAAAAGGATTGATTCTAATGAAGAAAGCAGACAAGTAAGCCTCCTAAATTCACTTTAGATAAAAATTTAGGAGGCATATCAAATGAACTTTAATAAAATTGATTTAGACAATTGGAAGAGAAAAGAGATATTTAATCATTATTTGAACCAACAAACGACTTTTAGTATAACCACAGAAATTGATATTAGTGTTTTATACCGAAACATAAAACAAGAAGGATATAAATTTTACCCTGCATTTATTTTCTTAGTGACAAGGGTGATAAACTCAAATACAGCTTTTAGAACTGGTTACAATAGCGACGGAGAGTTAGGTTATTGGGATAAGTTAGAGCCACTTTATACAATTTTTGATGGTGTATCTAAAACATTCTCTGGT57ATTTGGACTCCTGTAAAGAATGACTTCAAAGAGTTTTATGATTTATACCTTTCTGATGTAGAGAAATATAATGGTTCGGGGAAATTGTTTCCCAAAACACCTATACCTGAAAATGCTTTTTCTCATCTTTACAGGTACATCATTCTGTTTGTGATGGTTATCATGCAGGATTGTTTATGAACTCTATTCAGGAATTGTCAGATAGGCCTAATGACTGGCTTTTATAATATGAGATAATGCCGACTGTAAGCAAAAAATGCCATTCCAATACAAAACCACATACCTATAATCGACCTGCAGGMTTAATTCCTCCATTTTCTTCTGCTATCAAAATAACAGACTCGTGATTTTCCAAACGAGCTTTCAAAAAAGCCTCTGCCCCTTGCAAATCGGATGCCTGTCTATAAAATTCCCGATATTGGCTTAAACAGCCCTCTCAATAA訂TTTTCATTCTATCCCTTTTCTGTAAAGTTTATTTTTCAGAATACTTTTATCATCATGCTTTGAAAAAATATCACGATAATATCCATTGTTCTCACGGAAGCACACGCAGGTCATTTGMCGAA丌TTTTCGACAGGAATTTGCCGGGACTCAGGAGCATTTAACCTAAAAAAGCATGACATTTCAGCATAATGMCATTTACTCATGTCTATTTTCGTTCTTTTCTGTATGAAAATAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAA丌GCG丌GCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTA丌GGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTGGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTA丌AATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTG丌GCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGQC反應物由40.25nL滅菌蒸餾H20、5nLPfuTurbo10x緩沖液(來自試劑盒)、1dNTPs(來自試劑盒)、1.25nL正向引物(100ngL)、1.25nL反向引物(lOOng/jiL)、0.25pMSAT-Ncol小量制備DNA作為模板(50ng)和1nLPfuTurbo(來自試劑盒)總共50構成。循環(huán)條件為:95。C1分鐘，一次，接著是95。C1分鐘、55°C1分鐘和68°C12分鐘的19-20個循環(huán)。為分析反應體系，完成后在1.2%E-凝膠(Invitrogen)上運行5的反應物。接著，依次進行兩次Dpnl消化，用1jiL和1的酶在37。C進行2至8小時。使用相似條件進行陰性對照，但是不用任何引物。然后，使用BioRad電穿孔儀，將1jiL經Dpnl消化的反應產物轉化進50jiL—次性TOP10電感受態(tài)細胞(Invitrogen)。然后向經電穿孔的細胞中加入其中提供有TOP10細胞(Invitrogen)的1mlSOC，在振蕩下溫育1小時，之后接種到含有5ppm氯霉素的LA板上。平板在370C溫育過夜。該溫育之后，來自每種文庫(即每個位點)的96個菌落被接種進96孔微量滴定板中含有10-50ppm氯霉素的200jiLLB中，在37。C培養(yǎng)過夜。第二天加入甘油至20%終濃度后，將平板冷凍于-80。C,它們被用于用V049SEQ-R2引物進行的高通量測序。相似地，使用QuikChange⑧多位點定向誘變(QCMS;Stratagene)，來對編碼前體蛋白酶V049的前區(qū)域的兩個或多個氨基酸的密碼子進行突變。使用19.25nL滅菌蒸餾H20、2.5nL10x緩沖液(來自試劑盒)、1jiLdNTPs(來自試劑盒)、1nL5，磷酸化正向引物(100ngL)、0.25nLpMSAT-NcoI小量制備DNA作為模板(~50ng)以及l(fā)pL酶混合物(來自試劑盒)，總共25nL來進行QCMS反應。循環(huán)條件是95。C1分鐘，一次，接著是95°C1分鐘，55°C1分鐘和65°C12分鐘的30個循環(huán)。為分析反應產物，完成后在1.2%E-凝膠(Invitrogen)上運行2.5fiL的反應物。接著，依次進行兩次Dpnl消化，用1jiL和接著是0.5jiL的酶在37。C進行2至8小時。對照、轉化和測序按照上文針對QC方法所述來進行。實施例2宿主細胞轉化和經修飾蛋白酶的表達在37°C,用Dpnl對質粒pXX-049(含有編碼經#"飾的目的蛋白質的多核苷酸)進行2次消化(3-5小時)。在大腸桿菌中的轉化和篩選通過電穿孔，用1ul經Dpnl消化質粒DNA來轉化大腸桿菌Top10細胞。將經轉化的細胞接種到含有5ppmCMP(氯霉素)的LB瓊脂平板上，讓菌落生長過夜。挑出96個單獨的菌落，將其轉入含有LB+5ppmCMP+50ppm羧千青霉素的96孔微量滴定板的對應孔中。在37。C對培養(yǎng)物培養(yǎng)過夜，同時以250rpm搖動。向培養(yǎng)物中加入甘油貯液至10%的終濃度。從96份大腸桿菌培養(yǎng)物制備質粒DNA,對一部分質粒DNA制備物加以測序(Cogenics，Morrisville，NC)。使用Phrep，Phrap，Co脂d，CustalW軟件來進行自動序列分析。轉化進枯草芽孢桿菌第二部分的質粒DNA被用于轉化枯草芽孢桿菌宿主細胞。用來自96份大腸桿菌培養(yǎng)物中每種的2微升質粒DNA(攜帶有合適的突變)轉化100ul枯草芽孢桿菌ComK感受態(tài)細胞。細胞在37。C溫育45分鐘，同時以250rpm振蕩。將來自96種轉化混合物的細胞接種在含有1.6%脫脂奶和5ppmCMP的LA上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。從96種轉化的每種挑出4個菌落，各自轉移到每孔含有150ulLB和5ppmCMP的微量滴定板中。微量滴定板的許多孔含有合適的對照。然后在37。C對微量滴定板進行4小時的溫育，同時以250rpm旋轉。將10ul每種培養(yǎng)物轉移到含有140ulGrantII培養(yǎng)基+5ppmCMP，pH7.3的新的微量滴定板中。如下文所述來制備GrantII培養(yǎng)基:溶液I:將10g大豆蛋白胨(Soytone)溶解于500ml水中，高壓滅菌20-25分鐘；溶液11:3ml1MK2HP04、75g葡萄糖、3.6g尿素、100mlGrant's10XMOPS稀釋進400ml水?；旌先芤篒和溶液II，用HCl/NaOH將pH調節(jié)至pH7.3。將終體積調節(jié)為lL,終溶液經0.22-umPES過濾器過濾滅菌。微量滴定板培養(yǎng)物在搖床中于37。C，250rpm培養(yǎng)。以規(guī)律間隔取樣(多至40小時)，用于檢驗分析。實施例3測量經修飾的蛋白酶生產:蛋白酶活性的AAPF測定針對經修飾蛋白酶的生產，對按照實施例2中所述獲得的每種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物進行測定。測定產生的酶對底物(琥珀酰-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-對硝基苯胺，AAPF)的活性。該測定法將經修飾的蛋白酶的生產測量為水解和對硝基苯胺的釋方文導致的405nm/分鐘的吸光度的增加(Estelletal"JBiolChem"260:6518-6521(1985))。測量使用SofmaxPro軟件來進行，特定條件如下設定:類型:Kinetic;降低:Vmax點(讀取最佳15/28點)；Lml:405nm;時間5分鐘以及間隔:ll秒。將每種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物取10微升，稀釋至100ulTris緩沖液(含有10mMTris+0.005%TWEEN-80,pH8.6);和25ul100mg/mlAAPF。每種經修飾蛋白酶的相對活性被計算，每種氨基酸取代對相應經修飾蛋白酶的生產的影響被測定為從每種經修飾蛋白酶加工來的成熟蛋白酶的活性與從未經修飾的V049前體蛋白酶加工來的成熟蛋白酶的活性的比例。結果在表2中給出。一旦DNA構建體被穩(wěn)定整合進感受態(tài)枯草芽孢桿菌菌林，在微量滴定測定中測量經修飾的蛋白酶的活性，將該活性與相應前體蛋白酶的活性相比較。將過夜GrantII培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)物取10微升，稀釋至100ulTris緩沖液(含有10mMTris+0.005%TWEEN⑧-80,pH8,6);25ul100mg/mlAAPF被用于檢驗蛋白酶活性。測定在微量滴定板中進行，使用SoftmaxPro軟件。結果顯示，前體V049蛋白酶的大多數(shù)氨基酸的氨基酸取代導致蛋白酶成熟形式的生產增強。此外，每種經取代的氨基酸的位點飽和表明每個氨基酸可在同一位置被兩個或多個氨基酸取代，以使得成熟形式的生產相對從具有未經修飾的前區(qū)域的前體蛋白酶獲得的成熟形式而言得到增強。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table>"位置"指SEQIDNO:13的全長V049前體蛋白酶中編號的氨基酸位置。1-27位指位于V049前體酶的信號肽部分中的位置上的氨基酸，28-111位指位于V049前體酶的前區(qū)域中的位置上的氨基酸。#活性比例是從經修飾的蛋白酶加工得到的成熟蛋白酶的活性除以從未經修飾的前體蛋白酶加工得到的成熟蛋白酶的活性。實施例4在該實施例中，使用與上述實施例中所述相同的實驗方案，在來自遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的前區(qū)域(被稱為GG36)中在第33位和第59位進行誘變。按照上文所述，突變了前體多核苷酸序列(SEQIDNO:240),制備了構建體，并測試了修飾對蛋白酶表達的增加。結果顯示，較之未經修飾的前體，氨基酸取代E33G、E33Q和E33V全部都將野生型成熟GG36蛋白酶的生產增加了至少50%。突變H32K將野生型成熟蛋白酶的生產增加了20%。這些結果顯示，在全長蛋白酶的前區(qū)域中的突變不僅可提高變體前體蛋白的表達，還可提高天然存在的酶的表達。權利要求1.分離的經修飾的多核苷酸，其編碼經修飾的全長蛋白酶，其中所述經修飾的多核苷酸中編碼所述全長蛋白酶的前區(qū)域的部分包含編碼選自下述位置的至少一個氨基酸位置上的取代的突變，所述位置等同于SEQIDNO5、13或244的氨基酸位置28-108和109。2.權利要求l的分離的經修飾的多核苷酸，其中所述經修飾的全長蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。3.權利要求l的分離的經修飾的多核苷酸，其中所述經修飾的全長蛋白酶是源于野生型或變體前體堿性絲氨酸蛋白酶的堿性絲氨酸蛋白酶。4.權利要求3的分離的經修飾的多核苷酸，其中所述前體堿性絲氨酸蛋白酶是克勞氏芽孢桿菌或遲緩芽孢桿菌堿性絲氨酸蛋白酶。5.權利要求l的分離的經修飾的多核苷酸，其中所述分離的經修飾的多核苷酸包含SEQIDNOS:l、9或240所示的多核苷酸序列。6.權利要求l的分離的經修飾的多核苷酸，其中所述經修飾的多核苷酸中編碼所述前區(qū)域的所述部分包含編碼選自SEQIDNO:5、13或244的E33、E43、A44、E47、V49、E57、A59、E63、E70、E74、E84和E88的至少一個氨基酸位置上的取代的突變。7.權利要求6的分離的多核苷酸，其中所述E33的取代選自E33D、E33I、E33S、E33N、E33K、E33H、E33Q和E33R。8.權利要求6的分離的多核苷酸，其中所述E57的取代選自E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H和E57N。9.分離的經修飾的多核苷酸，其包含已被突變?yōu)榫幋a選自下述位置的至少一個氨基酸位置上的取代的前體前序列，所述位置等同于SEQIDNO:5、13或244的氨基酸位置28-108和109。10.權利要求9的分離的經修飾的多核苷酸，其還包含編碼包含成熟區(qū)域的全長蛋白酶的多核苷酸，其中編碼所述成熟區(qū)域的所述多核苷,列與SEQIDNOS:8、16或247有至少大約70%同一性。11.包含權利要求1或9的經修飾的多核苷酸的載體。12.用權利要求11的載體轉化的宿主細胞。13.權利要求12的宿主細胞，其中所述宿主細胞是微生物。14.權利要求12的宿主細胞，其中所述宿主細胞是選自芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、埃希氏菌屬和曲霉屬的微生物。15.權利要求12的宿主細胞，其中所述宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。16.權利要求12的宿主細胞產生的蛋白酶。17.在微生物中產生異源蛋白酶的方法，所述方法包括步驟(a)在合適的條件下培養(yǎng)芽孢桿菌宿主細胞，其中，所述芽孢桿菌宿主細胞包含編碼經修飾蛋白酶的經修飾的多核苷酸；以及(b)允許所述微生物產生所述蛋白酶。18.權利要求17的方法，其中回收所述芽孢桿菌宿主產生的所述異源蛋白酶。19.權利要求17的方法，其中所述蛋白酶是堿性絲氨酸蛋白酶。20.權利要求17的方法，其中所述經修飾的多核苷酸編碼包含與SEQIDNOS:8、16或247有至少大約70%同一性的成熟區(qū)的蛋白酶。21.權利要求17的方法，其中所述編碼經修飾蛋白酶的多核苷酸包含前區(qū)域，所述前區(qū)域包含編碼選自下組的至少一個氨基酸位置上的取代的突變，所述組由等同于SEQIDNO:5、13或240的氨基酸位置28-108和109組成。22.權利要求21的方法，其中所述至少一個氨基酸取代選自E33D、E33I、E33S、E33N、E33K、E33H、E33Q、E33R、E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H和E57N。23.權利要求17的方法，其中所述宿主細胞選自地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪桿菌、克勞氏芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。24.權利要求17的方法，其中所述異源蛋白酶是克勞氏芽孢桿菌或遲緩芽孢桿菌蛋白酶。25.權利要求17的方法，其中所述宿主細胞是枯草芽孢桿菌宿主細胞。26.權利要求17的方法，其中所述異源蛋白酶顯示出至少為1的生產比例。全文摘要本發(fā)明涉及經修飾的多核苷酸，其編碼經修飾的蛋白酶，本發(fā)明還涉及改變微生物中蛋白酶生產的方法。具體地，本發(fā)明涉及改變蛋白酶在微生物(例如芽孢桿菌種)中的表達的方法。本發(fā)明公開了經修飾的多核苷酸、載體、經修飾的多肽和增強蛋白酶生產的方法。文檔編號C12N9/54GK101641438SQ200880007877公開日2010年2月3日申請日期2008年3月12日優(yōu)先權日2007年3月12日發(fā)明者D·A·埃斯特爾,E·費拉里申請人:丹尼斯科美國公司