一種耐熱耐堿木聚糖酶及其編碼基因和重組載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種耐熱耐堿木聚糖酶及其編碼基因和重組載體，該木聚糖酶選自如下(1)或(2)或(3)：(1)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的全長(zhǎng)木聚糖酶taXynA；(2)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列組成的重組木聚糖酶nsXynAΔSLH；(3)將SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有耐熱耐堿木聚糖酶活性的由(1)或(2)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述的木聚糖酶具有良好的木聚糖降解活性，在75℃條件下處理120min，酶活保留90％，在微酸性、中性或堿性環(huán)境下有較強(qiáng)的耐受能力。
【專利說(shuō)明】一種耐熱耐堿木聚糖酶及其編碼基因和重組載體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種具有較高最適反應(yīng)溫度、溫度穩(wěn)定性和 堿性耐受能力的木聚糖酶XynA △ SLH，以及該木聚糖酶的編碼基因與其在枯草芽孢桿菌中 的高產(chǎn)表達(dá)策略。

【背景技術(shù)】
[0002] 木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)是生物質(zhì)能的一大代表，在地球上有著豐富的含量。纖維素 與半纖維素這兩類多聚糖是木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的主要成分，是植物光合作用的產(chǎn)物，是 自然界中最為豐富的可再生資源之一。其中，木聚糖是植物細(xì)胞中組成半纖維素復(fù)合體的 主要成分，廣泛分布于植物細(xì)胞壁中，是自然界中僅次于纖維素和淀粉之后的含量最豐富 的多聚糖，約占植物碳水化合物總量的三分之一，是一種龐大的、可再生的生物質(zhì)能。
[0003] 木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖或木單糖的一類酶的總稱，而狹義上 的木聚糖酶指的是內(nèi)切木聚糖酶，是兩種主鏈水解酶之一，在木聚糖降解過(guò)程中最主要 的酶，通過(guò)內(nèi)切作用，從木聚糖主鏈內(nèi)部作用于木聚糖主鏈骨架的糖苷鏈上，隨機(jī)打斷 木聚糖的主鏈骨架，從而生成低聚木糖以及極少數(shù)的木糖單糖，降低了木聚糖的聚合度 (Collins, Gerday et al. 2005)。
[0004] 木聚糖酶可廣泛應(yīng)用于食品、能源、造紙、飼料、醫(yī)藥、紡織等行業(yè)。例如，木聚糖 在動(dòng)物消化道內(nèi)不能被消化吸收，并且阻礙其他營(yíng)養(yǎng)成份的消化利用，具有很強(qiáng)的抗?fàn)I 養(yǎng)特性，從而限制了許多禾谷類飼料在飼料工業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，而通過(guò)在飼料 中添加木聚糖酶，可以使飼料更容易、更充分地被消化吸收，能有效提高飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值 (Collins, Gerday et al. 2005)。
[0005] 工業(yè)生產(chǎn)中常常需要在高溫或堿性的條件下進(jìn)行，而一般情況下，蛋白酶在遇到 高溫或堿性環(huán)境時(shí)，往往不穩(wěn)定，容易失活，這大大限制了許多酶制劑在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng) 用。因此，耐熱耐堿木聚糖酶在工業(yè)生產(chǎn)中有著巨大的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種大分子耐熱耐堿木聚糖酶木聚糖酶及其編碼基因。
[0007] 本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] 一種耐熱耐堿木聚糖酶，選自如下（1)或（2)或（3):
[0009] (1)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的全長(zhǎng)木聚糖酶taXynA ;
[0010] (2)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列組成的重組木聚糖酶nsXynA ASLH ;
[0011] (3)將SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘 基的取代和/或缺失和/或添加且具有耐熱耐堿木聚糖酶活性的由（1)或（2)衍生的蛋白 質(zhì)。
[0012] 其中，序列表中的SEQ ID NO:2由1432個(gè)氨基酸組成，分子量約為157. 5kD ;SEQ ID N0:4由1015個(gè)氨基酸組成，分子量約為112. 53kD ;
[0013] 為了使⑵中的木聚糖酶便于純化，在序列表中SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列 組成的蛋白質(zhì)C端連接上6 X Hi s標(biāo)簽。
[0014] 上述（1) (2)或（3)中的木聚糖酶可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生 物表達(dá)得到。（2)和（3)中的木聚糖酶的編碼基因可通過(guò)將序列SEQID NO: 1或N0:3中的 DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突 變得到。
[0015] 上述木聚糖酶的編碼基因，選自如下（1)或⑵或（3)或（4):
[0016] (1)其核苷酸序列編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)分子；
[0017] (2)其核苷酸序列是SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3所示的序列；
[0018] (3)其核苷酸序列是SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列經(jīng)一個(gè)或幾個(gè) 核苷酸的取代和/或缺失和/或添加所得的衍生序列；
[0019] (4)與（1)所限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述木聚糖酶的核苷酸序 列。
[0020] 含有上述述編碼基因的重組載體：將表達(dá)載體PHTHis與權(quán)利要求2的基因以限 制性內(nèi)切酶BamH I和Pst I分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)菌落PCR、測(cè)序篩選出陽(yáng)性克隆；陽(yáng)性克隆接至含氨芐青霉素 抗性的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，即得到重組載體。
[0021] 所述表達(dá)載體pHTHis的制備：將SEQ ID N0:9的基因片段與質(zhì)粒pHTOl均用BamH I、Aat II進(jìn)行雙酶切，分別純化后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)菌落 PCR、測(cè)序篩選出陽(yáng)性克??；再將陽(yáng)性克隆接至含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng) 后提取質(zhì)粒，即為表達(dá)載體pHTHis。
[0022] 所述表達(dá)載體pHTHis的克隆/表達(dá)區(qū)域如圖1所示。
[0023] 含有上述述編碼基因的重組菌：將所述的重組載體通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)至枯草芽孢 桿菌（Bacillus subtilis)中，再以氯霉素 LB平板進(jìn)行篩選，即獲得該木聚糖酶重組菌。
[0024] 本發(fā)明涉及的木聚糖酶來(lái)源于嗜熱厭氧桿菌Thermoanaerobacterium aotearoense SQJT27,有較好的耐熱能力。
[0025] 上述木聚糖酶的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026] 含有上述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、表達(dá)盒均屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0027] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明中的木聚糖酶表達(dá)載體有利于大分子量木聚糖酶的高效表達(dá)和 純化，表達(dá)的木聚糖酶占菌體總蛋白約15%，純化效率高達(dá)57%，比酶活為248. 8U/mg。該 表達(dá)載體具有高表達(dá)量、高回收率、高催化活力等特點(diǎn)，有利于木聚糖酶制劑的工業(yè)化生 產(chǎn)。
[0028] 本發(fā)明的木聚糖酶最適反應(yīng)溫度為80°C，最適反應(yīng)pH為6. 5 ;在70°C的條件下處 理2小時(shí)幾乎沒(méi)有酶活損失，在75°C的條件下處理2小時(shí)仍能保留約90%的剩余酶活，在 微酸性、中性和堿性環(huán)境下有較強(qiáng)的耐受能力。本發(fā)明的木聚糖酶具有耐熱耐堿特性，能夠 很好地應(yīng)用于分解半纖維素中的木聚糖酶，生產(chǎn)功能性低聚糖，適合于對(duì)溫度要求高的很 多非強(qiáng)酸性工業(yè)環(huán)境，具有在工業(yè)生產(chǎn)中推廣應(yīng)用的巨大潛力。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1為pHTHis載體的克隆/表達(dá)區(qū)域序列。
[0030] 圖2為本發(fā)明的重組木聚糖酶基因 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。M，DNA分子量標(biāo) 準(zhǔn)；1，重組木聚糖酶基因 nsXynA的PCR產(chǎn)物。
[0031] 圖3為本發(fā)明的重組木聚糖酶純化過(guò)程收集樣品的SDS-PAGE圖。M，蛋白質(zhì)分 子量標(biāo)準(zhǔn)；1，重懸菌液破碎上清（粗酶液）；2,重懸菌液破碎沉淀；3,鎳柱純化穿過(guò)液；4， 68mM咪唑緩沖液洗脫的第一個(gè)蛋白峰所含蛋白樣品；5,68mM咪唑緩沖液洗脫的第二個(gè)蛋 白峰所含蛋白樣品；6,116mM咪唑緩沖液洗脫的蛋白樣品；7, 500mM咪唑緩沖液洗脫的蛋白 樣品。
[0032] 圖4為本發(fā)明的重組木聚糖酶的最適反應(yīng)pH曲線圖。
[0033] 圖5為本發(fā)明的重組木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度曲線圖。
[0034] 圖6為本發(fā)明的重組木聚糖酶的pH穩(wěn)定性曲線圖。
[0035] 圖7為本發(fā)明的重組木聚糖酶在70、75和80°C下保溫不同時(shí)間后的剩余酶活力曲 線。
[0036] 圖8為本發(fā)明的重組木聚糖酶在75-80°C下保溫30min的剩余酶活力曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0037] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法，如《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》（第三版）中所述的方法。
[0038] 實(shí)施例1
[0039] 枯草芽孢桿菌胞內(nèi)表達(dá)載體pHTHis的構(gòu)建
[0040] 以大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pHTOl (M0BITEC公司）為基礎(chǔ)載體，以引物 1彼0 10勵(lì):5)、引物2彼0 10勵(lì):6)，不添加模板，進(jìn)行？〇?擴(kuò)增，獲得一段58拉的含有 六組氨酸標(biāo)簽編碼序列的片段（SEQ ID N0:9)。PCR反應(yīng)條件為：98°C變性10sec，53°C退 火5sec，72°C延伸5sec。該片段與質(zhì)粒pHTOl均用BamH I、Aat II進(jìn)行雙酶切，分別純化 后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)菌落PCR、測(cè)序篩選出陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性 克隆接至含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的克隆表 達(dá)載體pHTHis，其克隆/表達(dá)區(qū)域序列如圖1。
[0041] 引物 1 :5,-TGTACGGATCCGGTGGTTCTCTGCAGCATCA-3,（SEQ ID N0:5)
[0042] 引物 2 :5,-CCGATGACGTCTTAATGATGATGATGATGATGCTGCAGAGAACC AC-3, （SEQ ID NO: 6)
[0043] 實(shí)施例2
[0044] 木聚糖酶的編碼基因 xynA的克隆
[0045] 該木聚糖酶基因 xynA氨基酸序列（SEQ ID NO: 2)通過(guò)Blast比對(duì)，可知該酶是 一個(gè)多結(jié)構(gòu)域組成的大分子蛋白酶，C端末尾包含了三個(gè)連續(xù)的SLH結(jié)構(gòu)域以及一段連接 肽，與錨定在細(xì)胞表面相關(guān)，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)沒(méi)有顯著影響，因此將其去掉以提高該酶的表達(dá) 效率，最終確定本發(fā)明所用的木聚糖酶氨基酸序列為SEQ ID N0:4,相應(yīng)的編碼基因序列為 SEQ ID NO:3。
[0046] 以嗜熱厭氧桿菌（Thermoanaerobacterium aotearoense) SCUT27 的基因組為模 板，以引物3 (SEQ ID NO:7)、引物4 (SEQ ID NO:8)進(jìn)行PCR擴(kuò)增該木聚糖酶編碼基因 （SEQ ID N0:3)。PCR反應(yīng)條件為：98°C變性10sec，56°C退火5sec，72°C延伸3min，引物3、引物4 序列及反應(yīng)體系如下。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。
[0047] 引物 3 :5'-CGTTCGGATCCATGGACGATACTAATACAAATCTGG-3'（SEQ IDN0:7)
[0048] 引物 4 :5,-AATACCTGCAGAGAAGGTTTACCTGTAAGCATCA-3,（SEQ IDN0:8)
[0049] PCR擴(kuò)增獲得的木聚糖酶基因片段純化后與實(shí)施例1構(gòu)建得到的質(zhì)粒pHTHis 以限制性內(nèi)切酶BamH I和Pst I分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化 至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)菌落PCR、測(cè)序篩選出陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆接 至含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，即為該重組木聚糖酶的表 達(dá)載體pHTHis-nsXynAASLH。該載體通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)至枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)1012wt(購(gòu)買自M0BITEC公司）中，以終濃度5yg/mL的氯霉素 LB平板進(jìn)行篩 選，即可獲得該重組木聚糖酶胞內(nèi)表達(dá)菌株B.subtilis 1012wt/pHTHis_nsXynAASLH?？?草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化方法參考Spizizen法（Anagnostopoulos and Spizizen 1961)。
[0050] 實(shí)施例3
[0051] 重組木聚糖酶的表達(dá)純化
[0052] (一）重組酶的表達(dá)
[0053] 含有重組質(zhì)粒pHTHis-nsXynA Δ SLH的枯草芽抱桿菌B. subtilis 1012wt過(guò)夜培 養(yǎng)菌液IOmL轉(zhuǎn)接到IL LB(含Syg/mL氯霉素）培養(yǎng)基中，37°C 250rpm培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液OD6tltl 達(dá)到約0. 5時(shí)，加入IPTG至終濃度0. ImM，誘導(dǎo)培養(yǎng)10h，離心收集細(xì)胞，使用溶菌酶和/或 超聲波破碎儀破碎細(xì)胞，離心收集上清即為粗酶液。SDS-PAGE膠圖顯示（圖3)，本實(shí)施例 中重組木聚糖酶表達(dá)量約占菌體總蛋白的15%。
[0054] (二）重組酶的純化
[0055] 采用鎳柱親和層析方法純化目的蛋白。首先用平衡緩沖液（20mM，pH 7. 5Tris-HCl 緩沖液，〇.511似(：1，2〇1111咪唑）平衡附-階^(1\5〇11);將上述粗酶液以3111171^11的流速過(guò) 平衡好的Ni柱，上樣結(jié)束后，繼續(xù)以相同流速，以平衡緩沖液沖至平衡，提高流速至5mL/ min，繼續(xù)沖至平衡。以不同咪唑濃度出8、116和500mM)的緩沖液進(jìn)行洗脫并收集相應(yīng)蛋 白質(zhì)樣品。純化過(guò)程收集的蛋白樣品SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示。
[0056] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)鎳柱親和層析方法從重組菌B. subtilisl012wt/ pHTHis-nsXynA Λ SLH中純化得到的木聚糖酶回收率高達(dá)57%，IL發(fā)酵液最終獲得木聚糖 酶純品19. 2mg。
[0057] 實(shí)施例4
[0058] 重組木聚糖酶的酶活測(cè)定
[0059] 木聚糖酶可將木聚糖降解為低聚寡糖，可采用DNS法測(cè)定催化反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)生的 還原糖量來(lái)檢測(cè)木聚糖酶的酶活力（MILLER 1959)。具體步驟如下：向190 μ L lOOmM、pH 6. 5的Bis-Tris-HCl緩沖液中加入90 μ L I %櫸木木聚糖溶液，加入適當(dāng)稀釋過(guò)的20 μ L 粗酶液或純化酶液，80°C反應(yīng)5min，立即加入200 μ LDNS溶液，沸水浴3min，冰水冷卻后離 心，測(cè)定540nm下的吸收值，反應(yīng)整個(gè)過(guò)程同時(shí)以D-木糖作標(biāo)準(zhǔn)。酶活力單位（U)定義為 ： 上述反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μ mol相當(dāng)于D-木糖的還原糖所需要的酶量為1個(gè)酶活力 單位。
[0060] 經(jīng)測(cè)定，以櫸木木聚糖為底物實(shí)施例3中所得的木聚糖酶比酶活達(dá)248. 8U/mg。
[0061] 實(shí)施例5
[0062] 重組木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)檢測(cè)
[0063] 將上述純化酶液分別進(jìn)行下列性質(zhì)檢測(cè)。
[0064] 1.最適反應(yīng)pH的測(cè)定
[0065] 純化酶液分別于不同pH值的緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定其相對(duì)酶活力。檢測(cè)酶活的 方法除了所用的緩沖體系有所不同外，其余均與實(shí)施例3中所述酶活檢測(cè)方法相同。
[0066] 選擇的pH值范圍及緩沖體系如下：0. IM乙酸-乙酸鉀緩沖液pH 3. 5?6.0,0. IM Bis-Tris-HCl緩沖液pH 6. 0?L 0,0· IM Tris-HCl緩沖液pH 7. 0?9. 0。通過(guò)比較不同 pH值下的酶活力差異,可知該酶酶的最適反應(yīng)pH值。相對(duì)酶活的定義為：不同pH值下的 酶活與最大酶活的百分比。結(jié)果表明，本發(fā)明的重組木聚糖酶的最適反應(yīng)PH值為6. 5(結(jié) 果如圖4所示）。
[0067] 2.最適反應(yīng)溫度的測(cè)定
[0068] 純化酶液在最適反應(yīng)pH值下，于不同溫度（即50,55,60,65,70,75,80,85和 90°C )進(jìn)行酶活力檢測(cè)，比較其相對(duì)酶活可知該酶的最適反應(yīng)溫度。檢測(cè)測(cè)酶活的方法除 了反應(yīng)溫度有所不同外，其余均與實(shí)施例3中所述酶活檢測(cè)方法相同。結(jié)果表明，本發(fā)明的 重組木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為80°C (結(jié)果如圖5所示）。
[0069] 3. pH穩(wěn)定性的測(cè)定
[0070] 純化酶液分別以不同pH值的緩沖液稀釋一定倍數(shù)，在70°C條件下保存30min，熱 處理結(jié)束后，測(cè)定其相對(duì)酶活力。檢測(cè)酶活的方法與實(shí)施例3中所述酶活檢測(cè)方法相同，在 最適反應(yīng)PH以及最適反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶活檢測(cè)。
[0071] 選擇的pH值范圍及體系如下：0· IM乙酸-乙酸鉀緩沖液pH 3. 5?6. 0,0· IM Bis-Tris-HCl緩沖液pH 6. 0?L 0,0· IM Tris-HCl緩沖液pH 7. 0?9. 0。通過(guò)比較不同 PH值下保存的酶液的剩余酶活力差異，可知該酶在微酸性、中性以及堿性的條件下較為穩(wěn) 定（結(jié)果如圖6所示）。將未經(jīng)熱處理的純化酶液的酶活記作100%。
[0072] 4.熱穩(wěn)定性的測(cè)定
[0073] 純化酶液分別在不同的溫度（70、75、80°C )中保溫，于最適反應(yīng)條件下分別測(cè)定 保溫不同時(shí)間后酶液的剩余酶活。另外，純化酶液分別在75、76、77、78、79和80°C中保溫 30min，分別測(cè)定酶液的剩余酶活。其中，將未經(jīng)熱處理的酶液的酶活記作100%，比較純化 酶液經(jīng)不同溫度，不同保溫時(shí)間的熱處理后的相對(duì)酶活。結(jié)果表明，該酶在70°C的條件下保 溫2h后幾乎沒(méi)有酶活損失，在75°C條件下保溫2h仍能保留約90%的剩余酶活，于75、76、 77°C保溫30min均幾乎沒(méi)有酶活損失?？梢?，該重組木聚糖酶具有很好的溫度穩(wěn)定性（結(jié) 果見圖7和圖8所示）。
【權(quán)利要求】
1. 一種耐熱耐堿木聚糖酶，其特征在于，選自如下⑴或⑵或⑶： (1) 由SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成的全長(zhǎng)木聚糖酶； (2) 由SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列組成的重組木聚糖酶； (3) 將SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的 取代和/或缺失和/或添加且具有耐熱耐堿木聚糖酶活性的由（1)或（2)衍生的蛋白質(zhì)。
2. 權(quán)利要求1所述木聚糖酶的編碼基因，其特征在于， (1)其核苷酸序列編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)分子； ⑵其核苷酸序列是SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3所示的序列； (3) 其核苷酸序列是SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列經(jīng)一個(gè)或幾個(gè)核苷 酸的取代和/或缺失和/或添加所得的衍生序列； (4) 與（1)所限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述木聚糖酶的核苷酸序列。
3. 含有權(quán)利要求2所述編碼基因的重組載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于，將表達(dá)載體pHTHis與權(quán)利要求2的 基因以限制性內(nèi)切酶BamH I和Pst I分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至 E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)菌落PCR、測(cè)序篩選出陽(yáng)性克??；陽(yáng)性克隆接至含氨芐 青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，即得到重組載體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述表達(dá)載體pHTHis的制備：將SEQ ID N0:9的基因片段與質(zhì)粒pHTOl均用BamH I、Aat II進(jìn)行雙酶切，分別純化后進(jìn)行連接， 轉(zhuǎn)化至E. coli DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)菌落PCR、測(cè)序篩選出陽(yáng)性克??；再將陽(yáng)性克隆接至 含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，即為表達(dá)載體pHTHis。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述表達(dá)載體pHTHis的克隆/表達(dá) 區(qū)域如圖1所示。
7. 含有權(quán)利要求2所述編碼基因的重組菌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組菌，其特征在于，權(quán)利要求3?6任一項(xiàng)所述的重組載 體通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)至枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)中，再以氯霉素 LB平板進(jìn)行篩 選，即獲得該木聚糖酶重組菌。
9. 含有權(quán)利要求2所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
10. 含有權(quán)利要求2所述編碼基因的表達(dá)盒。
【文檔編號(hào)】C12N15/75GK104263711SQ201410466572
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】李爽, 黃雄亮, 王菊芳 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)