專利名稱：一種新型真菌蛋白酶及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在多種應(yīng)用、特別是衣物和餐具洗滌劑中有用的一種真菌絲氨酸蛋白酶。本發(fā)明涉及編碼所述酶的核酸分子、重組載體、用于產(chǎn)生所述酶的宿主細(xì)胞、包含所述酶的酶組合物以及用于制備這類組合物的方法。本發(fā)明還涉及所述酶或包含所述酶的組合物的各種用途。
背景技術(shù)：
微生物蛋白酶為最重要的水解酶之一，并發(fā)現(xiàn)其在各個產(chǎn)業(yè)部門，例如洗滌劑、食品、皮革、藥品、診斷、廢物管理和銀回收方面具有應(yīng)用。微生物胞外蛋白酶占全球工業(yè)酶總銷售的主要部分(1/3以上)(Cherry和Fidantsef，2003)。近90%的商業(yè)蛋白酶為洗滌劑用酶(Gupta等,2002)。大多數(shù)商業(yè)蛋白酶(主要中性和堿性)由屬于桿菌屬(Bacillus)的生物產(chǎn)生。枯草蛋白酶家族的絲氨酸蛋白酶或由桿菌種產(chǎn)生的枯草蛋白酶形成工業(yè)蛋白酶的最大亞群。這些酶作為洗滌劑的蛋白質(zhì)降解組分或添加劑，在商業(yè)上重要。目前使用中的商業(yè)洗滌劑制劑包括源自桿菌種的天然產(chǎn)生的堿性絲氨酸蛋白酶，或?yàn)橹亟M蛋白酶制劑(Maurer，2004)。具有改進(jìn)的催化效率和/或?qū)囟?、氧化劑和變化的洗滌條件具有更好穩(wěn)定性的天然酶變體，已通過定向誘變和/或隨機(jī)誘變開發(fā)。商業(yè)蛋白酶的實(shí)例為例如枯草蛋白酶 Carlsberg (Alcalase ⑧，Novozymes, DK)、枯草蛋白酶 309 (Savinase ，Novozymes,DK)、枯草蛋白酶 147 (Esperase ，Novozymes,DK)、Kannase (Novozymes,DK)、Purafect .⑧(Genencor Inc. , USA)、Purafect ⑧ Ox、Properase ⑧(Genencor Inc. , USA)以及 BLAP S 和 X 系列(Henkel, DE)。數(shù)種堿性絲氨酸蛋白酶(EC 3. 4. 21)和編碼這些酶的基因也已從真核生物(包括酵母和絲狀真菌)中分離。美國專利第3，652，399號和EP 519229 (Takeda ChemicalIndustries, Ltd.，JP)公開了一種源自鐮孢屬(Fusarium)(無性狀態(tài),有性型)或赤霉屬(Gibberella)(性狀態(tài),無性型)的堿性蛋白酶，具體地來自鐮孢種(Fusarium sp.)
S-19-5 (ATCC 20192，IFO 8884)、亞麻尖鐮孢(F. oxysporum f. sp. lini) (IF0 5880)或小麥赤霉(G. saubinetti) (ATCC 20193，IF06608)，所述堿性蛋白酶可用于配制洗滌劑和其它清潔劑組合物。WO 88/03946和WO 89/04361 (Novo Industri A/S，DK)公開了包含蛋白酶和脂肪酶的酶促除垢添加劑和洗滌劑組合物，其中所述真菌蛋白酶來自鐮孢，具體地尖鐮孢(F. oxysporum)或腐皮鐮孢(F. solani)。在W089/06270中公開了一種除垢添加劑,其包含對鄰近僅一或兩個特定氨基酸的肽鍵特異的蛋白酶。W01994025583 (NovoNordisk A/S，DK)公開了可從鐮孢種(具體地尖鐮孢的菌株(DSM 2672))中得到的一種活性胰蛋白酶樣蛋白酶，和編碼所述蛋白酶的DNA序列。在WO 2006101140 (S0DX Co. Ltd, Nakamura)中公開了源自鐮孢種BLB(FERM BP-10493)的新型蛋白酶的氨基酸序列。另外，已報道來自真菌種(例如念球?qū)?Tritirachium)和耳霉屬(Conidiobolus))的堿性蛋白酶(在Anwar和Saleemuddin, 1998 中綜述)。在不同應(yīng)用中使用真菌絲氨酸蛋白酶也已從數(shù)個專利申請中得知。例如，在WO1992018599 (NovoNordisk A/S)中公開了作為除垢添加劑或洗滌劑組合物的纖維素酶和蛋白酶(具體地來自鐮孢種DSM 2672的胰蛋白酶樣蛋白酶)的組合。如在WO 1992003529和WO 1992005239 (NovoNordisk A/S)中所公開，這類洗滌劑組合物可進(jìn)一步包含可逆的蛋白酶抑制劑用于使酶穩(wěn)定。在WO 1997028243 (NovoNordisk A/S)中公開了使用酶雜合體從纖維素織物中去除或漂白污物或污跡的方法，所述酶雜合體包含這類蛋白酶的催化活性氨基酸序列，其與包含纖維素結(jié)合域的氨基酸序列連接。WO 1997002753 (NovoNordisk A/S)公開了使用脂肪酶和蛋白酶(優(yōu)選地為可從鐮孢得到的絲氨酸蛋白酶)溫和清洗受污工藝設(shè)備的方法。在EP 1464626專利申請(Biovitis S. A. ,FR)中公開了木賊鐮孢(F. equiseti)和其它真菌在減少廢水中的有機(jī)物中的用途。社會經(jīng)濟(jì)挑戰(zhàn)和政府規(guī)章已迫使洗滌劑產(chǎn)業(yè)考慮許多環(huán)境問題，不僅包括使用更溫和的化學(xué)制品(其可小量使用并因此遺留更少的環(huán)境廢跡)，還包括節(jié)能的需要。洗滌劑用酶(具體地蛋白酶)為洗滌劑組合物中的重要組分。通過降低洗滌溫度節(jié)約能源的需要和不可耐高溫的合成纖維的使用增加以及當(dāng)前的生活方式，已將消費(fèi)者習(xí)慣向低洗滌溫度轉(zhuǎn)變，并已造成對在低溫下有效的新酶的需求。盡管已出版大量專利出版物、綜述和論文這一事實(shí)，其中已公開(例如在EP0290567和EP 0290569 (Novo Nordisk A/S, DK)中)來自各種微生物的絲氨酸蛋白酶，例如,來自放線菌(達(dá)松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei))和真菌(馬昆得擬青霉(Paecilomyces marquandii))微生物的低溫堿性蛋白酶,但是對備選的絲氨酸蛋白酶仍有巨大需求，所述絲氨酸蛋白酶在修飾、降解和去除蛋白質(zhì)物質(zhì)(特別地在低或中溫范圍)中適用并有效，并且在存在具有高度變化特性的洗滌劑的情況下穩(wěn)定。洗滌劑產(chǎn)業(yè)在使其新產(chǎn)品適應(yīng)消費(fèi)者習(xí)慣和需要、新紡織產(chǎn)品的性質(zhì)和新洗滌機(jī)方面正在取得巨大進(jìn)步。顯然，當(dāng)開發(fā)新洗滌劑(具體地衣物和餐具洗滌組合物)時，必須滿足大范圍變化和迅速改變的需求。為了滿足洗滌劑產(chǎn)業(yè)和政府規(guī)章的所有變化需求，用于洗滌劑組合物的新絲氨酸蛋白酶組分不僅應(yīng)該能夠在寬PH和溫度范圍內(nèi)完成其任務(wù)并在各種條件下(包括與各種不同洗滌劑聯(lián)合的機(jī)械和化學(xué)干預(yù))保持穩(wěn)定，還需要的是，所述絲氨酸蛋白酶可大量生產(chǎn)，這可通過簡化從發(fā)酵液和菌絲體中的分離而節(jié)約下游處理成本。發(fā)明概述本發(fā)明的目的為提供一種真菌來源的絲氨酸蛋白酶，其顯示寬的底物特異性，在寬PH范圍下有活性并具有寬的最適溫度，即在低溫和中溫均起作用。用于衣物和餐具洗滌劑的絲氨酸蛋白酶必須在存在洗滌劑的情況下也穩(wěn)定或與洗滌劑兼容。具體而言，本發(fā)明的目標(biāo)為提供一種絲氨酸蛋白酶，其能夠在比目前商業(yè)酶制劑更低的溫度下去除蛋白質(zhì)材料(包括在洗滌衣物和餐具中的污跡)，從而節(jié)約能源。所述真菌絲氨酸蛋白酶可在高產(chǎn)的真菌宿主中產(chǎn)生，且其下游處理(例如分離發(fā)酵液和菌絲體)容易進(jìn)行。本發(fā)明涉及一種真菌絲氨酸蛋白酶，其具有絲氨酸蛋白酶活性且包含如SEQ IDN0:15定義的成熟Fe_RF6318酶的氨基酸序列或與SEQ ID NO : 15定義的成熟Fe_RF6318酶的氨基酸序列具有至少86%同一性的氨基酸序列。 本發(fā)明的酶可自木賊鐮孢得到，更優(yōu)選來自保藏菌株CBS 119568。所述酶具有在25_35kDa之間的分子質(zhì)量。所述酶在pH 9具有在30°C _70°C范圍的最適溫度。所述酶在50°C具有在至少pH 6-pH 11的pH范圍的最適pH。最適溫度和pH使用15min反應(yīng)時間和酪蛋白作為底物來確定。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶能夠在10°C -60°C之間、存在洗滌劑的情況下降解或去除蛋白質(zhì)污跡。本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶由分離的多核苷酸序列編碼，所述多核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與包含在質(zhì)粒PALK2521中的多核苷酸序列雜交，所述質(zhì)粒包含核苷酸序列SEQ IDNO :9，保藏在檢索號為DSM 22171的大腸桿菌RF7664中。所述酶由分離的多核苷酸序列編碼，所述多核苷酸序列編碼這樣的多肽，其包含如SEQ ID N0:15定義的成熟Fe_RF6318酶的氨基酸序列或與SEQ ID N0:15定義的成熟Fe_RF6318的氨基酸序列具有至少86%同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述酶由分離的核酸分子編碼，所述核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO 14o 本發(fā)明的全長真菌絲氨酸蛋白酶由包含在pALK2529中的多核苷酸序列編碼，PALK2529保藏在檢索號為DSM 22172的大腸桿菌RF7800中。所述真菌絲氨酸蛋白酶從重組表達(dá)載體中產(chǎn)生，所述重組表達(dá)載體包含編碼本發(fā)明真菌絲氨酸蛋白酶的核酸分子，所述核酸分子可操作地連接到能夠在適宜宿主中指導(dǎo)絲氨酸蛋白酶編碼基因表達(dá)的調(diào)控序列。適宜宿主包括異源宿主，優(yōu)選下列屬的微生物宿主木霉(Trichoderma)、曲霉(Aspergillus)、鐮孢、腐質(zhì)霉(Humicola)、金孢子菌(Chrysosporium)、脈抱菌(Neurospora)、根霉(Rhizopus)、青霉(Penicillium)和被抱霉(Mortiriella)。優(yōu)選所述酶在木霉或曲霉中產(chǎn)生，最優(yōu)選在里氏木霉(T.reesei)中產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及編碼真菌絲氨酸蛋白酶的分離核酸分子，所述核酸分子選自(a)以下核酸分子，其編碼具有絲氨酸蛋白酶活性并包含如SEQ ID N0:15所述的氨基酸序列的多肽；(b)以下核酸分子，其編碼具有絲氨酸蛋白酶活性并與SEQ ID NO 15的氨基酸序列具有至少86%同一性的多肽；(c)以下核酸分子，其包含如SEQ ID NO 10所述的核苷酸序列的編碼序列；(d)包含以下多核苷酸序列的編碼序列的核酸分子，所述多核苷酸序列包含于DSM 22171 或 DSM 22172 中；(e)以下核酸分子，其編碼序列與(c)-(d)的任一核酸分子的編碼序列由于遺傳密碼的簡并性而不同；和(f)以下核酸分子,其在嚴(yán)格條件下與包含在DSM 22171中的核酸分子雜交,并編碼以下多肽，該多肽具有絲氨酸蛋白酶活性并且具有顯示與如SEQ ID N0:15所述的氨基酸序列有至少86%同一性的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含本發(fā)明核苷酸序列的重組表達(dá)載體，所述核苷酸序列可操作地連接到能夠在適宜宿主中指導(dǎo)所述絲氨酸蛋白酶編碼基因表達(dá)的調(diào)控序列。適宜宿主包括異源宿主，優(yōu)選下列屬的微生物宿主木霉、曲霉、鐮孢、腐質(zhì)霉、金孢子菌、脈孢菌、根霉、青霉和被抱霉。優(yōu)選所述酶在木霉或曲霉中廣生，最優(yōu)選在里氏木霉中廣生。本發(fā)明還涉及包含如上所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞為微生物宿主，例如絲狀真菌。優(yōu)選宿主為下列屬的木霉、曲霉、鐮孢、腐質(zhì)霉、金孢子菌、脈孢菌、根霉、青霉和被抱霉。更優(yōu)選宿王為木霉或曲霉，最優(yōu)選為絲狀真囷里氏木霉。
本發(fā)明涉 及產(chǎn)生具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括以下步驟培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞和回收多肽。亦在本發(fā)明中的是，由本發(fā)明核酸序列編碼的具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽，并且所述多肽可通過上述方法得到。本發(fā)明涉及獲得酶制劑的方法，所述方法包括以下步驟培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，和從細(xì)胞中回收多肽或從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞并獲得上清液。亦在本發(fā)明中的是，可通過上述方法獲得的酶制劑。 本發(fā)明涉及一種酶制劑，其包含本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶。本發(fā)明的酶制劑可進(jìn)一步包含含或不含介質(zhì)的其它酶以及合適的添加劑，所述其它酶選自蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角質(zhì)酶、果膠酶或氧化酶，所述添加劑選自穩(wěn)定劑、緩沖劑、表面活性劑、漂白劑、介質(zhì)、防蝕劑、增效劑、抗再沉積齊U、熒光增白劑、染劑、色素、腐蝕劑、研磨劑和防腐劑，等等。因此，可使用生產(chǎn)宿主的耗盡培養(yǎng)基，或者可去除宿主細(xì)胞，和/或可將其濃縮、過濾或分級。也可將其干燥。本發(fā)明的酶制劑可呈液體、粉末或顆粒形式。亦在本發(fā)明中的是，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶或酶制劑在洗滌劑、處理纖維、處理毛織品、處理毛發(fā)、處理皮革、處理食品或飼料或涉及修飾、降解或去除蛋白質(zhì)材料的任何應(yīng)用中的用途。具體而言，所述酶或酶制劑可用作在洗滌液和洗滌粉中的除垢添加劑。附圖簡述圖I顯示了木賊鐮孢RF6318 Fe prtS8A基因的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。通過SignalP V3.0程序分析推定的信號肽以小寫字母和下劃線表示。前序列(prosequence)和如序列的推導(dǎo)氣基酸以小與字母表不。成熟核昔酸和妝序列以大與字母表不(N末端序列根據(jù)純化的野生型Fe_RF6318蛋白確定)。推定內(nèi)含子序列的位置以小寫、斜體字母表示并在核苷酸序列下以虛線標(biāo)記。終止密碼子通過序列下的星號顯示。從野生型Fe_RF6318蛋白獲得的N末端序列和肽序列用灰色背景突出。圖IA顯示了 Fe prt8A基因從ATG起始密碼子到CCT密碼子(核苷酸898-900)的核苷酸序列，該序列區(qū)編碼Fe_RF6318蛋白從Metl到Val278的氨基酸序列。圖IB顯示了 Fe prt8A基因從CTC密碼子(核苷酸901-903)到TAA終止密碼子的核苷酸序列，該序列區(qū)編碼Fe_RF6318蛋白從Leu279到Ala412的氨基酸序列。圖2不意性地顯不了用于在里氏木霉中表達(dá)Fe prt8A基因的盒。圖3顯示了在12 % SDS PAGE凝膠上分析的部分純化的重組Fe_RF6318蛋白。泳道 I :部分純化的 Fe_RF6318 樣品，泳道 2 :MW 標(biāo)記(Bench Mark Protein Ladder,Invitrogen)。圖4A描述在pH 9使用15min反應(yīng)時間和酪蛋白作為底物測定的重組蛋白Fe_RF6318的溫度概況。數(shù)據(jù)點(diǎn)為三次獨(dú)立測量的平均值。圖4B描述了 pH對重組Fe_RF6318蛋白活性的影響。所用緩沖液為40mMBritton-Robinson緩沖液，使用酪蛋白作為底物，反應(yīng)時間為15min且反應(yīng)溫度為50°C。數(shù)據(jù)點(diǎn)為三次獨(dú)立測量的平均值。圖5描述了重組Fe_RF6318蛋白在30°C、pH 9、60min對于血/牛奶/墨水污跡(Art 116, EMPA)的性能。將商業(yè)制劑 Savinase Ultra , 16L(Novozymes A/S, DK)和Purafect ⑧ 4000L (Genencor Inc. ,USA)用于比較。AL*(deltaL*)=酶處理織物的亮度值L*-僅用緩沖液處理的織物的亮度值L*(酶空白)。圖6描述了重組Fe_RF6318蛋白在50°C、pH 9、60min對于血/牛奶/墨水污跡(Art 116, EMPA)的性能。將商業(yè)制劑 Savinase Ultra ⑧ 16L 和 Purafect 4000L 用于比較。A L*(deltaL*)=酶處理織物的亮度值L*-僅用緩沖液處理的織物的亮度值L*(酶空白)。圖7A描述了在存在洗滌粉(Art. 601，EMPA)的情況下，重組Fe_RF6318蛋白在40°C、約pH 10、60min對于血/牛奶/墨水污跡(Art 117，EMPA)的性能。將商業(yè)制劑Purafect 4000L用于比較。A L*(deltaL*)=酶處理織物的亮度值L*-僅用緩沖液處理的織物的亮度值L*(酶空白)。圖7B描述了在存在洗滌粉和漂白劑(Art. 604和606，EMPA)的情況下，重組Fe_RF6318蛋白在40°C、約pH 10、60min對于血/牛奶/墨水污跡(Art 117，EMPA)的性能。將商業(yè)制劑Purafect 4000L用于比較。A L* (deltaL*)=酶處理織物的亮度值L*-僅用緩沖液處理的織物的亮度值L*(酶空白)。圖8A描述了在存在洗滌粉(Art. 601，EMPA)的情況下，重組Fe_RF6318蛋白在50°C、約pH 10、60min對于血/牛奶/墨水污跡(Art 117，EMPA)的性能。將商業(yè)制劑Purafect 4000L用于比較。A L*(deltaL*)=酶處理織物的亮度值L*-僅用緩沖液處理的織物的亮度值L*(酶空白)。圖8B描述了在存在洗滌粉和漂白劑(Art. 604和606，EMPA)的情況下，重組Fe_RF6318蛋白在50°C、約pH 10、60min對于血/牛奶/墨水污跡(Art 117，EMPA)的性能。將商業(yè)制劑Purafect 4000L用于比較。A L* (deltaL*)=酶處理織物的亮度值L*-僅用緩沖液處理的織物的亮度值L*(酶空白)。圖9顯示了重組Fe_RF6318蛋白與液體洗漆劑Ariel Sensitive在40°C、約pH7. 9、60min對于血/牛奶/墨水污跡(Art 117, EMPA)的性能。將商業(yè)制劑Savinase Ultra 16L和Purafect 4000L用于比較。x軸顯示酶用量(活性單位/ml), y軸顯示A L*(deltaL*)=酶處理織物的亮度值L*-僅用緩沖液處理的織物的亮度值L*(酶空白)。

圖10顯示了重組Fe_RF6318蛋白與不同濃度的用于有色織物的液體堿性洗滌劑(liquid base detergent)在30°C下對于血/牛奶/墨水污跡(Art 117, EMPA)的性能。將商業(yè)制劑 Purafect 4000L 和 Savinase ㊣ Ultra 16L 用于比較。AL*(deltaL*)=酶處理織物的亮度值L*-僅用緩沖液處理的織物的亮度值L*(酶空白)。圖IOA顯示了在5g/l洗滌劑濃度和pH 7. 5下的性能。圖IOB顯示了在5g/l洗滌劑濃度下的性能(酶用量以蛋白質(zhì)計(jì))。圖IOC顯示了在3. 3g/l洗滌劑濃度和pH 7. 4下的性能。 圖IOD顯示了在lg/1洗滌劑濃度和pH 7. 3下的性能。圖11顯示了重組蛋白Fe_RF6318與不同濃度Ariel Sensitive (無酶)在30°C下，在織物上對于血/牛奶/墨水污跡(Art 117，EMPA)的性能。將商業(yè)制劑Purafect 4000L和Savinase Ultra 16L用于比較。AL*(deltaL*)=酶處理織物的亮度值L*-僅用緩沖液處理的織物的亮度值L*(酶空白)。圖IlA顯示了在5g/l洗滌劑濃度和pH 8下的性能。圖IlB顯示了在5g/l洗滌劑濃度下的性能(酶用量以蛋白質(zhì)計(jì))。
圖IlC顯示了在3. 3g/l洗滌劑濃度和pH 7. 9下的性能。圖IlD顯示了在lg/1洗滌劑濃度和pH 7. 6下的性。圖12顯示了重組蛋白Fe_RF6318與液體洗滌劑Ariel Sensitive (無酶)在30°C下,在Launder Ometer試驗(yàn)中對不同污跡的性能。將商業(yè)制劑Savinase Ultra 16L用于比較。A L*(deltaL*)=酶處理織物的亮度值L*-僅用緩沖液處理的織物的亮度值L*(酶空白)。圖12A顯示了對血/牛奶/墨水/PE-棉(Art. 117，EMPA)的性能。圖12B顯示了對血/牛奶/墨水/棉(Art. 116，EMPA)的性能。圖12C 顯示了對草(Art. 164，EMPA)的性能。圖13顯示了重組蛋白Fe_RF6318與用于有色織物的液體堿性洗滌劑在30°C下，在Launder Ometer試驗(yàn)中對不同污跡的性能。將商業(yè)制劑Savinase Ultra 16L和Purafect 4000L用于比較。A L*(deltaL*)=酶處理織物的亮度值L*-僅用緩沖液處理的織物的亮度值L* (酶空白)。圖13A顯示了對血/牛奶/墨水/PE-棉(Art. 117，EMPA)的性能。圖13B顯示了對血/牛奶/墨水/棉(Art. 116，EMPA)的性能。圖13C 顯示了對草(Art. 164，EMPA)的性能。圖13D顯示了對可可粉(Art. 112，EMPA)的性能。圖14描述了 Fe_RF6318酶制劑在全規(guī)模洗滌試驗(yàn)中，對八種不同的蛋白酶敏感污跡(表5)的總污跡去除效率(A % SR) o將商業(yè)制劑Savinase Ultra 16L和Purafect 4000L用于比較。圖14A描述了當(dāng)根據(jù)活性施用蛋白酶制劑時的總污跡去除效率。圖14B描述了當(dāng)根據(jù)蛋白質(zhì)量施用蛋白酶制劑時的總污跡去除效率。圖15描述了在30°C下、全規(guī)模試驗(yàn)中與用于有色織物的液體堿性洗滌劑(liquiddetergent base)的污跡去除效率。圖15A描述了對血/牛奶/墨水/棉(C-05-014/CFT)的污跡去除。圖15B描述了對血/牛奶/墨水/PE-棉(C-05-014/CFT)的污跡去除。圖15C描述了對巧克力奶/色素/棉(C-03-030/CFT)的污跡去除。圖15D描述了對花生油/牛奶/棉(C-05-014/CFT)的污跡去除。圖15E描述了對蛋黃/色素/棉(CS-38-010/CFT)的污跡去除。圖16描述了重組Fe_RF6318蛋白在溫度10°C _60°C、pH 9、60min對于血/牛奶/ 墨水污跡(Art 117, EMPA)的性能。將商業(yè)制劑 Savinase Ultra ⑧ 16L (Novozymes A/S, DK)、Purafect 4000L (Genencor Inc. , USA)和 Properase ⑧ 4000E (Genencor Inc.,USA)用于比較。ALYdeltaI/)=酶處理織物的亮度值L*_僅用緩沖液處理的織物的亮度值L*(酶空白)。圖16A顯示了重組蛋白Fe_RF6318和商業(yè)蛋白酶制劑在10°C的性能。圖16B顯示了重組蛋白Fe_RF6318和商業(yè)蛋白酶制劑在20°C的性能。圖16C顯示了重組蛋白Fe_RF6318和商業(yè)蛋白酶制劑在30°C的性能。圖16D顯示了重組蛋白Fe_RF6318和商業(yè)蛋白酶制劑在40°C的性能。圖16E顯示了重組蛋白Fe_RF6318和商業(yè)蛋白酶制劑在50°C的性能。
圖16F顯示了重組蛋白Fe_RF6318和商業(yè)蛋白酶制劑在60°C的性能。圖17顯示了在3. 3g/l濃度的液體堿(Liquid Base)的情況下，重組Fe_RF6318蛋白在10°C和20°C下對于血/牛奶/墨水污跡(Art 117，EMPA)的性能。將商業(yè)制劑Savinase Ultra 16L、Purafect 4000L和Properase 4000 E用于比較。AL*(deltaL*)=酶處理織物的亮度值L*-僅用緩沖液處理的織物的亮度值L*(酶空白)。圖17A顯示了在10°C的性能。圖17B顯示了在20°C的性能。序列表SEQ ID NO :1來自木賊鐮孢RF6318蛋白酶的氨基末端肽#3792的序列。SEQ ID NO :2來自木賊鐮孢RF6318蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段1246. 673的序列。SEQ ID NO :3來自木賊鐮孢RF6318蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段3341. 633的序列。SEQ ID NO :4來自木賊鐮孢RF6318蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段1503. 799的序列。SEQ ID NO :5源自氨基末端肽SEQ ID NO : I的寡核苷酸引物PR087的序列。SEQ ID NO 6源自氨基末端肽SEQ ID NO 1的寡核苷酸引物PR088的序列。SEQ ID NO :7源自肽SEQ ID NO 4的寡核苷酸引物PR089的序列。SEQ ID NO :8源自肽SEQ ID NO 4的寡核苷酸引物PR090的序列。SEQ ID NO :9 使用引物PR088 (SEQ ID NO 6)和 PR089 (SEQ ID NO 7)并以木賊鐮孢RF6318基因組DNA作為模板得到的PCR片段的序列。SEQ ID N0:10全長木賊鐮孢RF6318蛋白酶基因(Fe prtS8A)的核苷酸序列。SEQ ID NO :11全長木賊鐮孢RF6318蛋白酶(Fe_RF6318)的推導(dǎo)氨基酸序列，包括從Metl到Ala412的氨基酸。SEQ ID NO 12編碼酶原形式木賊鐮孢RF6318蛋白酶氨基酸序列的核苷酸序列。SEQ ID NO :13酶原形式木賊鐮孢RF6318蛋白酶的氨基酸序列，包括全長蛋白酶的氨基酸Ala21至Ala 412。SEQ ID NO 14編碼成熟形式木賊鐮孢RF6318蛋白酶氨基酸序列的核苷酸序列。SEQ ID NO :15成熟形式木賊鐮孢RF6318蛋白酶的氨基酸序列，包括全長酶的氨基酸 Alal24 至 Ala 412。保藏物木賊鐮孢RF6318 于 2006 年 4 月 7 日保藏在 Uppsalalaan 8,3508 AD, Utrecht,Netherlands 的 Centraalbureau Voor Schimmelcultures,并分配檢索號 CBS 119568。大腸桿菌菌株RF7664(包含質(zhì)粒pALK2521)于2009年I月14日保藏在Inhoffenstrasse 7 b Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Germany 的Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ),并分配檢索號DSM 22171。大腸桿菌菌株RF7800 (包含質(zhì)粒pALK2529)于2009年I月14日保藏在Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Germany 的 Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ),并分配檢索號 DSM 22172。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種真菌來源的絲氨酸蛋白酶，該蛋白酶顯示寬底物特異性、在高pH范圍穩(wěn)定并具有寬最適溫度，即在低溫和中溫均有良好性能。所述酶對于洗滌劑應(yīng)用、抗氧化和螯合劑而言理想，且在洗滌劑溶液中在低酶水平下有效。具體而言，所述絲氨酸蛋白酶在低至10°c的溫度下有活性，優(yōu)選范圍10°C -60°c。因此，本發(fā)明提供用于洗滌劑和其它應(yīng)用的一種備選絲氨酸蛋白酶。所述真菌絲氨酸蛋白酶可在高產(chǎn)真菌宿主中產(chǎn)生，且其下游處理(例如分離發(fā)酵液和菌絲體)容易進(jìn)行。與本發(fā)明相關(guān)的“絲氨酸蛋白酶”或“絲氨酸內(nèi)肽酶”或“絲氨酸內(nèi)蛋白酶”意為通過國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)盟的命名法分類為EC 3.4.21的酶。在單細(xì)胞和復(fù)雜生物二者中均存在絲氨酸蛋白酶。基于它們的結(jié)構(gòu)相似性，已將絲氨酸蛋白酶分為至少六個氏族(clan) (SA、SB、SC、SE、SF和SG ；S指絲氨酸蛋白酶)，將所述氏族以相似的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)進(jìn)一步亞分為家方矣(參見，例如http: //www. biochem. wustl. edu/ protease/的絲氨酸蛋白酶主頁，生物化學(xué)和分子生物物理學(xué)系，華盛頓醫(yī)科大學(xué)，St. Louis, MO，USA)。這些蛋白質(zhì)水解酶或降解酶以其活性部位存在親核的絲氨酸基團(tuán)為特征，并且氏族 SA和氏族SB的蛋白酶還通過具有必需的天冬氨酸和組氨酸殘基來區(qū)分，所述殘基連同絲氨酸一起形成催化三聯(lián)體。主要的氏族包括“胰凝乳蛋白酶樣”(包括胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和彈性蛋白酶)(氏族SA)和“枯草蛋白酶樣”(氏族SB)絲氨酸蛋白酶?；趪@切割位點(diǎn)的氨基酸殘基的側(cè)鏈，所述酶靶定多肽鏈的不同區(qū)。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶屬于氏族SB。已表征的“枯草蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶”或“亞麻酶(subtilase)”通常為細(xì)菌來源。這類蛋白酶以各種桿菌為代表，如解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquifaciens)、地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)和枯草芽孢桿菌(B. subtilis) (Rao等，1998),其對芳族或疏水殘基(例如酪氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸)特異。本發(fā)明所用術(shù)語“絲氨酸蛋白酶活性”意為對含蛋白質(zhì)的底物(例如酪蛋白、血紅蛋白、角蛋白和BSA)的水解活性。用于分析蛋白水解活性的方法在文獻(xiàn)中眾所周知，且在例如Gupta等(2002)中提及?？墒褂媒M別特異性抑制劑將蛋白酶分類。不同組的“絲氨酸蛋白酶抑制劑”包括合成化學(xué)抑制劑和天然蛋白質(zhì)抑制劑。其中一組天然抑制劑為絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin,縮寫自serine protease inhibitor),例如抗凝血酶和a I-抗胰蛋白酶。人工合成抑制劑包括3，4-二氯異香豆素(3，4-DCI)、氟磷酸二異丙酯(DFP)、苯甲基磺酰氟(PMSF)和甲苯磺酰-L-賴氨酸氯甲基酮(TLCK)。由于靠近活性部位存在半胱氨酸殘基，某些絲氨酸蛋白酶被巰基試劑(例如對氯汞苯甲酸(PCMB))抑制。因此，可在適宜條件下在含或不含絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑的情況下，在基于切割特異性底物的測定法或利用任何包含蛋白質(zhì)的底物的測定法中確定絲氨酸蛋白酶活性。絲氨酸蛋白酶通常在中性或堿性pH(其中最適值在pH 7-11之間)下有活性，并具有寬底物特異性。“堿性絲氨酸蛋白酶”意為以下酶，其在pH 9-pH 11或甚至在pH10-12. 5有活性且穩(wěn)定(Shimogaki等，1991)，并具有pH 9附近的等電點(diǎn)。它們代表商業(yè)絲氨酸蛋白酶的最大亞群。堿性絲氨酸蛋白酶的分子質(zhì)量范圍在15-35kDa之間。天然絲氨酸蛋白酶的最適溫度在60°C附近(Rao等，1998)。可篩選能夠產(chǎn)生蛋白酶活性的微生物菌株，并且可確定對不同底物的活性。選出的菌株可在適宜培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在產(chǎn)生足量令人關(guān)注的絲氨酸蛋白酶之后，可將該酶分離或純化，并且可更徹底地表征其特性?；蛘?，可分離在各種生物中編碼絲氨酸蛋白酶的基因，并且可將所述基因編碼的氨基酸序列與本文實(shí)施例中分離和表征的絲氨酸蛋白酶氨基酸序列比較。產(chǎn)生的蛋白酶(具體地絲氨酸蛋白酶)可使用酶化學(xué)的常規(guī)方法純化，例如鹽制備(salt preparation)、超濾、離子交換層析、親和層析、凝膠過濾和疏水作用層析?？赏ㄟ^蛋白質(zhì)測定、酶活性測定和通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳監(jiān)測純化。可確定在各種溫度和PH值下純化酶的酶活性和穩(wěn)定性，以及分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。本發(fā)明優(yōu)選絲氨酸蛋白酶的純化已在實(shí)施例Ib中顯示。將已過濾的培養(yǎng)物上清液上樣于Q Sepharose FF柱。將流出流分上樣于苯基Sepharose HP柱并用線性遞減的鹽梯度洗脫蛋白質(zhì)。將顯示蛋白酶活性的流分合并、濃縮并上樣于Superdex 75 10/300GL柱。如實(shí)施例Ib所述，純化后接著是在試鹵靈標(biāo)記的酪蛋白上的活性測定。自然地，可能通過使用代替本文所述方法的其它已知的純化方法，或除本文所述方法之外的方法來分離本發(fā)明的酶。如實(shí)施例5所述純化重組絲氨酸蛋白酶并將其用于表征pH和溫度曲線。依照Laemmli (1970),可通過質(zhì)譜法或SDS-PAGE確定純化絲氨酸蛋白酶的分子質(zhì)量。還可從酶的氨基酸序列預(yù)計(jì)分子質(zhì)量。成熟絲氨酸蛋白酶典型地具有在20-35kDa之間的分子質(zhì)量，典型地在25_30kDa附近的分子質(zhì)量(Rao等，1998)。將絲氨酸蛋白酶以前酶原的形式合成為無活性的“酶原前體”或“酶原”，其通過去除信號序列(分泌信號肽或前導(dǎo)肽)和前序列(前肽)來激活以產(chǎn)生酶的活性成熟形式(Chen和Inouye, 2008)。此激活過程涉及蛋白酶的作用且可起因于絲氨酸蛋白酶的有限自我消化或自身催化過程。前序列可例如在生成的翻譯后階段期間、或在耗盡的培養(yǎng)基中、或在培養(yǎng)基或酶制劑儲存期間被切割。酶原的激活也可通過向宿主生物在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入能夠?qū)o活性酶原轉(zhuǎn)化成活性成熟酶的蛋白水解酶或者在培養(yǎng)過程后向培養(yǎng)上清液加入蛋白水解酶來完成。酶的縮短還可通過例如在將其轉(zhuǎn)化進(jìn)生產(chǎn)宿主之前截短編碼多妝的基因來完成。術(shù)語“成熟的”意為在去除信號序列和前肽之后包含對于酶活性或催化活性必需的氨基酸的酶形式。在絲狀真菌中，其為分泌到培養(yǎng)基中的天然形式。絲氨酸蛋白酶的最適溫度，可在適宜緩沖液中于不同溫度下，通過如實(shí)施例lc、5或14所述使用酪蛋白作為底物或如文獻(xiàn)(例如Gupta等，2002)所述使用其它底物和緩沖系統(tǒng)確定。最適pH的確定可在適宜緩沖液中于不同pH值下，通過追蹤對蛋白質(zhì)底物的活性來進(jìn)行。蛋白酶活性通?；诳扇苄缘孜锏慕到狻Ｔ谙礈靹?yīng)用中，蛋白酶必須對至少部分不溶的物種起作用。因此，對于洗滌劑用蛋白酶而言的一個重要參數(shù)為吸附和水解這些不溶片段的能力。選擇洗滌劑用蛋白酶的另一個重要參數(shù)為其等電點(diǎn)或pi值。當(dāng)洗滌劑用蛋白酶工作的洗滌劑溶液PH值接近與酶的pi值相同時，其性能最佳?？赏ㄟ^在固定化pH梯度凝膠(由聚丙烯酰胺、淀粉或瓊脂糖組成)上的等點(diǎn)聚焦或通過根據(jù)氨基酸序列估計(jì)Pl (例 如通過使用在 ExPASy 月艮務(wù)器白勺 pI/MW I[!具(http://expasy.orR/tools/pi tool, html Gasteiger 等,2003))來確定 pi。純化蛋白酶的N末端以及內(nèi)部肽可依照如實(shí)施例2所述的Edman降解化學(xué)(Edman和Begg, 1967)或通過文獻(xiàn)所述的其它方法測序。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶可源自任何生物，包括細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌、酵母乃至高等真核生物(例如植物)。優(yōu)選所述酶來源于真菌，包括絲狀真菌和酵母，例如來自選自鐮孢的屬。真菌堿性蛋白酶比細(xì)菌蛋白酶有利，這歸因于簡化產(chǎn)生無微生物的酶或酶組合物的下游處理。在純化酶之前，可通過過濾技術(shù)輕易地去除菌絲體。本發(fā)明涉及真菌絲氨酸蛋白酶，其在存在具有高度變化特性的洗滌劑的情況下，在寬溫度范圍(即從低溫到中溫，例如10°c -600C )具有良好性能。在本發(fā)明中，在存在洗滌劑的情況下的良好性能意為所述酶(這種情況下為本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶)在比許多目前出售的商業(yè)枯草蛋白酶更低的溫度范圍起作用。換言之，良好性能意為所述酶能夠在低溫到中溫范圍、但尤其是在比目前商業(yè)產(chǎn)品(例如商業(yè)酶產(chǎn)品Purafect 4000L(Genencor Inc. , USA))更低的溫度范圍降解或去除蛋白質(zhì)污跡或材料。本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶在低溫范圍起作用。例如，通過更改pH、選擇具有適宜特性的洗滌劑、包含酶保護(hù)劑和通過控制洗滌條件，可在低至10°c的溫度下維持本發(fā)明絲氨酸蛋白酶的活性。因此，取決于洗滌條件以及洗滌劑中的輔助成分和添加劑，本發(fā)明絲氨酸蛋白酶尤其可用于50°c或更低的溫度。所述酶也在45°C或更低、在40°C或更低、在35°C或更低或者在30°C或更低的溫度下起作用。在存在洗滌劑的情況下，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶在10°C _60°C之間與上文定義的一樣起作用。在實(shí)施例6-13中，描述了比較試驗(yàn)，并且從圖7到17顯而易見的是，真菌絲氨酸蛋白酶Fe_RF6318在不同條件中和受到不同處理時，對不同織物材料上眾多不同污跡的性能(測定為deltaL*或A % SR)遠(yuǎn)好于商業(yè)產(chǎn)品Savinase⑧Ultra 16L (NovozymesA/S, DK)、Purafect ⑧ 4000L (Genencor Inc, USA)和 Properase ⑧ 4000E (Genencor Inc.，USA)的性能。具體而言，所述真菌絲氨酸蛋白酶Fe_RF6318在低溫到中溫范圍內(nèi)(例如10°C -60°C )的污跡去除效果顯著高于 Savinase Ultra 16L 和 Purafect 4000L。與Properase 4000E相比，其在30°C _60°C的范圍亦具有更高的污跡去除能力。 從所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推斷，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶能夠滿足洗滌劑消費(fèi)者和洗滌劑產(chǎn)業(yè)以及工業(yè)供應(yīng)洗滌機(jī)大大變化的需求，并很好地適合于未來規(guī)章和消費(fèi)者習(xí)慣的需求。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，所述真菌絲氨酸蛋白酶為這樣的多肽，其具有絲氨酸蛋白酶活性并包含F(xiàn)e_RF6318的成熟酶，所述成熟酶具有氨基酸序列SEQ ID NO 15或者與氨基酸序列SEQ ID NO: 15有至少86%同一性或與氨基酸序列SEQ ID N0:11有至少86%同一性的氨基酸序列。優(yōu)選酶顯示至少86%、優(yōu)選至少87%、更優(yōu)選至少88%、甚至更優(yōu)選至少90%同一性。還更優(yōu)選所述氨基酸序列顯示與SEQ ID N0:15的氨基酸序列有至少92 %或至少94 %或96 %、更優(yōu)選至少98 %、最優(yōu)選99 %同一性。兩個酶的同一性在相應(yīng)序列區(qū)內(nèi)(例如在絲氨酸蛋白酶的成熟或全長區(qū)內(nèi))比較。將本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶記為Fe_RF6318(來源于木賊鐮孢的分離絲氨酸蛋白酶)，并為絲氨酸內(nèi)蛋白酶家族8氏族SB的成員。術(shù)語“同一性”在本文意為在相應(yīng)序列區(qū)內(nèi)相互比較的兩個氨基酸序列之間的同一性，所述相應(yīng)序列區(qū)具有接近相同數(shù)量的氨基酸。例如，可比較兩個氨基酸序列的全長或成熟序列的同一性。待比較的兩個分子的氨基酸序列可在一個或多個位置不同，然而這不改變分子的生物學(xué)功能或結(jié)構(gòu)。這類變化可因?yàn)椴煌拗魃锘虬被嵝蛄兄械耐蛔兌匀话l(fā)生，或者它們可通過特異性誘變來完成。變化可起因于氨基酸序列中一個或多個位置的缺失、取代、插入、添加或組合。序列同一丨I"生通過使用ClustalW比對(例如在www. ebi.ac. uk/Tools/Clustalw)來測定。使用的矩陣如下BL0SUM,缺口開放(Gap open) :10,缺口延伸(Gap extension) :0. 5。 優(yōu)選地，所述真菌絲氨酸蛋白酶可從鐮孢獲得，更優(yōu)選來自木賊鐮孢。根據(jù)最優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶可從以檢索號CBS 119568保藏在Centraalbureauvoor Schimmelculture 的菌株獲得。本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案為一種真菌絲氨酸蛋白酶，其具有絲氨酸蛋白酶活性和如SEQ ID N0:15所定義的成熟Fe_RF6318酶的氨基酸序列。所述成熟酶缺少信號序列或前導(dǎo)肽(prepeptide)以及前序列(prosequence)或前肽(propeptide)。本發(fā)明的成熟絲氨酸蛋白酶包含SEQ ID N0:11中表征的全長蛋白酶的氨基酸Alal24至Ala412。因此，具有包含信號序列(前導(dǎo)肽)和前肽的SEQ ID N0:11的全長Fe_RF6318酶，和成熟酶以及缺少信號序列(前導(dǎo)肽)因而具有SEQ ID NO :13的酶原形式，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明涉及真菌絲氨酸蛋白酶，其成熟形式具有在20_35kDa之間、優(yōu)選在25-33kDa之間、更優(yōu)選在28-30kDa之間的分子質(zhì)量或分子量。最優(yōu)選麗為預(yù)計(jì)的Fe_RF6318分子質(zhì)量，其對于成熟多肽而言為29kDa，通過在ExPASy服務(wù)器使用pi/MW工具獲得(Gasteiger 等,2003)。本發(fā)明的酶在寬溫度范圍下對降解蛋白質(zhì)材料有效。如實(shí)施例5所述，當(dāng)在pH 9使用15min反應(yīng)時間和酪蛋白作為底物測定時，所述酶的最適溫度為30°C-70°C (約最大活性的20% )，優(yōu)選40°C -60°C (至少約最大活性的40% )，以及更優(yōu)選50°C -60°C (至少約最大活性的70% )，最優(yōu)選60°C (最大活性，F(xiàn)e_RF6318)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，如實(shí)施例5所述在50°C使用15min反應(yīng)時間和酪蛋白作為底物，所述真菌絲氨酸蛋白酶具有PH范圍為至少pH 6-pH 11的最適pH，在pH10顯示超過40%最大活性。具體而言，在50°C，最適pH在pH 6-pH 10之間(約最大活性的60% )，和更優(yōu)選pH 9-pH 10之間(約最大活性的80% )，以及最優(yōu)選在pH 10。本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶“在存在洗滌劑的情況下具有良好性能”，即在低溫度范圍，特別是在比目前商業(yè)產(chǎn)品(例如商業(yè)酶產(chǎn)品Purafect 4000L(Genencor Inc.,USA))更低的溫度范圍，在存在洗滌劑的情況下能夠降解或去除蛋白質(zhì)污跡或材料。在存在洗滌劑的情況下，本發(fā)明的酶在10°C _60°C之間、優(yōu)選在50°C或更低起作用。Fe_RF6318酶也在溫度為45 0C或更低、40 0C或更低、35 °C或更低或30 V或更低起作用。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶具有pl，其如從推導(dǎo)氨基酸序列預(yù)計(jì)的在pi 9-pI 9. 5之間，優(yōu)選在Pl 9. l-pl 9. 4之間。本發(fā)明Fe_RF6318酶的預(yù)計(jì)pi為pi 9.3?？蓪⒁罁?jù)N末端氨基酸序列或純化酶的胰蛋白酶消化肽段合成的寡核苷酸或通過使用上述寡核苷酸得到的PCR產(chǎn)物，在分離編碼本發(fā)明絲氨酸蛋白酶的cDNA或基因組基因中用作探針。也可基于同源絲氨酸蛋白酶的已知核苷酸或氨基酸序列設(shè)計(jì)探針。還可基于在平板(含有對酶特異的底物)上的活性或通過使用對絲氨酸蛋白酶特異的抗體篩選絲氨酸蛋白酶克隆。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，所述真菌絲氨酸蛋白酶由分離的多核苷酸序列編碼，所述多核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與包含在的質(zhì)粒PALK2521中的多核苷酸或探針序列雜交，所述質(zhì)粒在大腸桿菌RF7664中包含核苷酸序列SEQ ID NO :9，所述大腸桿菌 RF7664 以檢索號 DSM 22171 保藏在 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen(DSMZ)。如實(shí)施例3d所述，在本發(fā)明中利用嚴(yán)格雜交，用通過PCR制備的探針分離FePrtSA基因。標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法可用于分離宿主生物的cDNA或基因組DNA，例如在分子生物學(xué)手冊(例如Sambrook和Russell , 2001)中描述的方法。與DNA探針(例如由多于100-200個核苷酸組成的SEQ ID NO :9)的雜交通常在“高嚴(yán)格”條件下進(jìn)行，即在以下溫度下雜交，所述溫度低于完全雜合體的計(jì)算解鏈溫度(Tm) 20-25°C, Tm根據(jù)Bolton和McCarthy (1962)計(jì)算。通常預(yù)雜交和雜交至少在65°C下于 6xSSC(或 6xSSPE)、5xDenhardt 氏試劑、0. 5% (w/v) SDSUOO u g/ml 變性的片段化鮭魚精子DNA中進(jìn)行。添加50%甲酰胺將預(yù)雜交和雜交溫度降至42°C。在低鹽濃度中進(jìn)行洗滌，例如在2xSSC-0. 5% SDS (w/v)中在室溫(RT)下達(dá)15分鐘，接著在RT下2xSSC_0. 1%SDS(w/v)中，以及最后至少在65°C下0. IxSSC-O. 1% SDS(w/v)中洗滌。根據(jù)一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶由分離的核酸分子編碼，所述核酸分子編碼包含在SEQ ID NO :15中表征的氨基酸序列的多肽，或者與氨基酸序列SEQ ID NO : 15具有至少86%同一性或與氨基酸序列SEQ ID NO :11具有至少86%同一性的多肽。優(yōu)選酶顯示至少86%、優(yōu)選至少87%、更優(yōu)選至少88%、甚至更優(yōu)選至少90%同一性。還更優(yōu)選所述氨基酸序列顯示與SEQ ID NO: 15的氨基酸序列有至少92%或至少94%或96%、更優(yōu)選至少98%、最優(yōu)選99%同一性。兩個酶的同一性在相應(yīng)序列區(qū)內(nèi)(例如在絲氨酸蛋白酶的成熟或全長區(qū)內(nèi))比較。因此，由編碼本發(fā)明全長絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列的核酸分子編碼的多肽序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述多肽序列包括前導(dǎo)肽(信號序列)和前肽以及酶的成熟形式，并且其氨基酸序列在SEQ ID NO : 11中表征。同樣，由編碼本發(fā)明絲氨酸蛋白酶前肽的核酸分子編碼的多肽序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述多肽序列包括前肽以及酶的成熟形式，并且其氨基酸序列在SEQ ID N0:13中表征。本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案為由分離核酸分子編碼的真菌絲氨酸蛋白酶，所述核酸分子包含編碼具有SEQ ID NO 15的Fe_RF6318絲氨酸蛋白酶成熟形式的核苷酸序列。根據(jù)一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶由包含核苷酸序列SEQ IDNO 14的分離核酸分子編碼，所述核苷酸序列編碼Fe_RF6318酶的成熟形式(SEQ ID NO 15)。因此，由具有核苷酸序列SEQ ID NO :10的核酸分子編碼的多肽在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述核苷酸序列包含酶的“編碼序列”。措辭“編碼序列”意為始于翻譯起始密碼子(ATG)并止于翻譯終止密碼子(TAA、TAG或TGA)的核苷酸序列。翻譯的全長多肽通常以甲硫氨酸開始并包含內(nèi)含子區(qū)。同樣，由包含核苷酸序列SEQ ID NO 12的核酸分子編碼的真菌絲氨酸蛋白酶在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述核苷酸序列編碼Fe_RF6318酶原形式。
根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案，所述真菌絲氨酸蛋白酶由包含在PALK2529中的多核苷酸序列編碼，PALK2529保藏于檢索號為DSM 22172的大腸桿菌RF7800中。本發(fā)明的一個實(shí)施方案為由包含核酸分子的重組表達(dá)載體產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，所述核酸分子編碼如上文表征的真菌絲氨酸蛋白酶，并可操作地連接到能夠在適宜宿主中指導(dǎo)所述絲氨酸蛋白酶編碼基因表達(dá)的調(diào)控序列。在實(shí)施例4中更詳細(xì)地描述了所述重組表達(dá)載體的構(gòu)建和所述載體的使用。
用于產(chǎn)生真菌絲氨酸蛋白酶的適宜宿主為同源或異源宿主，例如包括細(xì)菌、酵母和真菌的微生物宿主。絲狀真菌(例如木霉、曲霉、鐮孢、腐質(zhì)霉、金孢子菌、脈孢菌、根霉、青霉和被孢霉)為優(yōu)選的生產(chǎn)宿主，這是由于簡化酶產(chǎn)物的下游處理和回收。適宜宿主包括下列種，例如里氏木霉、黑曲霉(A. niger)、米曲霉(A oryzae)、醬油曲霉(A. sojae)、泡盛曲霉(A. awamori)或日本曲霉(A. japonicus)型菌株、F. venenatum 或尖鐮孢、特異腐質(zhì)霉(H. insolens)或綿毛腐質(zhì)霉(H. lanuginosa)、粗糙脈孢菌(N. crassa)和 C. Iucknowense,其中的一些在例如商業(yè)酶 AMFEP 2007 列表(http://www. amfep. org/list, html)中被列為酶生產(chǎn)宿主生物。更優(yōu)選地，所述酶在木霉屬或曲霉屬的絲狀真菌宿主中產(chǎn)生，例如里氏木霉或黑曲霉、米曲霉或泡盛曲霉。根據(jù)本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方案，所述真菌絲氨酸蛋白酶在里氏木霉中產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及編碼真菌絲氨酸蛋白酶的分離核酸分子，所述核酸分子選自(a)以下核酸分子，其編碼具有絲氨酸蛋白酶活性并包含如SEQ ID N0:15所述的氨基酸序列的多肽；(b)以下核酸分子，其編碼具有絲氨酸蛋白酶活性并與SEQ ID N0:15具有至少86%同一性的多肽；(c)以下核酸分子，其包含如SEQ ID NO 10所述的核苷酸序列的編碼序列；(d)包含多核苷酸序列的編碼序列的核酸分子，所述多核苷酸序列包含于DSM22171 或 DSM 22172 中；(e)以下核酸分子，其編碼序列與(c)-(d)的任一核酸分子的編碼序列因遺傳密碼的簡并性而不同；和(f)以下核酸分子,其在嚴(yán)格條件下與包含在DSM 22171中的核酸分子雜交,并編碼以下多肽，所述多肽具有絲氨酸蛋白酶活性并具有顯示與如SEQ ID N0:15所述的氨基酸序列具有至少86%同一性的氨基酸序列。本發(fā)明的核酸分子可為RNA或DNA，其中DNA可由基因組DNA或cDNA構(gòu)成。標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法可用于分離和酶處理編碼本發(fā)明真菌絲氨酸蛋白酶的多核苷酸序列，包括分離基因組和質(zhì)粒DNAJ^tDNA以產(chǎn)生DNA片段、測序、大腸桿菌轉(zhuǎn)化等。在標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)手冊(例如Sambrook和Russell, 2001)中描述了基本方法。編碼Fe_RF6318多肽的Fe prtS8A基因的分離在實(shí)施例3中描述。簡言之，將通過使用簡并寡核苷酸引物序列(SEQ ID NO :6和SEQ ID NO 7)獲得的866bp PCR片段用于從木賊鐮孢RF6318分離pBluescript II KS+載體中的Fe prt8a。全長木賊鐮孢Fe prtS8A基因包含在質(zhì)粒PALK2529中，所述質(zhì)粒在檢索號為DSM 22172的大腸桿菌中保藏至DSMZ培養(yǎng)物保藏所。從DNA序列分析所述絲氨酸蛋白酶的推導(dǎo)氨基酸序列。木賊鐮孢絲氨酸蛋白酶Fe prtS8A的核苷酸序列(SEQ ID N0:10)和推導(dǎo)序列(SEQ ID NO 11)在圖IA-B中顯示。基因長度為1303bp (包括終止密碼子)。發(fā)現(xiàn)一個推定的內(nèi)含子具有64bp長度。推導(dǎo)的蛋白序列由412個氨基酸組成，包括20個氨基酸的預(yù)計(jì)信號序列(SignalP V3. 0 ；Nielsen 等，1997 以及 Nielsen 和 Krogh, 1998)和從 Ala21 至Argl23的前肽。從野生型Fe_RF6318純化的肽與推導(dǎo)的氨基酸序列匹配，表明克隆的基因編碼從木賊鐮孢宿主RF6318中純化的蛋白酶，所述宿主以檢索號CBS 119568保藏在CBS培養(yǎng)物保藏所。對于成熟多肽而言預(yù)計(jì)的分子質(zhì)量為29kDa，且預(yù)計(jì)pi為9. 30。這些預(yù)測 使用ExPASy服務(wù)器的Compute pi/MW工具進(jìn)行(Gasteiger等,2003)。推導(dǎo)的氨基酸序列包含兩個可能的N-糖基化位點(diǎn)(Asn77和Asn255)，但是根據(jù)CBS Server NetNGlyc V1.0很可能只有一個位點(diǎn)Asn77 (位于前序列)。使用NCBI (國家生物技術(shù)信息中心)的BLAST程序2. 2. 9版搜尋與已公布蛋白酶序列的同源性(Altschul等，1990)。通過使用ClustalW比對(矩陣BL0SUM,缺口 開放10,缺口延伸0. 5)(例如在 www. ebi. ac. uk/Tools/Clustalw)獲得的成熟Fe_RF6318序列與同源序列相應(yīng)區(qū)的同一丨I"生值在表3中顯不。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶Fe_RF6318顯示與玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)假定蛋白PH-I (基因座標(biāo)簽FG03315. I) (EMBL檢索號XP_383491，未公布)、與哈茨木霉(T. harzianum) CECT 2413 絲氨酸內(nèi)肽酶(EMBL 檢索號 CAL25508，Suarez 等，2007)以及與深綠木霉(T. atroviride)堿性蛋白酶前體S08. 066 ALP (EMBL檢索號M87516，Geremia等，1993)最高的同源性,后者在US 60/818, 910 (Catalyst Bioscience Inc.)中公開為氨基酸序列SEQ ID NO 3130與玉蜀黍赤霉假定蛋白的同一性在全長酶內(nèi)為85%。當(dāng)比對缺少信號序列和前肽的成熟多肽時，同一性為85%。與哈茨木霉CECT 2413絲氨酸內(nèi)肽酶的同一性為70% (全長酶)和75% (成熟酶)。與深綠木霉ALP的同一性為69% (全長酶)和74% (成熟酶)。因此，分離的多核苷酸序列或分離的核酸分子在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其編碼包含F(xiàn)e_RF6318酶成熟形式的氨基酸序列的真菌絲氨酸蛋白酶或多肽，所述氨基酸序列在SEQ IDN0:15中表征，即SEQ ID NO :11的全長絲氨酸蛋白酶的氨基酸Alal24至Ala412。此外，編碼真菌絲氨酸蛋白酶多肽片段的核酸分子在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其中所述片段具有絲氨酸蛋白酶活性并與氨基酸序列SEQ ID NO : 15具有至少86%同一性或與氨基酸序列SEQ ID NO : 11具有至少86%同一性。優(yōu)選酶顯示至少86%、優(yōu)選至少87%、更優(yōu)選至少88%、甚至更優(yōu)選至少90%同一性。還更優(yōu)選所述氨基酸序列顯示與SEQ ID NO 15的氨基酸序列有至少92 %或至少94 %或96 %、更優(yōu)選至少98 %、最優(yōu)選99 %同一性。兩個酶的同一性在相應(yīng)序列區(qū)內(nèi)(例如在絲氨酸蛋白酶的全長或成熟區(qū)內(nèi))比較。優(yōu)選核酸分子為包含如SEQ ID NO :10所述編碼序列的分子,所述編碼序列編碼本發(fā)明真菌絲氨酸蛋白酶的全長形式。 本發(fā)明的分離核酸分子可為包含多核苷酸序列的編碼序列的分子，所述多核苷酸序列包含在DSM 22171或DSM 22172中。DSM 22171攜帶用于克隆全長Fe prtS8A基因的PCR片段的核苷酸序列(SEQ ID NO 9) 0 DSM 22172攜帶全長Fe prtS8A基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 10)。本發(fā)明的核酸分子也可為上文表征的核苷酸序列的類似物?！昂啿ⅰ币鉃楹塑账嵝蛄械念愃莆?，其在一個或多個核苷酸或密碼子上不同，但其編碼本發(fā)明的重組蛋白酶。所述核酸分子還可為這樣的核酸分子，其在嚴(yán)格條件下與包含在質(zhì)粒pALK2521 (保藏在檢索號為DSM 22171的大腸桿菌中)中的PCR探針雜交，并編碼具有絲氨酸蛋白酶活性和以下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列在相應(yīng)序列區(qū)內(nèi)顯示與如SEQ IDNO :15所述氨基酸序列有至少86%同一性。雜交DNA可來源于屬于鐮孢種的真菌或其可來源于其它真菌種。因此，以下分離的核酸分子在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述分子包含如SEQ ID NO 10,SEQ ID N0:12或SEQ ID NO : 14所述的核苷酸序列及其類似物。
本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體或重組表達(dá)構(gòu)建體，其可用于在適宜原核或真核宿主中增殖或表達(dá)編碼所選絲氨酸蛋白酶的核酸序列或基因。重組表達(dá)載體包含在適宜宿主中促進(jìn)或指導(dǎo)絲氨酸蛋白酶編碼序列表達(dá)和分泌的DNA或核酸序列，例如可操作地連接編碼所述絲氨酸蛋白酶的多核苷酸序列的啟動子、增強(qiáng)子、終止子(包括轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號)和信號序列。表達(dá)載體可進(jìn)一步包含用于選擇轉(zhuǎn)化菌株的標(biāo)記基因，或可用另一個載體構(gòu)建體通過共轉(zhuǎn)化將選擇標(biāo)記引入宿主。所述調(diào)節(jié)序列可與生產(chǎn)生物同源或異源，或者它們可來源于從其中分離編碼所述絲氨酸蛋白酶的基因的生物。用于在絲狀真菌宿主中表達(dá)本發(fā)明絲氨酸蛋白酶的啟動子的實(shí)例為米曲霉TAKA淀粉酶、堿性蛋白酶ALP和磷酸丙糖異構(gòu)酶的啟動子、米黑根霉(Rhizopus miehei)脂肪酶啟動子、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)的啟動子、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶啟動子、Chrysosporium Iucknowense纖維二糖水解酶I啟動子、里氏木霉纖維二糖水解酶I (Cel7A)啟動子等。在酵母中，例如釀酒酵母(S. cerevisiae)烯醇化酶(EN0-1)、半乳糖激酶(GALl)、醇脫氫酶(ADH2)和3-磷酸甘油酸激酶的啟動子可用來提供表達(dá)。用于在細(xì)菌宿主中指導(dǎo)本發(fā)明絲氨酸蛋白酶轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的實(shí)例為大腸桿菌Iac操縱子的啟動子、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂糖酶dagA啟動子、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyL)的啟動子、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophiIus)麥芽淀粉酶基因(amyM)的啟動子、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動子，等等。適宜終止子包括上文提及基因的終止子或任何其它已表征的終止子序列。適宜的轉(zhuǎn)化或選擇標(biāo)記包括在宿主中彌補(bǔ)缺陷的那些，例如來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因或曲霉amdS和niaD。選擇也可基于賦予抗生素抗性的標(biāo)記，例如氨芐西林、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、腐草霉素或潮霉素抗性。優(yōu)選胞外分泌本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶。因此，重組載體包含在所選宿主中促進(jìn)分泌的序列。本發(fā)明絲氨酸蛋白酶的信號序列或者前導(dǎo)序列(presequence)或前導(dǎo)肽可包含在重組表達(dá)載體中，或者可用另一個能夠在所選宿主中促進(jìn)分泌的信號序列替代天然信號序列。因此，所選信號序列可與表達(dá)宿主同源或異源。適宜信號序列的實(shí)例為真菌或酵母生物的那些，例如來自良好表達(dá)基因的信號序列。這類信號序列從文獻(xiàn)中眾所周知。重組載體可進(jìn)一步包含促進(jìn)載體整合進(jìn)入宿主染色體DNA的序列以獲得穩(wěn)定表達(dá)。如實(shí)施例4所述，將本發(fā)明的Fe_RF6318蛋白酶用其自身信號序列(來自里氏木霉cbhl (cel7A)啟動子)表達(dá)。用來轉(zhuǎn)化里氏木霉宿主的表達(dá)構(gòu)建體還包含cbhl終止子和用于自未轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇轉(zhuǎn)化體的amdS標(biāo)記。本發(fā)明也涉及包含如上所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。用于產(chǎn)生所述真菌絲氨酸蛋白酶的適宜宿主為同源或異源宿主，例如包括細(xì)菌、酵母和真菌的微生物宿主。還可能為植物或哺乳動物細(xì)胞中的生產(chǎn)系統(tǒng)。絲狀真菌(如木霉、曲霉、鐮孢、腐質(zhì)霉、金孢子菌、脈孢菌、根霉、青霉和被孢霉)為優(yōu)選的生產(chǎn)宿主，歸因于其簡化酶產(chǎn)物的下游處理和回收。適宜表達(dá)和生產(chǎn)宿主系統(tǒng)為例如開發(fā)用于絲狀真菌宿主里氏木霉的生產(chǎn)系統(tǒng)(EP 244234)，或曲霉生產(chǎn)系統(tǒng)，例如米曲霉或黑曲霉(W0 9708325、US 5，843，745、US 5，770，418)、泡盛曲霉、醬油曲霉和日本曲霉型菌株，或開發(fā)用于鐮孢例如尖鐮孢(Malardier等，1989)或F. venenatum的生產(chǎn)系統(tǒng)，以及開發(fā)用于粗糙脈孢菌、米黑根霉、高山被孢霉(Mortiriella alpinis)、綿毛腐質(zhì)霉或特異腐質(zhì)霉或者用于Chrysosporium lucknowense (US 6, 573, 086)的生產(chǎn)系統(tǒng)。開發(fā)用于酵母的適宜生產(chǎn)系統(tǒng)為開發(fā)用于酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)的系統(tǒng)。開發(fā)用于細(xì)菌的適宜生產(chǎn)系統(tǒng)為開發(fā)用于桿菌(例如用于枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌)、用于大腸桿菌、或用于放線菌鏈霉菌屬(Streptomyces)的生產(chǎn)系統(tǒng)。優(yōu)選本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶在木霉屬或曲霉屬的絲狀真菌宿主中產(chǎn)生，例如里氏木霉、或黑曲霉、米曲霉、醬油曲霉、泡盛曲霉或日本曲霉型菌株。根據(jù)本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方案，所述真菌絲氨酸蛋白酶在里氏木霉中產(chǎn)生。生產(chǎn)宿主細(xì)胞可與本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶同源或異源。由于通過滅活去除蛋白酶或例如通過缺失編碼這類同種(homogenous)或同源蛋白酶的基因去除一種或多種宿主蛋白酶，宿主可不含同種蛋白酶。本發(fā)明也涉及用于產(chǎn)生具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括下列步驟在適宜條件下培養(yǎng)天然或重組宿主細(xì)胞(攜帶用于本發(fā)明絲氨酸蛋白酶的重組表達(dá)載體)和任選分離所述酶。生產(chǎn)培養(yǎng)基可為適于生長宿主生物并含有用于有效表達(dá)的誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基。適宜培養(yǎng)基從文獻(xiàn)中眾所周知。本發(fā)明涉及具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽由本發(fā)明的核酸分子編碼并可通過上述方法獲得。優(yōu)選地，所述多肽為通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞獲得的重組蛋白酶，所述宿主細(xì)胞攜帶用于本發(fā)明絲氨酸蛋白酶的重組表達(dá)載體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于獲得酶制劑的方法，所述酶制劑包含具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽，所述方法包括下列步驟培養(yǎng)攜帶本發(fā)明表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，和從細(xì)胞中回收多肽或從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞以及獲得具有絲氨酸蛋白酶活性的上清液。本發(fā)明也涉及酶制劑，其包含上文表征的絲氨酸蛋白酶。所述酶制劑或組合物具有絲氨酸蛋白酶活性并可通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得。以下酶制劑在本發(fā)明內(nèi)，所述酶制劑包含本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選地通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞獲得的重組絲氨酸蛋白酶，所述宿主細(xì)胞攜帶本發(fā)明的重組表達(dá)載體。除了本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶外，所述酶制劑可進(jìn)一步包含不同類型的酶，例如含或不含的另一種蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、角質(zhì)酶、果膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶和/或氧化酶(例如漆酶或過氧化物酶)。通過去除存在于待處理的材料中的碳水化合物和油或脂肪，期望這些酶增強(qiáng)本發(fā)明絲氨酸蛋白酶的性能。所述酶可為由宿主菌株產(chǎn)生的天然或重組酶，或可在產(chǎn)生過程之后將其加入培養(yǎng)上清液。所述酶制劑可進(jìn)一步包含選自下列的適宜添加劑表面活性劑或表面活化劑、緩沖劑、防蝕齊U、穩(wěn)定齊U、漂白齊U、介質(zhì)、增效劑、腐蝕齊U、研磨劑和防腐齊U、熒光增白齊U、抗再沉積劑、染劑、色素，等等。表面活性劑可用于乳化油脂和潤濕表面。表面活性劑可為非離子的(包括半極性的)和/或陰離子和/或陽離子和/或兩性離子的。可向酶制劑中添 加緩沖劑以改變pH或影響其它組分的性能或穩(wěn)定性。適宜穩(wěn)定劑包括多元醇(例如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物、妝，等等。漂白劑用于氧化和降解有機(jī)化合物。適宜化學(xué)漂白系統(tǒng)的實(shí)例為H2O2來源，例如含或不含過酸形成漂白激活劑(例如四乙?；叶?的過硼酸鹽或過碳酸鹽，或備選地過氧酸(例如酰胺、酰亞胺或砜型)。化學(xué)氧化劑可通過使用氧化酶(例如漆酶或過氧化物酶)部分或完全替代。許多漆酶在沒有介質(zhì)的情況下不會有效地起作用。增效劑或絡(luò)合劑包括下列物質(zhì)，例如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽，等等。所述酶制劑可進(jìn)一步包含一種或多種聚合物，例如羧甲基纖維素、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮，等等。另外，可加入軟化劑、腐蝕劑、用于防止其它組分腐壞的防腐齊U、研磨劑以及改變起泡和粘度特性的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，所述酶制劑呈液體、粉末或顆粒形式。本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶可與其它蛋白酶相似，具體地用于洗滌劑、蛋白質(zhì)、釀造、肉類、攝影、皮革、乳品和制藥工業(yè)的堿性蛋白酶(Kalisz，1988 ;Rao等，1998)。例如，其可用作化學(xué)制品的替代物將纖維狀蛋白質(zhì)廢物(例如角、羽毛、指甲和毛發(fā))轉(zhuǎn)化成有用的生物質(zhì)、濃縮蛋白或氨基酸(Anwar和Saleemuddin, 1998)。本發(fā)明真菌絲氨酸蛋白酶的應(yīng)用可與在改善皮革質(zhì)量和減輕環(huán)境污染以及節(jié)能中證實(shí)成功的其它酶相似，并且其可與用于肽合成和D，L-氨基酸混合物拆分中的堿性蛋白酶相似。在治療燒傷和創(chuàng)傷中枯草蛋白酶與廣譜抗菌素組合為絲氨酸蛋白酶在制藥工業(yè)中的應(yīng)用的實(shí)例，因此本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶也可具有這類應(yīng)用，并且也可與可應(yīng)用于去除外科設(shè)備上的血以及清潔隱形眼鏡或假牙的堿性蛋白酶相似。如同來自冠狀耳霉(Conidiobolus coronatus)的堿性蛋白酶，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶可用于替代動物細(xì)胞培養(yǎng)中的胰蛋白酶。本發(fā)明的蛋白酶也可用于清潔膜和破壞生物膜。在焙烤中所述蛋白酶可用于例如破壞面筋網(wǎng)絡(luò)，并且在其它食品應(yīng)用中可用于水解食物蛋白(例如牛奶中的蛋白質(zhì))。它們還可用于例如處理酵母、煉制(從動物骨中提取更多蛋白質(zhì))、創(chuàng)造新味道、減少苦味、改變?nèi)榛匦?、產(chǎn)生生物活性肽和降低蛋白質(zhì)的變應(yīng)原性。底物包括動物、植物和微生物蛋白。洗滌劑工業(yè)，特別是衣物洗滌劑工業(yè)，已顯示為在高pH范圍有活性的蛋白酶的單個主要消費(fèi)者(Anwar和Saleemuddin，1998)。理想的洗滌劑用蛋白酶應(yīng)具有寬底物特異性以促進(jìn)去除由食物、草、血和其它身體分泌物造成的多種污跡。其必須在洗滌劑溶液的PH和離子強(qiáng)度、洗滌溫度和PH中有活性，并耐受機(jī)械處理以及添加到洗滌劑中的螯合物和氧化劑。蛋白酶的Pl必須接近洗滌劑溶液的pH。歸因于目前的能源危機(jī)和能源節(jié)約的意識，當(dāng)前希望在較低溫度下使用蛋白酶。本發(fā)明也涉及絲氨酸蛋白酶或酶制劑在以下中的應(yīng)用洗滌劑、處理織物纖維、處理毛織品、處理毛發(fā)、處理皮革、處理飼料或食物或者涉及修飾、降解或去除蛋白質(zhì)材料的任何應(yīng)用。
因此本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案為將如上表征的絲氨酸蛋白酶用作可用于衣物洗滌劑和餐具洗滌組合物(包括自動餐具洗滌組合物)的除垢添加劑。措辭“洗滌劑”用于意指意圖協(xié)助清洗或具有清洗特性的物質(zhì)或材料。術(shù)語“去污力”表示清洗特性的存在情況或程度。清洗特性的程度可對與固體、水不溶性載體(例如織物纖維或玻璃)結(jié)合的不同蛋白質(zhì)材料或含蛋白的底物材料或者污跡或污跡混合物進(jìn)行測試。典型的蛋白質(zhì)材料包括血、牛奶、墨水、蛋、草和調(diào)味汁。對于測試目的，蛋白質(zhì)污跡混合物可市購。洗滌劑用酶的功能為降解和去除含蛋白污跡。測試結(jié)果取決于用于洗滌測試的污跡類型、洗滌劑組成以及織物的性質(zhì)和狀態(tài)(Maurer，2004)。典型地，將蛋白酶或洗滌性能測定為“污跡去除效率”或“污跡去除效果”或“清洗特性的程度”，意為污跡材料(例如人為污染的樣品或試布)可見和可測定的亮度增加或顏色變化?？蓽y定亮度或色值變化，例如如實(shí)施例6-10所述，使用顏色空間坐標(biāo)用分光光度計(jì)將顏色測定為反射率值。將指示蛋白酶性能(污跡去除效率)的蛋白質(zhì)污跡褪色或去除計(jì)算為例如△ L%其意為酶處理織物的亮度值L*減去用緩沖液或無酶洗滌液處理的織物的亮度值L*(酶空白或?qū)φ?。洗滌劑的存在可改善酶去除污跡的性能。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶在中性和堿性pH條件下乃至在存在具有不同組成的洗滌劑的情況下降解不同種類的蛋白質(zhì)污跡(如實(shí)施例6-13所示)。如實(shí)施例6所不，與商業(yè)蛋白酶制劑Savinase Ultra 16L和Purafect丨⑧4000L相比，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶在50°C和尤其是30°C pH 9緩沖液中，更好地去除血/牛奶/墨水污跡(圖5和圖6)。酶制劑按活性單位施用。如實(shí)施例12所述，也在10°C -60°C的全溫度范圍測試了對血/牛奶/墨水污跡的污跡去除效果。與商業(yè)蛋白酶制劑Savinase Ultra 16L和Purafect 4000L相比，F(xiàn)e_RF6318蛋白酶制劑顯示更高的污跡去除能力。與Properase 4000E相比，其在30°C _60°C的范圍亦顯示更高的污跡去除能力(圖16)。如實(shí)施例7所述，也在40°C /50°C pH 10于洗滌粉中測試了 Fe_RF6318蛋白酶的性能。測定了所述酶去除聚酯棉材料上血/牛奶/墨水污跡的能力。每種酶制劑按活性單位(ymol酪氨酸/分鐘)施用。如圖7和8所示，本發(fā)明的蛋白酶在極堿性條件下也適于粉狀洗滌劑，并且其對漂白劑的抵抗力略高于商業(yè)蛋白酶Purafect 4000L。在存在液體堿性洗滌劑和30°C下，F(xiàn)e_RF6318蛋白酶也在液體堿性洗滌劑中和在Ariel Sensitive (Procter & Gamble, UK)中去除血/牛奶/墨水標(biāo)準(zhǔn)污跡(實(shí)施例9)。對血/牛奶/墨水污跡的效率遠(yuǎn)高于商業(yè)制劑Savinase Ultra 14L和Purafect 4000L(圖10和11)。酶制劑按活性單位施用。當(dāng)用量計(jì)算為添加蛋白量時，也觀察到同樣的效果(圖IOB和11B)。在3. 3. g/1液體洗滌劑濃度以及10°C和20°C下進(jìn)行的洗滌，再一次顯示了超過商業(yè)制劑 Savinase Ultra 14L、Purafect 4000L 和 Properase 4000E 的優(yōu)越性能(實(shí)施例13 ;圖17)。當(dāng)在30°C、液體洗滌劑中測試時，除了血/牛奶/墨水污跡外，F(xiàn)e_RF6318蛋白酶還對去除諸如草和可可粉等污跡有效。在ATLAS LP-2Launder-0meter中進(jìn)行處理。結(jié)果(圖12和13)顯示，F(xiàn)e_RF6318蛋白酶在低溫(如30°C )下對數(shù)種污跡有效。在30°C于洗滌機(jī)中，全規(guī)模測試了在里氏木霉中產(chǎn)生的重組Fe_RF6318酶制劑在存在液體堿性洗滌劑時的性能(實(shí)施例11)。用于測試副作用的8種不同蛋白酶敏感示蹤物在表5中顯示，工藝條件在表6中顯示。用于測試試驗(yàn)的酶用量計(jì)算為酶活性和酶蛋白量二者。圖14A-B所示結(jié)果顯示，當(dāng)按活性量或蛋白質(zhì)量施用酶時,用Fe_RF6318對不同污跡獲得結(jié)果的總和，高于商業(yè)蛋白酶制劑Savinase⑧Ultra 16L和Purafect 4000L。Fe_RF6318對血/牛奶/墨水、巧克力/牛奶、花生油/牛奶和蛋黃污跡最有效(圖15A-E)。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，如實(shí)施例6-13所示，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶可用于洗滌液和洗滌粉?？蓪⒈景l(fā)明酶制劑的酶配制成用于手動或機(jī)械洗衣，或者可配制成用于家居硬表面清洗或優(yōu)選地用于手動或機(jī)械洗餐具操作。實(shí)施例I.木賊鐮孢RF6318蛋白酶的產(chǎn)生和純化(a)木賊鐮孢RF6318的培養(yǎng)先前已將真菌菌株RF6318作為產(chǎn)生纖維素酶的絲狀真菌分離。將其鑒定為木賊鍵抱(Fusarium cf. equiseti (Libert) Desmazieres) (ES Arthur de Cock, IdentificationServices,Centralbureau Voor Schimmelcultures,P. 0. Box 85167,3508 AD Utrecht,TheNetherlands)。已顯示木賊鐮孢RF6318在含有血紅蛋白作為底物的瓊脂平板測定中產(chǎn)生蛋白酶活性。隨著平板培養(yǎng)在約10°C進(jìn)行，此結(jié)果顯示RF6318產(chǎn)生在低溫下起作用的一種或多種蛋白酶。木賊鐮孢RF6318在+4°C馬鈴薯葡萄糖(PD)瓊脂(Difco)上生長、維持和形成孢子。對于酶產(chǎn)生，將來自RF6318斜面的孢子接種到培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基包含30g/I玉米粉(精細(xì)研磨)、5g/l玉米漿粉、4g/l大豆粉(脫脂)、2g/l KH2P04、lg/l NaCl和lg/I石蠟油。滅菌前用NaOH將培養(yǎng)基pH調(diào)至8. 5，再將培養(yǎng)基在121°C高壓滅菌30分鐘。將微生物以50ml體積在28°C于振蕩器(200rpm)上培養(yǎng)7天。當(dāng)在不同pH值(pH 7-10)進(jìn)行活性測定(根據(jù)實(shí)施例lc、5或14)時，耗盡的培養(yǎng)上清液顯示含有堿性蛋白酶活性。因?yàn)榇藟A性活性，將RF6318菌株選為推定的蛋白酶基因供體菌株。(b)從木賊鐮孢RF6318培養(yǎng)基中純化蛋白酶通過在+4°C以50000g離心30min (Sorvall RC6 plus)從耗盡的培養(yǎng)基中去除細(xì)胞和固體。將50ml上清液用于純化蛋白酶。離心之后，加入HCl將上清液pH調(diào)至8. O。然后將上清液通過0. 44ii m過濾器(MILLEX HV Millipore)過濾并上樣至以pH 8的20mMTris-HCl平衡過的5mL Q Sepharose FF柱(GE Healthcare)。收集流出流分并通過加入HCl將其PH降至7. 5。向流出流分加入固體硫酸銨以獲得IM的最終鹽濃度。然后，將流出流分通過0.44 iim過濾器過濾，然后上樣至以pH 7. 5的20mM Tris-HCl-IM硫酸銨平衡過的苯基Sepharose HP(ImL)柱(GE Healthcare)。用線性遞減的硫酸銨梯度(1-0M)洗脫蛋白質(zhì)。收集Iml流分并按照制造商指導(dǎo)在pH 8. 0下試鹵靈標(biāo)記的酪蛋白(Boehringer MannheimBiochemica)上分析蛋白酶活性。合并具有蛋白酶活性的流分并用IOk膜(Amicon)超濾。將濃縮的濾液上樣至用pH 7. 5的20mM Tris-HCl-200mM NaCl平衡過的Superdex 7510/300GL柱(GE Healthcare)。用相同緩沖液洗脫蛋白質(zhì)并收集0. 5ml流分。分析來自這些流分的蛋白酶活性。將具有蛋白酶活性的流分在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分析。顯示所述流分包含一個具有約29kDa分子質(zhì)量的主要蛋白帶。合并所選流分。將合并部分用于制備肽(實(shí)施例2)。根據(jù)活性測定的測定結(jié)果，純化的蛋白質(zhì)在pH 10具有其最適pH。將此純化的木賊鐮孢RF6318蛋白酶命名為Fe_RF6318。(c)蛋白酶活性測定
蛋白酶活性通過使用酪蛋白作為底物的酪蛋白Folin-Ciocalteau法分析。蛋白酶降解酪蛋白的速率通過分光光度監(jiān)測作為時間的函數(shù)的酸溶性片段的釋放來測定。用于測定的酪蛋白底物如下制備將6g酪蛋白Hammerstein級MP Biomedicals, LLC(101289)溶于 500ml 的 IOOmM Tris,20uM CaCl2、7yM MgCl2、25yM NaHCO30 用 HCl 將底物溶液 pH調(diào)至9. O。使用TCA溶液終止酶反應(yīng)，所述溶液包含含0. IlM TCA、0. 22M乙酸鈉、0. 33M醋酸、0. 5M Na2CO3 的IOOOml蒸懼水。通過用蒸懼水將25ml 2N Folin-Ciocalteu酹試劑(SIGMA, F9252)稀釋到IOOml來制備用于測定的Folin試劑。首先通過在給定溫度孵育2. 5ml底物溶液5min開始反應(yīng),之后加入0. 5ml酶溶液并進(jìn)行反應(yīng)15min或30min。15min或30min反應(yīng)之后，加入2. 5ml反應(yīng)終止液，混合內(nèi)容物并使其在室溫下靜置30分鐘。將管以4000rpm離心10分鐘(Hettich Rotanta 460)。吸取Iml澄清的上清液并與2. 5ml 0. 5MNa2CO3和0.5ml稀釋的Folin試劑混合。等待5min (顯色)之后，對照酶空白在660nm處測定混合物的吸光度(顏色)。酶空白如下制備將0. 5ml酶溶液與2. 5ml終止液和2. 5ml底物混合，并在給定溫度下孵育混合物15min或30min。將一個酶活單位定義為每min每ml反應(yīng)混合物釋放對應(yīng)于I U g酪氨酸的酸溶蛋白水解產(chǎn)物的酶量。實(shí)施例2.純化木賊鐮孢蛋白酶Fe_RF6318的N末端和內(nèi)部氨基酸的測序?qū)τ诖_定內(nèi)部序列，基本如Shevchenko等(1996)所述,將考馬斯亮藍(lán)染色的條帶從聚丙烯酰胺凝膠切下并進(jìn)行“凝膠內(nèi)”消化。在用胰蛋白酶(測序級修飾胰蛋白酶，V5111, Promega)消化之前,將蛋白質(zhì)用二硫蘇糖醇還原并用碘乙酰胺燒基化?；救缦惹八?Poutanen等，2001)但使用150 U mX I. Omm捕獲柱(3 ii m,120A, #222403, SGE Ltd UK)用于肽預(yù)濃縮，使用連接到Ultimate納級液相色譜儀(LC-Packings, The Netherlands)的 Q-TOF 儀(Micromass,Manchester, UK)產(chǎn)生用于從頭測序的電噴霧離子化四極飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜。對于N末端序列分析，將SDS-PAGE/分離的蛋白質(zhì)通過電印跡轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(ProBlott ；Perkin Elmer Applied Biosystems Division, Foster City, Calif.)中。用考馬斯亮藍(lán)染色后，移出目的蛋白帶并在Procise 494A蛋白測序儀(Perkin ElmerApplied Biosystems Division, Foster City, Calif.)上通過 Edman 降解對其進(jìn)行 N 末端序列分析。從純化Fe_RF6318蛋白酶確定的N末端和內(nèi)部肽序列在表I中顯示。肽序列顯示與已發(fā)表的來自尖鐮孢絲氨酸蛋白酶的蛋白酶序列同源，所述蛋白酶的EMBL檢索號為Q5R2N9 和 074236。表I.從Fe_RF6318蛋白酶確定的N末端和內(nèi)部肽序列
權(quán)利要求
1.一種真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶具有絲氨酸蛋白酶活性，并包含如SEQID NO :15定義的成熟Fe_RF6318酶的氨基酸序列或與SEQ ID NO : 15定義的成熟Fe_RF6318酶的氨基酸序列具有至少86%同一性的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶可自木賊鐮孢獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶具有絲氨酸蛋白酶活性，并包含氨基酸序列SEQ ID NO :15。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶的成熟形式具有在20-35kDa之間的分子質(zhì)量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶,其特征在于,在pH9使用15min反應(yīng)時間以及酪蛋白作為底物，所述酶的最適溫度為30°C -70°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶,其特征在于,在50°C使用15min反應(yīng)時間以及酪蛋白作為底物，所述酶的最適pH在至少pH 6-pH 11的pH范圍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于，在存在洗滌劑的情況下于10°C _60°C之間，所述酶能夠降解和去除蛋白質(zhì)污跡。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶由分離的多核苷酸序列編碼，所述多核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與包含在質(zhì)粒PALK2521中的多核苷酸序列雜交，所述質(zhì)粒包含核苷酸序列SEQ ID NO :9，保藏在檢索號為DSM 22171的大腸桿菌RF7664 中。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶由分離的多核苷酸序列編碼，所述多核苷酸序列編碼以下多肽，其包含如SEQ ID N0:15定義的成熟Fe_RF6318酶的氨基酸序列或與SEQ ID NO 15定義的成熟Fe_RF6318的氨基酸序列具有至少86%同一性的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶由分離的核酸分子編碼，所述核酸分子編碼包含在SEQ ID NO :15中表征的氨基酸序列的多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶由包含核苷酸序列SEQ ID NO 14的分尚核酸分子編碼。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶由包含在PALK2529中的多核苷酸序列編碼，pALK2529保藏在檢索號為DSM 22172的大腸桿菌RF7800中。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶由重組表達(dá)載體產(chǎn)生，所述重組表達(dá)載體包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶的核酸分子，所述核酸分子可操作地連接到能夠在適宜宿主中指導(dǎo)絲氨酸蛋白酶編碼基因表達(dá)的調(diào)控序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶在異源宿主中產(chǎn)生。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶在微生物宿主中產(chǎn)生。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶在下列屬的宿王中廣生木霉、曲霉、鍵抱、腐質(zhì)霉、金抱子囷、脈抱囷、根霉、青霉和被抱霉。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶在木霉或曲霉中產(chǎn)生。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶在里氏木霉中產(chǎn)生。
19.一種編碼真菌絲氨酸蛋白酶的分離核酸分子，所述核酸分子選自 (a)以下核酸分子，其編碼具有絲氨酸蛋白酶活性并包含如SEQID N0:15所述的氨基酸序列的多肽； (b)以下核酸分子，其編碼具有絲氨酸蛋白酶活性并與SEQID NO :15的氨基酸序列具有至少86%同一性的多肽； (c)以下核酸分子，其包含如SEQID NO: 10所述的核苷酸序列的編碼序列； (d)包含多核苷酸序列的編碼序列的核酸分子，所述多核苷酸序列包含于DSM22171或DSM 22172 中； (e)以下核酸分子，其編碼序列由于遺傳密碼的簡并性而與(c)-(d)的任一核酸分子的編碼序列不同；和 (g)以下核酸分子，其在嚴(yán)格條件下與包含在DSM 22171中的核酸分子雜交,并編碼以下多肽，所述多肽具有絲氨酸蛋白酶活性并具有顯示與如SEQ ID NO :15所述的氨基酸序列具有至少86%同一性的氨基酸序列。
20.—種包含根據(jù)權(quán)利要求19的核苷酸序列的重組表達(dá)載體,所述核苷酸序列可操作地連接到能夠在適宜宿主中指導(dǎo)所述絲氨酸蛋白酶編碼基因表達(dá)的調(diào)控序列。
21.—種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含根據(jù)權(quán)利要求20的重組表達(dá)載體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主為微生物宿主。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主為絲狀真菌。
24.根據(jù)權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主為下列屬的宿王木霉、曲霉、鍵抱、腐質(zhì)霉、金抱子囷、脈抱囷、根霉、青霉和被抱霉。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主為木霉或曲霉。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主為里氏木霉。
27.—種產(chǎn)生具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括以下步驟培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求21-26中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞和回收所述多肽。
28.一種具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽由根據(jù)權(quán)利要求19的核酸序列編碼，并且可通過根據(jù)權(quán)利要求27的方法獲得。
29.一種用于獲得酶制劑的方法，所述方法包括以下步驟培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求21-26中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，和自所述細(xì)胞回收多肽或從培養(yǎng)基中分離所述細(xì)胞以及獲得上清液。
30.一種酶制劑，所述酶制劑可通過根據(jù)權(quán)利要求29的方法獲得。
31.一種酶制劑，所述酶制劑包含根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的絲氨酸蛋白酶。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31的酶制劑，其特征在于，所述制劑包含選自下列含或不含介質(zhì)的其它酶蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角質(zhì)酶、果膠酶或氧化酶。
33.根據(jù)權(quán)利要求30-32中任一項(xiàng)的酶制劑，其特征在于，所述制劑包含選自下列的適宜添加劑穩(wěn)定齊U、緩沖齊U、表面活性劑、增效齊U、漂白齊U、介質(zhì)、防蝕齊U、抗再沉積齊U、腐蝕劑、研磨劑、熒光增白劑、染劑、色素和防腐劑。
34.根據(jù)權(quán)利要求30-33中任一項(xiàng)的酶制劑，其特征在于，所述酶制劑呈液體、粉末或顆粒形式。
35.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的絲氨酸蛋白酶或根據(jù)權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)的酶制劑在洗滌劑、處理纖維、處理毛織品、處理毛發(fā)、處理皮革、處理食物或飼料或涉及修飾、降解或去除蛋白質(zhì)材料的任何應(yīng)用中的用途。
36.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的絲氨酸蛋白酶或根據(jù)權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)的酶制劑作為除垢添加劑的用途。
37.在洗滌液中的根據(jù)權(quán)利要求36的用途。
38.在洗滌粉中的根據(jù)權(quán)利要求36的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種真菌絲氨酸蛋白酶，其包含成熟Fe_RF6318酶的氨基酸序列，所述成熟Fe_RF6318酶具有SEQ ID NO15的氨基酸序列。所述絲氨酸蛋白酶可自木賊鐮孢獲得，更優(yōu)選來自保藏菌株CBS 119568。公開的還有編碼所述蛋白酶的核酸序列，例如保藏在檢索號為DSM 22171的大腸桿菌RF7664中的包含核苷酸序列SEQ ID NO9的質(zhì)粒pALK2521，以及保藏在檢索號為DSM 22172的大腸桿菌RF7800中的包含全長基因SEQ ID NO10的質(zhì)粒pALK2529。所述蛋白酶可用作酶制劑，其可應(yīng)用于洗滌劑組合物以及用于處理纖維、用于處理毛織品、用于處理毛發(fā)、用于處理皮革、用于處理食品或飼料或用于涉及修飾、降解或去除蛋白質(zhì)材料的任何應(yīng)用。
文檔編號C07K14/37GK102625843SQ201080030241
公開日2012年8月1日 申請日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日
發(fā)明者J·卡利奧, J·維馬安佩拉, K·瓊圖南, L·瓦爾塔卡里, M·帕洛海莫, P·奧賈帕洛, S·馬基南 申請人:生化酶股份有限公司