專利名稱：修飾的突變體膠原蛋白酶及其在脂肪溶解和疤痕減少中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及用于脂肪溶解和疤痕減少的修飾的突變體膠原蛋白酶。
背景技術(shù)：
I)脂肪減少 肥胖日益成為影響美觀和健康的重大問題。很多醫(yī)藥公司正在開發(fā)能夠減輕人們體重的藥物。脂肪抽吸是ー種主要的擺脫過量脂肪的治療方法，在美國毎年有700，000例脂肪抽吸手木。然而，脂肪抽吸非常具有侵害性，造成嚴重的副反應。脂肪分解霜是ー種非介入性的方法，用來改善含有過量脂肪的身體各區(qū)域的外觀。但是市場上并沒有有效的脂肪分解霜?，F(xiàn)有的脂肪分解霜僅有可能暫時地縮小脂肪細胞，而不能清除它們。脂肪抽吸是ー種利用真空(在負壓環(huán)境下)通過機械手段去除皮下脂肪的方法。美容行業(yè)運用脂肪抽吸術(shù)來去除男性和女性人體特定區(qū)域的過量脂肪。脂肪抽吸術(shù)很容易導致感染、瘀傷、外表變形和皮下組織的機械損傷。因此使用機械力作用的脂肪抽吸術(shù)不能令人滿意。皮下脂肪團對人們來說是個大問題。雖然目前自稱能減少或消滅皮下脂肪團的產(chǎn)品正在迅速増加，但關于它們功效的研究卻依然非常少。總的說來，這些研究清楚地表明這些產(chǎn)品沒有效果，但是，很遺憾，人們很難抵抗這些藥劑的誘惑。事實上，根據(jù)美國皮膚病學會的研究，皮下脂肪團是成年女性身體內(nèi)儲存脂肪的天然途徑。對于ー些婦女，尤其是非常瘦的婦女而言，只有箍縮皮膚才能看到皮下脂肪團，但是對于大多數(shù)婦女來說，總是可以看到一定數(shù)量的脂肪團。皮下脂肪團被認為是由于脂肪細胞的累積形成的，這些脂肪細胞突出或交錯于可能被衰弱了的皮膚層。很多出售抗-皮下脂肪團產(chǎn)品的公司將其稱之為“被囚禁的脂肪”，這實際上是ー種不錯的類比。能夠絕對肯定的是女性較之男性更加容易形成皮下脂肪團，很可能是因為她們的臀部和大腿部有更多的皮下脂肪細胞(來源Journal of AppliedPhysiology, 2002 年 4 月，第 1611-1618 頁)。有ー份很長的產(chǎn)品名單，聲稱將它們涂抹到皮膚上就能夠以某種方式解離身體脂肪并改善膚色，以消滅或減少皮下脂肪團的出現(xiàn)。雖然這些洗液和藥劑受到大眾歡迎，但是有兩個問題仍然沒有解決(I)不同產(chǎn)品之間缺乏處方的連貫性，和(2)沒有證據(jù)表明這些產(chǎn)品的功效(來源:Skin Research and Technology, 2002 年 5 月，第 118-124 頁)。歐洲皮月夫病學雜志(The European Journal of Dermatology, 2000 年 12 月，第 596-603 頁)研究了 32種消脂產(chǎn)品，其分別含有4到31種成分，其間很少有相似點?！?4種不同的植物性藥材和39種不同的潤膚劑被用于32種產(chǎn)品中。存在于14種產(chǎn)品中的咖啡因是最常用的添加劑，其似乎代表了一種‘活性’成分。在其它方面，這些產(chǎn)品的組分與護膚霜類似?！被瘖y品公司所做的是在沒有證據(jù)表明它們能夠起作用的情況下隨機加入植物成分，但是那些暗不性的聲明卻在誘惑消費者來嘗試一種又一種神奇的抗-皮下脂肪團藥劑。氨茶堿，一種支氣管擴張?zhí)幏剿?打開肺部通道)，因為刊登于肥胖癥研究(Obesity Research, 1995年11月，附頁561S-568S)的一篇論文，作為脂肪分解霜的一種成分得以聞名。然而，干1j登于塑料和重建外科(Plastic and Reconstructive Surgery, 1999年9月，第1110-1114頁)的一篇論文提出了對氨茶堿價值的懷疑，這篇論文描述了對于三組不同的婦女使用三種不同的皮下脂肪團處理方法的雙盲研究。因此，氨茶堿看上去并不是能夠解決脂肪團的答案，雖然它在一些脂肪分解霜中仍然存在?？Х纫颍捎谑前辈鑹A的“遠親”，而被用作脂肪分 解霜的一種成分。有兩組研究表明咖啡因?qū)ο幸嫣?，但是其中一組研究是由Johnson&Johnson進行的，其擁有RoC和Neutrogena兩個公司，二者均出售含咖啡因的脂肪分解霜；另一組研究是由出售抗_皮下脂肪團化合物的化妝品成分制造商進行的(來源Journal of Cosmetic Science, 2002年7-8月，第209-218頁)。沒有其他獨立的研究表明咖啡因?qū)τ谔幚砥は轮緢F有益處，也沒有研究指明需要多少咖啡因才能夠產(chǎn)生效果。2)疤痕減少疤痕是由創(chuàng)傷愈合后膠原蛋白過度生長形成的。大多數(shù)除疤產(chǎn)品包含片狀或凝膠狀的硅膠，以及洋蔥提取物(Mederma皮膚護理產(chǎn)品)。通常需要超過3個月才能看到一些效果，因為這些產(chǎn)品不包含有效地活性成分，例如任何形式的膠原蛋白酶，其靶向疤痕形成的原因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種組合物，包括一種修飾的單一突變體膠原蛋白酶ColH-FM，其中的ColH-FM是一種溶組織梭狀芽胞桿菌(Clostridium histolyticum)膠原蛋白酶ColH(Glu451Asp),并在 ColH (Glu451Asp)前附加有肽基序 CKGGRAKDC-G(x)，x 等于 2-6。所述組合物可以進一步包括藥學上可接受的載體，例如那些選自由生理鹽水、葡聚糖水溶液、和羥乙基淀粉水溶液所組成的組。在另一方面，本發(fā)明提供一種ColH (Glu451Asp)在制備減少身體指定位置脂肪組織數(shù)量的藥物中的用途，其包括向所述藥物引入有效量的單一 ColH(Glu451Asp)，或附加有N-末端或C-末端標簽的CKGGRAKDC-G (2-6個G)的相同的突變體膠原蛋白酶，或任何能夠靶向人體和動物體內(nèi)白色脂肪維管結(jié)構(gòu)的其它肽類。進一步地，ColH (Glu451Asp)或被修飾的ColH (Glu451Asp)可以用于制備減少和消除脂肪瘤的藥物，以及減少疤痕的藥物。本發(fā)明還涉及一種減少體內(nèi)指定位置的脂肪組織數(shù)量的方法，其包括向所述組織引入有效量的突變體膠原蛋白酶，或附加有N-末端或C-末端標簽CKGGRAKDC-G (2-6個G)的相同的突變體膠原蛋白酶，或任何能夠靶向人體和動物體內(nèi)白色脂肪維管結(jié)構(gòu)的其它肽類。在一個實施方式中，所述的脂肪組織是皮下的。優(yōu)選的，突變體全長ColH來自于溶組織梭狀芽胞桿菌(Clostridium histolyticum)。在一個實施方式中，所述的突變體ColH是突變于E451D。具體的，在展開的序列中ColH第451位的谷氨酸被突變成天冬氨酸(440DRLTWYEEGGAE451)，其中ColH突變體的活性是野生型ColH的20%?；蛘咚龅耐蛔凅wColH是在Glu451處突變?yōu)槠渌?0種氨基酸殘基的任何一種，特別是E451A和E451Q。在一個實施方式中，所述在藥學上可接受的載體中的突變體膠原蛋白酶被注射到所述脂肪組織中，優(yōu)選的，使用液體的藥學上可接受的載體中的突變體膠原蛋白酶溶液進行注射，優(yōu)選的，所述載體為水溶液，更加優(yōu)選的，所述脂肪組織是皮下的，所述溶液透過皮膚在一個位置或多個相近位置進行注射。在另一個實施方式中，所述修飾的突變體膠原蛋白酶在表皮的藥學上可接受載體中，其可以通過透皮給藥技術(shù)，例如Hydroxysome技術(shù),被送到皮下的白色脂肪細胞或凸起的疤痕中。在另一個實施方式中，突變體膠原蛋白酶的用量為每克待治療的脂肪組織大約I到30ABC單位的突變體膠原蛋白酶(肥胖大鼠中1-50單位每脂肪墊)。膠原蛋白酶ABC活性單位在37°C下使用Worthington Biochem的膠原蛋白酶分析流程(保溫5小時)進行計算。優(yōu)選的，突變體膠原蛋白酶在液體的藥學上可接受載體中以濃度為5到大約500ABC單位每毫升被引入。此外優(yōu)選的，突變體膠原蛋白酶在表皮霜劑的藥學上可接受載體中以濃度為5到大約500ABC單位每毫升被引入。在另一個實施方式中，所述藥學上可接受載體中的突變體膠原蛋白酶被注射入所述脂肪瘤中。所述藥學上可接受載 體中的突變體膠原蛋白酶作為一種化學的脂肪抽吸劑被注射入脂肪墊。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的突變體膠原蛋白酶可以伴隨透皮技術(shù)用作脂肪分解霜，或替代脂肪抽吸術(shù)的表皮霜劑，或可用于疤痕減少的霜劑。換言之，本發(fā)明提供一種新的方法來減少過量的不美觀和/或冗余的皮下脂肪組織，其為非-介入性的方法，例如注射或表皮霜劑。本產(chǎn)品可以通過注射或表皮脂肪分解霜被用作化學的脂肪抽吸劑。當生物工程突變體ColH被引入活體動物的皮下脂肪組織中的時候，在該部位脂肪組織發(fā)生分解和減少。該方法既溫和又精確，其不會對人體造成外傷，也不會產(chǎn)生感染。本發(fā)明還致力于脂肪瘤的減少和清除，不論脂肪瘤是發(fā)現(xiàn)于皮膚表面、皮膚內(nèi)部、皮下、或是身體的任何其它部位。脂肪瘤一般地是脂肪組織的良性腫瘤。目前，脂肪瘤通過手術(shù)進行去除，其潛在地造成被手術(shù)的病人的疼痛和血腫。本發(fā)明通過向脂肪瘤引入有效量的突變體ColH而避免了這些問題。該突變體蛋白比野生型ColH更加穩(wěn)定，而具有更低的活性。其以緩慢柔和的方式溶解脂肪，且在肥胖大鼠的解剖實驗中很少觀察到出血。ColH突變體可以被開發(fā)為藥物，因為它是一種單一的物質(zhì)，易于進行CMC (化學品生產(chǎn)控制)。本發(fā)明額外的應用是疤痕減少，無論疤痕是否發(fā)現(xiàn)于皮膚表面。突變體膠原蛋白酶能夠消化凸起的疤痕組織中過度生長的膠原蛋白，從而減少疤痕的高度和外觀。純化自商業(yè)來源的膠原蛋白酶(包括來自溶組織梭狀芽胞桿菌的)是由5-6種膠原蛋白酶組成的混合物。即使經(jīng)過高度純化，具有相似的分子量和等電點(PIs)的ColH和ColG也是很難進行分離的。因此，來自溶組織梭狀芽胞桿菌的高度純化版本的膠原蛋白酶仍然包括ColG和ColH的混合物。在我們進行的肥胖大鼠實驗中，通過常規(guī)過程純化的野生型膠原蛋白酶誘導了大量出血。本發(fā)明還可以被用于治療脂肪瘤和其它脂肪組織，其可以在人和動物體內(nèi)、在野生動物中、在人類家庭中、或在動物園里。人類含有一層脂肪組織，其主要由我們皮下相互連接的脂肪細胞組成。本發(fā)明通過向脂肪組織中引入有效量的單一突變體ColH (溶組織梭狀芽胞桿菌)，能夠減少我們皮下脂肪組織的數(shù)量。在來自于“組織進展(Advance Tissues公司)”的專利中，他們使用了一種來自于溶組織梭狀芽胞桿菌的膠原蛋白酶混合物，其在我們進行的大鼠實驗中誘導了大
量出血。I)為了降低膠原蛋白消化活性的ColH突變基礎因為溶組織梭狀芽胞桿菌膠原蛋白酶廣泛的底物專ー性和在培養(yǎng)物濾液中的大量存在，它已經(jīng)被普遍地用于可聯(lián)結(jié)組織的分解和組織培養(yǎng)細胞的分離(Seglen，P. 0. 1976，Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13:29-83)。然而，至少六種具有分子量范圍為68-125kD的不同形式(膠 原蛋白酶)存在于商業(yè)制備的產(chǎn)品中(Bond，M. D.，和 Van Wart, H. E.，1984，Characterization of individualcoilagenases from Clostridium histolyticum. Biocnemistry 23:3085—3091)。 等^
的酶進行分離的困難和市售膠原蛋白酶制備中不同批次的差異限制了它的實際應用?；瘜W品生產(chǎn)控制(CMC)在藥物開發(fā)中是非常重要的。每ー批次的制備都應當是一致的。因此，這種純化困難導致將直接純化自溶組織梭狀芽胞桿菌的膠原蛋白酶作為藥物施用于人體的過程出現(xiàn)了潛在的問題。ColH 基因編碼 116kD 的膠原蛋白酶(Yoshihara，K.，Matsushita, 0.，Minami，J.，和 Okabe，A. Cloning ana nucleotiae sequence analysis of tne colH genefrom Clostridium histolyticum encoding a collagnease and a gelatinase.J. Bacteriol. 176:6489-6496)。在ColH的C-末端含有110個殘基的膠原蛋白-結(jié)合域(Wilson, J. J.，Matsushita, 0.，OKabej A.，和 Sakon，J.，A bacterial collagen-binaingdomain with novel calcium-binding motif controls domain orientation, EMBOJ. 2003, 22(8):1743-1752),其在體外結(jié)合不溶性的I型膠原蛋白(Matsushita，0.，Yoshihara, K.，Katayama,SA.，Minami,J.， 和 Okaoe，A. 1994. Purification andcharacterization of a Clostridium histolyticum 120_kilodalton collagenaseand nucleotide sequence of the corresponding gene. J. Bacteriol. 176:149-156)，并在體內(nèi)結(jié)合膠原纖維(Nishi，N.，Matsushita, K.，Yuube，H.，Miyanaka，A.，Okabe，A.，和WadajF. 1998. Collagen-binding growth factors!production and characterizationof functional fusion proteins having a collagen-binding domain. Proc. Natl.Acad.，Sci.USA95:7018-7023)。因此ColH非常專ー性地切斷脂肪細胞之間的膠原蛋白。ColH能夠切斷PXGP序列中甘氨酸殘基的氨基ー側(cè)的肽鍵(Peterkofsky，B.，1982.Bacterial collagenase. Methods EnzymoI. 82:453-471)。原子吸收分光光度測定法和螯合劑金屬置換等研究已經(jīng)表明，姆分子ColH包含一個催化所必需的鋅原子(Angelton，E.L，和 Van Wart, H. E. 1988. Preparation and reconstitution with divalent metalions of class I and class II Clostriaium histolyticum appocoIlagenases.Biochemistry27:7406-7412),因此ColH被認為是ー種鋅金屬蛋白酶。N-末端的 80kD 包括 ColH 的活性位點(Matsushita，0.，Jung, C-M.，Minami, J.，Katayama, S. , Nishi, N.和Okabe A. 1998. A stuay of tne collagenase—binding domain ofa 116-kDa Clostridium histolyticum collagenase. J. Biol. Chem. 273:3643-3648)。這ー肽段包括序列ffiXXH，其為鋅金屬蛋白酶(zincin)的共有基序，存在于大多數(shù)鋅金屬蛋白酶中。鋅金屬蛋白酶超家族包括脊椎動物膠原蛋白酶(基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs))作為基質(zhì)金屬蛋白酶亞家族。對同工型膠原蛋白酶ColA、ColG和ColH的氨基酸序列比對表明，它們保守于序列E446 (ColG為D) E447XXXE451的鋅金屬蛋白酶基序C-末端序列。這可能是另一個鋅結(jié)合位點。因此當我們尋找一種較野生型活性降低的ColH時，我們將目標定位于HEXXXH 和 E446EXXXE451O根據(jù)Jung等人的研究(Jung, C_M.等· Identification of metal ligands in theClostridium histolyticum ColH collagnease, J. Bacteriology, 1999 May:2816-2822),作為所有Glu446和Glu451突變體中酶活性降低最多的兩個突變體，E446A和E451A突變的ColH的Km值沒有發(fā)生顯著變化(分別為O. 957和O. 91)，這表明它們的底物結(jié)合(例如與膠原蛋白)沒有被削弱。因此，看起來突變沒有改變 酶的球狀三維結(jié)構(gòu)。另一方面，它們的Kcat值顯著下降，這表明催化作用被削弱了。因此我們選擇的突變體ColH E451D按照正常的方式與底物結(jié)合。其具有降低的催化活性，這意味著它比野生型ColH較慢地剪切膠原蛋白。(注Km定義為真實的酶底物復合體解離常數(shù)；Kcat定義為酶-底物復合物化學轉(zhuǎn)化為酶-產(chǎn)物復合物的一級反應速率常數(shù))。推測的ColH催化中心的結(jié)構(gòu)如圖2所示。2)突變體ColH注射入脂肪細胞選擇藥學上可接受的載體，包括對突變體ColH呈惰性的載體，是本領域的常規(guī)技術(shù)手段。例如生理鹽水、葡聚糖水溶液和羥乙基淀粉水溶液等，優(yōu)選適合緩沖至中性pH?？梢允褂美w維蛋白膠作為載體，其包括纖維蛋白或纖維蛋白前體，例如纖維蛋白原加凝血酶；參見美國專利No. 5，279，825。此外，載體的選擇和劑型制備的方法也是本領域的常規(guī)技術(shù)手段。雖然水和鈣離子是酶的激活所必需的，但是存在于皮下組織中的含水的組織間隙液已經(jīng)足夠做到這一點。上述載體適合權(quán)利要求I中的突變體ColH的注射輸送。醫(yī)師首先選擇他/她所想要治療的身體的部位。為了限制一次注入體內(nèi)的酶的數(shù)量，以及允許對結(jié)果進行初步評定，可以在初步治療的時候選擇有限的區(qū)域-其可以小于全部區(qū)域。治療用的溶液透皮注射到皮下脂肪組織，如果醫(yī)師或病人強烈要求的話，在注射前實行輕度局部麻醉。為了一定數(shù)量的酶溶液能夠發(fā)揮其最大功效，其應當在區(qū)域內(nèi)的多個相鄰點位處分別進行少量注射，優(yōu)選間距不大于大約2厘米，甚至更小。要獲得最佳效果需要分時注射，例如每3天注射一次或每周注射2到3次。本發(fā)明的突變體ColH來自于生物工程化的ColH菌株，使用E. coli作為宿主。突變體ColH的效能測定是根據(jù)其在pH 7. 2和37°C下對于非變性膠原蛋白(來自牛筋)消化5小時的結(jié)果得到的。所裂解的肽鍵數(shù)量通過與茚三酮的反應測得。胰蛋白酶消化對照所釋放的氨基被從中扣除。一個凈的ABC單位的膠原蛋白酶能夠溶解的茚三酮反應物質(zhì)相當于每分鐘I. 09納摩爾亮氨酸?？山邮茌d體中的濃度根據(jù)下述原則進行選擇含有足夠多的液體以能夠在皮下的脂肪組織中充分擴散，而不多于足夠攜帶所需數(shù)量的活性物進入待治療的區(qū)域。每毫升大約50到500ABC單位膠原蛋白酶的濃度范圍是合適的，而特定環(huán)境下選擇在此范圍內(nèi)和相當多地超出該范圍也是可能的。因為擴散進入脂肪組織和由此帶來的脂肪解離很少是徹底的，一般需要重復該治療至少一次。其可以在幾天以后進行，例如3天或一周后。注射權(quán)利要求I中的突變體膠原蛋白酶可以替代脂肪抽吸術(shù)或被用于脂肪抽吸術(shù)的輔助手段。該治療導致脂肪組織的充分破壞，使之更容易被抽吸清除。脂肪抽吸階段將在施用本發(fā)明的I到3天后實施。
脂肪瘤一般通過手術(shù)或脂肪抽吸進行清除。通過使用突變體ColH，脂肪瘤的腫塊可以被徹底清除。以上所述的流程、載體、劑量和濃度可應用到脂肪瘤的治療中。3)表皮杭-皮下脂肪團和疤痕減少霜劑權(quán)利要求I中的修飾的突變體ColH可以通過合適的透皮傳遞方法通過表皮被送到脂肪細胞中。定位突變體膠原蛋白酶到脂肪細胞維管結(jié)構(gòu)的信號肽有助于繞開皮膚內(nèi)的所有膠原蛋白(Nature Medicine 10 (6)，p625_632，2004)。70%的人體蛋白是由膠原蛋白組成。因此該信號肽能夠消除表皮膠原蛋白酶變體干擾皮膚結(jié)構(gòu)的副作用。迄今為止只有很少的透皮技術(shù)能夠遞送大的蛋白質(zhì)進入皮膚，特別是當它大于40kD的時候。本發(fā)明的修飾的突變體膠原蛋白酶大小為120kD。然而，一種新的透皮技術(shù)使用Hydroxysome,或陶瓷輕基磷灰石(化學純磷酸I丐，美國專利號#6，096, 324和專利號#6, 120，782)，能夠遞送大的蛋白質(zhì)，例如900KD的膠原蛋白進入表皮層、真皮層和脂肪細 胞區(qū)域。因此結(jié)合恰當?shù)耐钙鬟f方法，本發(fā)明中的修飾的突變體膠原蛋白酶是ー種有效的抗-皮下脂肪霜劑，其能夠到達脂肪細胞并有效地溶解脂肪。另外，結(jié)合恰當?shù)耐钙の辗椒?，本發(fā)明中的修飾的突變體膠原蛋白酶是ー種有效的傷痕減少霜劑，其能夠慢慢地消化疤痕組織中過度生長的膠原蛋白。


圖I描述了突變體ColH和修飾的突變體ColH蛋白和DNA序列，使用Xa因子進行酶切。圖2描述了推測的ColH活性位點。鋅-配位鍵和氫鍵分別使用粗箭頭和點線標注。細箭頭表示反應機理的第一步(來自J. Bacteriology, May 1999，p. 2816-2822) 圖3是純化的ColH (E451D)的7. 5%PAGE凝膠電泳圖，以及野生型ColH和突變體ColH(E451D)的穩(wěn)定性結(jié)果。第I道(lane I)為天然的ColH (IOug)加入胰蛋白酶(Iug)進行保溫，第2道為加入胰蛋白酶(2ug)保溫，二者均在4°C下保溫I小吋。第3道ColH(E451D, IOug)加入胰蛋白酶(0. 5ug)進行保溫，第4道加入胰蛋白酶(Iug)保溫，第5道加入胰蛋白酶(2ug)保溫，均在4°C下保溫I小時。在I小時的保溫后，使用0. 5ul的0. IMPMSF終止消化反應。每個保溫結(jié)果通過7. 5%SDS-PAGE進行檢測。圖4表示使用ColH(E451D)注射的脂肪組織分解。所處理的脂肪墊位于大鼠后腿的后部。左側(cè)的脂肪墊注射用生理鹽水稀釋的5個單位的E451D，右側(cè)只注射生理鹽水。圖5表示使用ColH-FM和Hydroxysome表皮霜劑的大鼠脂肪墊的減少，解剖結(jié)果。圖6表示使用ColH(E451D)和Hydroxysome表皮霜劑的癥痕的減少。
具體實施例方式I. ColH 的克隆(GST-Co 1H，使用 pGEX5T_3 質(zhì)粒)I) ColH 的 DNA,來自日本可川醫(yī)學校(Kagawa Medical School)的Dr. Matsushita(2ug, pCHCII)2)使用下列引物、ColH的DNA (來自Dr. Mat sushita)作為模板進行PCR，得到2. 95kb DNA 片段。YO181:AAAGGATCCGTACAAAATGAAAGT
Y0182:AAACTCGAGTTATCTTCCTACTGAACC3)使用限制性內(nèi)切酶(來自New England Biolabs)BamHI和Xhol酶切A87片段和PGEX-5T-3載體。連接酶切得到的載體和片段。轉(zhuǎn)化TOPlO細胞，涂布于氨芐青霉素(O. Img/ml)瓊脂糖平板。4)經(jīng)過小型制備和DNA測序確認平板上的一個菌落攜帶有野生型ColH的正確序列。5)使用 pGEX5T-3_ColH(野生型)轉(zhuǎn)化 BL2I (E3)/pLysS (來自 Invitrogen)。2)引入E45ID突變體。a) PCR片段4 :使用下列引物、ColH野 生型cDNA作為模板進行PCR YO181:AAAGGATCCCCGTACAAAATGAAAGTY0208:CCTGCAAATAAATCTGCTCCACCTTCTTCATACCAAG片段5 :使用下列引物、ColH野生型cDNA作為模板進行PCR Y0209:GTGGAGCAGATTTATTTGCAGGTTCTACTAGAACTTCY0182:AAACTCGAGTTATCTTCCTACTGAACC片段6 :使用下列引物、片段I和2作為模板進行PCR YO181:AAAGGATCCCCGTACAAAATGAAAGTY0182:AAACTCGAGTTATCTTCCTACTGAACCb)使用限制性內(nèi)切酶(來自New England Biolabs) BamHI和Xhol酶切片段6和PGEX-5T-3載體。連接酶切得到的載體和片段。轉(zhuǎn)化TOP 10細胞，涂布于氨芐青霉素(O. Img/ml)瓊脂糖平板。c)經(jīng)過小型制備和DNA測序確認平板上的一個菌落攜帶有ColH E451D的正確序列。d)使用 pGEX5T-3-ColH(E451D)轉(zhuǎn)化 BL21 (E3)/pLysS (來自 Invitrogen),涂布于含氨節(jié)青霉素(O. lmg/ml)和氯霉素(O. lmg/ml)的瓊脂糖平板。結(jié)論對野生型和突變體ColH質(zhì)粒進行測序，確認序列的可靠性。3)在突變體 ColH(E451D)N-末端引入 CKGGRAKDC-GG〔命名 ColH-FM)I)使用下列引物、pGEX5T-3-ColH(E451D)作為模板(見上一節(jié))進行PCR，得到2. 95kb DNA 片段。LHlAAAGGATCCTGTAAGGGAGGAAGAGCTAAGGATTGTGGAGGAGTACAAAATGAAAGT
LH2:AAACTCGAGTTATCTTCCTACTGAACC2)使用限制性內(nèi)切酶(來自New England Biola2s) BamHI和Xhol酶切片段LH12和PGEX-5T-3載體。連接酶切得到的載體和片段。轉(zhuǎn)化DH5a細胞，涂布于氨芐青霉素(O. lmg/ml)瓊脂糖平板。3)挑選菌落，進行小型制備獲得DNA，測序4)使用 pGEX4T-3-修飾的 ColH(E451D)轉(zhuǎn)化BL21 (E3)/pLysS (來自 Invitrogen)。2.純化試劑PGEX5T-3-ColH 451 突變體和 PGEX5T-3-修飾的 ColH(E45lD)
LB肉湯(高壓滅菌)IPTG,氨芐青霉素，氯霉素，DTT, PMSF。谷胱甘肽瓊脂糖珠(50%こ醇衆(zhòng)，Pharmacia)Xa 因子(AmershanBioscience, 400 單位，用水稀釋至 I 單位 /ul, 4 度)細胞裂解液PBS+0.l%NP40+5mM DTT+0. ImM PMSF 洗滌緩沖液PBS+5mMDTT裂解緩沖液50mMTri s pH 8. 0, IOOmM NaCl, 2. 5mM CaC12+lmM DTT方法I)在新制的LB+氨節(jié)青霉素(0. lmg/ml) +氯霉素(0. lmg/ml)瓊脂糖平板上劃線接種用甘油保藏的pGEX5T-3-ColH 451。37°C培養(yǎng)過夜。2)挑ー個菌落，開始5ml的LB+氨芐青霉素(Amp) +氯霉素培養(yǎng)，37°C振蕩4小吋。3)將5ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到100ml LB+Amp+氯霉素的搖瓶中，37°C振蕩過夜。4)使用4X 25ml過夜的培養(yǎng)物接種4X IL LB+Amp+氯霉素的搖瓶(在2. 8L的大搖瓶中)，37°C振蕩，0. D. 600=0. 6-1的時候使用IPTG(0. 2mM)進行誘導。5)室溫下振蕩過夜大約16小時。6) 500rpm下離心10分鐘收獲細胞。7 ) 4 °C下用40ml細胞裂解液重懸。8)4°C超聲打碎細胞。9) 4°C> 17000rpm下離心30分鐘。將上清液保存在50ml的Falcon管中。10)在上清液管中添加4ml 50%的谷胱甘肽瓊脂糖珠。4°C保溫過夜。11)將所有上清液和珠粒傾入小柱子。4°C下使用毎次IOml洗滌緩沖液洗滌，共三次。12) 4°C下使用IOml裂解緩沖液洗滌柱子一次。13)封閉柱子底部，4°C下向柱子中加入4ml裂解緩沖液，其中加入200ul(Xa因子，I單位/lul)。4°C保溫過夜。Xa因子4°C下在裂解緩沖液中過夜，I單位裂解大約IOOugGST標簽蛋白。14)打開柱子底部，洗脫蛋白，將洗脫液保存在15ml falcon管中。再用2ml裂解緩沖液洗滌柱子I次，將洗脫液保存在同一根15ml falcon管中。結(jié)論在ー步親和純化后純度大約90%。3.突變體ColH和修飾的突變體ColH的活性檢測試劑* 0. 05M TES (三羥甲基氨基甲烷(羥甲基)-甲基-2_氨基こ烷磺酸鹽)緩沖液添加0. 36mM氯化鈣，pH 7. 5 4%茚三酮的甲氧基こ醇溶液 0. 2M檸檬酸鈉緩沖液添加0. 7ImM氯化亞錫，pH 5. 0 茚三酮-檸檬酸混合物通過將50ml 4%茚三酮的甲氧基こ醇溶液和50ml pH
5.0的添加0. 7ImM氯化亞錫的0. 2M檸檬酸鹽緩沖液混合而成。混合物攪拌5分鐘。*50% 正丙醇 底物Worthington牛跟腱膠原蛋白(編碼CL)和不含維生素的酪蛋白流程
I)稱重5份25mg Worthington牛膠原蛋白分別放入5個試管。包括至少2個試管用于空白對照，其中不含酶。2)將5. Oml O. 05M TES緩沖液加入試管中，37° C保溫15分鐘。向目標試管中加入O. Iml商業(yè)的膠原蛋白酶或突變體ColH酶稀釋物(不同濃度)開始反應。3) 5小時后，將O. 2ml溶液(剩下膠原蛋白)轉(zhuǎn)移到含有I. Oml茚三酮-檸檬酸混合物的試管中停止膠原蛋白酶反應。包括一個酶空白對照(用O. Iml TES緩沖液代替酶，與膠原蛋白保溫)。4)在沸水浴中加熱20分鐘。冷卻后，用5ml 50%正丙醇進行稀釋。放置15分鐘，讀取600nm處的吸光度。根據(jù)L-亮氨酸標準曲線測定氨 基酸微摩爾數(shù)相當于釋放的亮氨酸的量。結(jié)論E451D為來自Worthington-biochem膠原蛋白酶活性的20%。4. ColH變體的穩(wěn)定性實驗使用蛋白酶胰蛋白酶來評價ColH的穩(wěn)定性。I)制備lug/ul胰蛋白酶(來自Sigma)2)將IOug野生型或突變體ColH置于Eppendorf管中，用PBS稀釋到lug/ul。3)對于每種蛋白，在管I中，加入O. 5ul lug/ul胰蛋白酶；在管2中，加入Iul lug/ul胰蛋白酶；在管3中，加入2ul lug/ul胰蛋白酶。4)在冰上保溫I小時。5 ) 7. 5%SDS PAGE 檢測。結(jié)論E451D的穩(wěn)定性是野生型ColH的兩倍。5.突變體ColH (E451D)溶脂(注射)的肥胖大鼠實驗a)肥胖大鼠喂養(yǎng)流程購買大約50g的S. D.大鼠。按照以下方式喂養(yǎng)食物每IOOg主食中，加入豬油10g，奶粉125g，蛋60g，魚油10滴。在開始的1_2周，每只大鼠每天供給13g食物。在第3周，每只大鼠每天供給15g。在第4周，每只大鼠每天供給17g。等等諸如此類。第8周后，大鼠重量大約200-300g，準備進行實驗。b)注射流程將O. Iml的液體注射入后腿的每個脂肪墊上。一般地，可以觀察到對于每脂肪墊進行透皮注射大約3到大約50ABC單位的膠原蛋白酶的劑量，能夠在24小時后有效地溶解注入端的脂肪墊，而只伴隨著極少量的出血?？梢钥闯鲭S著劑量的增加，溶脂效果和空隙的出血量也趨向于增加。超過50ABC單位和更高的劑量導致相當多的局部出血，但是在劑量為5到50ABC單位下出血量非常小，甚至沒有。動物模型S. D.大鼠，雄性和雌性。使用的突變體E451D ColH材料每克膠原蛋白酶的ABC單位163，000溶劑滅菌的生理鹽水麻醉，通過腹部注射(I. P.)
實驗過程通過腹膜內(nèi)注射麻醉大鼠。對于每只雄性大鼠，在一條腿后面的ー個脂肪墊被注射入生理鹽水，在另一條腿后面的ー個脂肪墊被注射入5個單位的突變體膠原蛋白酶ColHE451D。在2天或3天后額外注射相同的活性単位。20只S. D.肥胖大鼠，10只雌性，10只雄性(自50g開始進行8周的喂養(yǎng))，重量為200-300g。使用5u的ColH E451D按照5種不同的方案對它們進行注射。每種方案使用4只大鼠，2只雌性2只雄性。實驗A大鼠的數(shù)量4只S. D.大鼠，兩只雌性兩 只雄性。大鼠I :雄性，261g ;大鼠2 :雄性，312g ;大鼠3 :雌性，232g ;大鼠4 :雌性，239g。測試液5u ColH E451D溶于0. ImL生理鹽水使用22標準直徑(gauge),8〃的針注射將溶液慢慢地注入脂肪墊，抽針。第I天結(jié)果在第3天對四只大鼠進行解剖。位置I (后腿后面的ー側(cè))生理鹽水觀察到正常的脂肪墊。位置2 (后腿后面的另ー側(cè))5u。注射區(qū)域的大多數(shù)脂肪被溶解。只觀察到非常少的出血。沒有影響到肌肉膜。在注射位點觀察到數(shù)量可觀的油狀物，其反映了脂肪細胞的減少或破壞。實驗B大鼠的數(shù)量4只S. D.大鼠，兩只雌性兩只雄性。大鼠I :雄性，256g ;大鼠2 :雄性，249g ;大鼠3 :雌性，221g ;大鼠4 :雌性，250g。測試液5u ColH E451D溶于0. ImL生理鹽水使用22標準直徑(gauge),8〃的針注射第I天，將溶液慢慢地注入脂肪墊，抽針結(jié)果在第4天對四只大鼠進行解剖。位置I (后腿后面的ー側(cè))生理鹽水觀察到正常的脂肪墊。位置2 (后腿后面的另ー側(cè))5u。注射區(qū)域附近的脂肪被徹底溶解。周圍的脂肪容易破碎和分解。沒有影響到肌肉膜。只觀察到非常少的出血。實驗C大鼠的數(shù)量4只S. D.大鼠，兩只雌性兩只雄性。大鼠I :雄性，252g ;大鼠2 :雄性，249g ;大鼠3 :雌性，255g ;大鼠4 :雌性，206g。測試液5u ColH E451D溶于0. ImL生理鹽水使用22標準直徑(gauge),8〃的針注射將5u的溶液慢慢地注入脂肪墊，抽針。第I天將5u的溶液慢慢地注入脂肪墊,抽針。第3天結(jié)果在第5天對四只大鼠進行解剖。位置I (后腿后面的ー側(cè))生理鹽水觀察到正常的脂肪墊。
位置2 (后腿后面的另一側(cè))5u。注射區(qū)域的大多數(shù)脂肪(大于50%)被溶解。觀察到少量的出血。在注射位置觀察到數(shù)量可觀的油狀物。剩余的脂肪是分離的、易碎的和不活潑的。實驗D大鼠的數(shù)量4只S.D.大鼠，兩只雌性兩只雄性。大鼠I :雄性，240g ;大鼠2 :雄性，253g ;大鼠3 :雌性，244g ;大鼠4 :雌性，266g。測試液5u ColH E451D溶于O. ImL生 理鹽水使用22標準直徑(gauge),8〃的針注射將5u的ColH E451D溶液慢慢地注入脂肪墊，抽針。第I天將5u的ColH E451D溶液慢慢地注入脂肪墊，抽針。第4天結(jié)果在第6天對四只大鼠進行解剖。位置I (后腿后面的一側(cè))生理鹽水觀察到正常的脂肪墊。位置2 (后腿后面的另一側(cè))5u。注射區(qū)域附近的脂肪被徹底溶解。沒有影響到肌肉膜。觀察到痕量的血液。大鼠I :鹽水注射區(qū)域脂肪的重量1. 46g ；ColH E451D注射區(qū)域脂肪的重量1. 09g。大鼠2:鹽水注射區(qū)域脂肪的重量L 28g ;ColH E451D注射區(qū)域脂肪的重量1. 17g。大鼠3:鹽水注射區(qū)域脂肪的重量1. 43g ；ColH E451D注射區(qū)域脂肪的重量1. 16g。大鼠4:鹽水注射區(qū)域脂肪的重量1. 47g ；ColH E451D注射區(qū)域脂肪的重量1. 23g。實驗E大鼠的數(shù)量4只S. D.大鼠，兩只雌性兩只雄性。大鼠I :雄性，240g ;大鼠2 :雄性，266g ;大鼠3 :雌性，216g ;大鼠4 :雌性，238g。測試液5u ColH E451D溶于O. ImL生理鹽水使用22標準直徑(gauge),8〃的針注射將5u的ColH E451D溶液慢慢地注入脂肪墊，抽針。第I天將5u的ColH E451D溶液慢慢地注入脂肪墊，抽針。第3天將5u的ColH E451D溶液慢慢地注入脂肪墊，抽針。第5天結(jié)果在第6天對四只大鼠進行解剖。位置I (后腿后面的一側(cè))生理鹽水觀察到正常的脂肪墊。位置2 (后腿后面的另一側(cè))5u。
注射區(qū)域附近的脂肪被徹底溶解。沒有影響到肌肉膜。剩余痕量的血液。大鼠I :鹽水注射區(qū)域脂肪的重量0. 925g ；ColH E451D注射區(qū)域脂肪的重量0. 75g。大鼠3:
鹽水注射區(qū)域脂肪的重量1. 12g ；ColH E451D注射區(qū)域脂肪的重量1. 04g。大鼠4:鹽水注射區(qū)域脂肪的重量1. 56g ；ColH E451D注射區(qū)域脂肪的重量1. 38g。6 突變體 ColH (E451D)霜劑(N-末端引入 CKGGRAKDC-GG, ColH-FM)與hydroxysome透皮吸收方法結(jié)合使用溶解脂肪(表皮)的肥胖大鼠實驗實驗材料I. I實驗動物雄性大鼠，重85_95g,斷乳后I周I. 2 食物基本膳食由動物中心提供。高脂肪飲食成分55%基本膳食，12%豬油，10%蛋，全脂奶粉8%，蔗糖5%，花生5%，芝麻油3%，和鹽2%。I. 3肥胖大鼠模型構(gòu)建購買了 35只大鼠，喂養(yǎng)一周，使其熟悉生存環(huán)境。接下來將這些大鼠分為2組I)對照大鼠組(5只大鼠)，喂給基本膳食；和2)肥胖大鼠組(30只大鼠)，喂給高脂肪飲食，另皮下注射15%MSG鹽水溶液3g/kg (每天I次)，持續(xù)5天。在MSG注射后的第21天，肥胖大鼠組被分成6組，a)肥胖大鼠模型組，b)注射高劑量組，c)注射中等劑量組，d)表皮高劑量組，e)表皮中等劑量組，f)表皮低劑量組。這些大鼠生活在干凈環(huán)境中，每天有12小時的黑暗和12小時的日光，并具有舒適的溫度和良好的通風。大鼠可以自由地吃食物和喝水。I. 4觀測參數(shù)常規(guī)參數(shù)食物攝入，排尿和面部分泌，以及日?；顒?。生長參數(shù)重量，體長,尾巴長度，和Lee參數(shù)(Lee’s parameters)。I. 5測試藥物I. 5. IHAX (hydroxysome)溶液0. lg/ml，新鮮制備，將 0. 5g HAX 溶于 5ml 實驗用蒸餾水制得。I. 5. 2測試藥物溶液2. 3ml HAX溶液(0. lg/ml)與2ml Oulian蛋白樣品(ColH-FM)混合。5u Oulian 樣品(ColH-FM) =18ul 混合的溶液I. 5. 3對照溶液2. 3ml HAX溶液(0. lg/ml)與2ml PBS或生理鹽水溶液混合。實驗方法2. I 分組將30只肥胖大鼠隨機分為6組，每組5只大鼠。對生殖器官的脂肪墊施用測試藥物溶液I. 5. 2和對照溶液。2. 2劑量和持續(xù)時間對于每個劑量，連續(xù)9天對動物進行注射或表皮施用測試藥物溶液，每天一次。對照組每天對表皮只施用對照溶液，共9天。在第10天，殺死大鼠用于鑒定。2. 3 鑒定脂肪減少的功效鑒定是通過肉眼觀察和對受測區(qū)域脂肪墊的稱重來完成的。結(jié)果脂肪減少的解剖圖如圖5所示。表I. ColH-FM溶脂產(chǎn)品對于肥胖大鼠模型的效果(X土S)
權(quán)利要求
1.包含溶組織梭狀芽胞桿菌(Clostridiumhistolyticum)膠原蛋白酶ColH(Glu45 IAsp )蛋白序列的蛋白在制備靶向減少脂肪組織數(shù)量的藥物中的用途。
2.包含溶組織梭狀芽胞桿菌(Clostridiumhistolyticum)膠原蛋白酶ColH(Glu451Asp)蛋白序列的蛋白在制備用于減少和/或消除脂肪瘤的藥物中的用途。
3.包含溶組織梭狀芽胞桿菌(Clostridiumhistolyticum)膠原蛋白酶ColH(Glu451Asp)蛋白序列的蛋白在制備用于疤痕減少的藥物中的用途。
4.權(quán)利要求1、2或3的用途，其中的用途是注射或表皮施用。
5.權(quán)利要求4的用途，其中的表皮施用包括使用劑型為霜劑、漿液或液體形式的透皮吸收系統(tǒng)。
全文摘要
一種變異溶組織梭狀芽胞桿菌(Clostridium histolyticum)膠原蛋白酶ColH(Glu451Asp)，當注射入身體指定位置時可以溶解脂肪組織。這種蛋白產(chǎn)品在肥胖大鼠實驗中溶解脂肪墊非常有效，只有極少的副作用，觀察到很少量的出血。我們還發(fā)明了一種新的ColH突變體，該突變體在ColH(Glu451Asp)前連接有肽基序CKGGRAKDC-Gx(x為2-6個G)，稱為表皮ColH-FM,能夠靶向針對白色脂肪墊結(jié)構(gòu)。結(jié)合新穎的透皮吸收技術(shù)(例如Hydroxysome技術(shù))，我們開發(fā)了一種可以溶解脂肪的表皮蛋白霜劑。這種產(chǎn)品可以用作脂肪分解霜和化學吸脂劑。這種ColH-FM還可以注射入脂肪組織，作為脂肪抽吸術(shù)的替代手段或者輔助方法。因為凸起的疤痕是由膠原蛋白的過度生長形成的，本發(fā)明的變異ColH(Glu451Asp)或ColH-FM霜劑可以用于減少疤痕。
文檔編號A61P17/00GK102784387SQ20121021262
公開日2012年11月21日 申請日期2008年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月14日
發(fā)明者倉勇, 瑞那托·瓊斯, 黃嵐 申請人:友萊爾皮膚產(chǎn)品有限責任公司