Dtt處理結(jié)合chip與emsa體內(nèi)外分析擬南芥hsf1三聚體形成的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種二硫蘇糖醇處理結(jié)合染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)與電泳遷移率變動(dòng)分析體內(nèi)外分析擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子HSF1三聚體形成的方法。在以往的研究中，關(guān)于蛋白質(zhì)分子間二硫鍵的研究方法主要采用物理化學(xué)的方法結(jié)合生物信息學(xué)進(jìn)行分析，本方法采用分子生物學(xué)的方法，采用二硫鍵的還原劑二硫蘇糖醇(DL-Dithiothreitol，DTT)進(jìn)行處理HSF1后，再?gòu)纳飳W(xué)功能的角度結(jié)合染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(CHIP)與電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)體內(nèi)外研究HSF1的活性狀態(tài)，從而揭示三聚體形成與二硫鍵的關(guān)系，此方法可以把結(jié)構(gòu)和功能有效的結(jié)合，是研究HSF1三聚體形成的有效方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】DTT處理結(jié)合CHIP與EMSA體內(nèi)外分析擬南芥HSF1三聚體形成的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及DTT處理結(jié)合CHIP與EMSA體內(nèi)外分析擬南芥HSFl三聚體形成的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]植物熱激因子(heat shock transcript1n factor, HSF)是真核生物熱激反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它屬于一類(lèi)在真核細(xì)胞領(lǐng)域保守的蛋白家族。目前對(duì)植物HSF的研究主要是以模式植物擬南芥為對(duì)象，在擬南芥中存在21個(gè)HSFs的同源體，組成HSF家族。雖然目前對(duì)絕大多數(shù)同源體的功能還不了解，但研究顯示其中HSFl是與耐逆境有關(guān)的主要調(diào)控因子[7_9] JtHSFl境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理研究顯示，與大多數(shù)HSF相似，在非逆境條件下，HSFl以非活性的單體形式存在，逆境誘導(dǎo)HSFl單體形成三聚體(活性)、與靶DNA啟動(dòng)子區(qū)HSE (5’ -nGAAnnTTCnnGAAn-3’)特異性結(jié)合，從而調(diào)控逆境防御基因的表達(dá)。然而，不清楚AtHsfAl三聚體是如何形成而調(diào)控逆境防御基因表達(dá)，研究熱激因子三聚體形成的化學(xué)本質(zhì)與機(jī)理是未來(lái)研究的發(fā)展趨勢(shì)。對(duì)哺乳動(dòng)物HSFl的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變研究發(fā)現(xiàn):HSF1由單體轉(zhuǎn)化為多聚體活化形式需要兩個(gè)較保守的半胱氨酸殘基，這兩個(gè)半胱氨酸在氧化條件下可形成二硫鍵，暗示不同逆境信號(hào)誘導(dǎo)熱激因子形成三聚體可能是通過(guò)半胱氨酸氧化作用。然而不清楚擬南芥HSFl感應(yīng)逆境形成三聚體是否也是通過(guò)半胱氨酸氧化作用。研究顯示HSFl的寡聚域(HR-A/B)中含有I個(gè)半胱氨酸(Cys)，HSFl三聚體與二硫鍵的關(guān)系是目前研究的熱點(diǎn)。在以往的研究中，關(guān)于蛋白質(zhì)分子間的研究方法包括生物化學(xué)、生物物理學(xué)、遺傳學(xué)和計(jì)算機(jī)等領(lǐng)域的方法。所涉及的尖端技術(shù)包括表面質(zhì)粒共振技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、熒光極化、等溫滴定量熱法、圓二色分析、蛋白質(zhì)片段補(bǔ)充試驗(yàn)、各種雙雜交系統(tǒng)，以及蛋白質(zhì)組方法和生物信息學(xué)方法。對(duì)于二硫鍵的研究方法主要采用物理化學(xué)的方法結(jié)合生物信息學(xué)進(jìn)行分析，早期確證二硫鍵配對(duì)方式，是通過(guò)HPLC肽譜比較還原性與非還原性酶解后的肽段混合物，找出并收集差異峰，通過(guò)氨基酸組成分析或N端測(cè)序來(lái)確定肽段序列，并推測(cè)二硫鍵的配對(duì)方式。該方法過(guò)程繁瑣，精確度低，成功率低，很難確定復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的二硫鍵配對(duì)方式。后來(lái)隨著質(zhì)譜的出現(xiàn)，應(yīng)用MALD1-T0F分析還原性與非還原性酶解后的肽段混合物的質(zhì)量肽譜圖，確定二硫鍵相連肽段的分子量，從而推測(cè)二硫鍵配對(duì)方式。該法找到的肽段覆蓋率較低，約為40%左右，只能找到少數(shù)的二硫鍵。另外，該法處于一級(jí)質(zhì)譜水平，可信度大打折扣。目前應(yīng)用更先進(jìn)的液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)與多酶解相結(jié)合，通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)找到的二硫鍵鏈接的肽段進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，提高了覆蓋率到90%左右，從而顯著提高了找到二硫鍵的機(jī)會(huì)，但這種研究方法僅從分子結(jié)構(gòu)的角度去驗(yàn)證，由于生物分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的難度增大。本方法采用分子生物學(xué)的方法，采用二硫鍵的還原劑二硫蘇糖醇(DL-Dith1threitol，DTT)進(jìn)行處理HSFl后，從熱激因子HSFl體內(nèi)外的生物學(xué)功能來(lái)推測(cè)其三聚體是否形成，如何形成。體內(nèi)研究HSFl的生物學(xué)功能采用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)，其染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的基本原理是在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA共價(jià)交聯(lián)在一起，超聲波將其打碎為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)所要研究的目的蛋白質(zhì)特異性抗體沉淀此復(fù)合體，用Protein-A/G-Agarose/Sepharose特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，用不含Dnase的Rnase和ProteinaseK解除交聯(lián)，純化DNA，通過(guò)對(duì)目的片斷的檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。此方法可以克服體外研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的局限，具體表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:首先，每次分離轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白結(jié)合的靶DNA片段，不僅能得到一些親和力高的DNA片段，還能富集親和力弱的靶DNA片段。其次體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合可以充分反映生理?xiàng)l件下DNA與蛋白質(zhì)相互作用的真實(shí)情況，找出在生理?xiàng)l件下某個(gè)DNA結(jié)合蛋白與DNA序列的結(jié)合位點(diǎn)，從而反映體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的真實(shí)情況。體外研究HSFl的生物學(xué)功能采用電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)又稱(chēng)為凝膠阻滯分析，它是一種在體外證實(shí)目的蛋白與靶DNA直接結(jié)合的方法。在EMSA中，目的蛋白與生物素標(biāo)記的靶DNA混合后，用電泳分離，如果目的蛋白結(jié)合于靶DNA，電泳帶移動(dòng)將會(huì)緩慢。二硫蘇糖醇處理后，從生物學(xué)功能的角度結(jié)合染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(CHIP)與電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)體內(nèi)外研究HSFl的活性狀態(tài)，從而揭示三聚體形成與二硫鍵的關(guān)系。這種方法可以把擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子HSFl結(jié)構(gòu)和功能有效的結(jié)合，是研究HSFl三聚體形成的有效方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種DTT ( 二硫蘇糖醇)處理結(jié)合CHIP (染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù))與EMSA (電泳遷移率變動(dòng)分析)體內(nèi)外分析HSFl (擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子)三聚體形成的方法?？梢园褦M南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子HSFl結(jié)構(gòu)和功能有效的結(jié)合，是研究HSFl三聚體形成的有效方法。
[0004]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0005]一種DTT處理結(jié)合CHIP與EMSA體內(nèi)外分析擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子HSFl三聚體形成的方法，包括如下步驟:
[0006]步驟一、逆境處理擬南芥小苗和熱激因子HSFl ；
[0007]步驟二、DTT處理逆境脅迫后擬南芥小苗和純化的蛋白；
[0008]步驟三、將上述各種體內(nèi)逆境處理和未處理的小苗用甲醛交聯(lián)和染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)，獲得染色質(zhì)免疫沉淀DNA ；
[0009]步驟四、利用電泳遷移率變動(dòng)分析EMSA研究不同逆境在體外對(duì)HSFl的激活。
[0010]進(jìn)一步的，所述步驟一中，逆境處理擬南芥小苗和熱激因子HSFl的具體步驟為:
[0011]逆境處理擬南芥小苗和熱激因子HSFl:
[0012](1.1)逆境處理擬南芥小苗:
[0013]取生長(zhǎng)4周的小苗放入培養(yǎng)buffer中進(jìn)行以下逆境處理:
[0014](I)熱激處理:39°C水浴中震蕩培養(yǎng)30min ；
[0015](2)酸脅迫:經(jīng)琥珀酸調(diào)整后pH值為3.5，在真空下處理20min ；
[0016](3)堿脅迫:經(jīng)Tris調(diào)整后pH值為8.0,在真空下處理20min ；
[0017](4) H2O2脅迫(氧化脅迫):加入H2O2使其終濃度為0.4mM,在真空下處理45min ；
[0018](5)鹽脅迫:加入NaCl使其終濃度為1.2M,在真空下處理45min ；
[0019](6)滲透脅迫:加入山梨醇使其終濃度為1.7M,在真空下處理45min ；
[0020](7)對(duì)照:不經(jīng)過(guò)任何逆境處理；
[0021](1.2)逆境處理熱激因子HSFl:
[0022](1.2.DHSFl的非變性表達(dá)純化；
[0023](1.2.2) HSFl的體外逆境處理；
[0024](I)熱脅迫:取140 μ I純化后的HSFl重組蛋白，39°C處理30min ；
[0025](2)酸脅迫:琥珀酸 0.05M, pH 為 6.5，處理 20min ；
[0026](3)堿脅迫=Tris 濃度為 0.33M，pH 為 8.8，處理 20min ；
[0027](4) H2O2脅迫(氧化脅迫):過(guò)氧化氫濃度為0.4mM,處理45min ；
[0028](5)鹽脅迫=NaCl濃度為1M，處理Ih ；
[0029](6)滲透脅迫:山梨糖醇濃度為1M，處理Ih ；
[0030](7)對(duì)照:不經(jīng)過(guò)任何逆境處理；
[0031]進(jìn)一步的，所述步驟二中，DTT處理逆境脅迫后擬南芥小苗和純化的蛋白的具體步驟包括:
[0032](I) DTT處理逆境脅迫后擬南芥小苗；
[0033]將上述各種逆境處理和未處理的小苗，在室溫下浸入交聯(lián)緩沖液中，加入50mMDTT在真空下處理Ih ；
[0034](2) DTT處理逆境脅迫后純化的蛋白；
[0035]取140ul蛋白質(zhì)分別用熱、酸、堿、H2O2逆境處理后，用DTT處理；將DTT加入至終濃度為5mM，25°C條件下放置30min。
[0036]進(jìn)一步的，所述步驟三中，染色質(zhì)免疫沉淀的具體步驟為:
[0037](I)、封閉和洗滌蛋白A瓊脂糖膠；
[0038]在1.5ml Eppendorf管中加入60 μ 150%懸浮的蛋白A瓊脂糖膠,每次以Iml裂解緩沖液 l(50mM HEPES-K0H, ρΗ7.5,140mM NaCl, ImM EDTA, 1% TritonX-100,0.1%脫氧膽酸鈉，ImM PMSF)洗滌兩次，lOOOrpm，4°C，離心lmin，收集蛋白A瓊脂糖膠，再加ImlI % BSA于上述蛋白A瓊脂糖膠中，4°C共培養(yǎng)6h封閉其非特異性位點(diǎn)；
[0039]用Iml裂解緩沖液I洗封閉后的蛋白A瓊脂糖膠，lOOOrpm, 4°C，離心lmin，收集沉淀；重復(fù)洗滌一次，離心收集沉淀；
[0040](2)、抗血清與擬南芥細(xì)胞上清液共培養(yǎng)；
[0041]加60 μ I抗AHSF的抗血清于上述擬南芥細(xì)胞上清液中，4°C共培養(yǎng)4h ;對(duì)照實(shí)驗(yàn)中加等體積的PBS緩沖液；
[0042](3)、蛋白A瓊脂糖膠和抗體共溫育后的擬南芥細(xì)胞共培養(yǎng)；
[0043]蛋白A瓊脂糖膠沉淀轉(zhuǎn)入與抗體共溫育后的擬南芥細(xì)胞破碎液中，4°C冰浴培養(yǎng)30min一 Ih ; lOOOrpm, 4°C,離心 lmin,收集沉淀；
[0044](4)、洗滌蛋白A瓊脂糖膠；
[0045](5)、洗脫免疫沉淀DNA和蛋白質(zhì)復(fù)合物；
[0046](6)、Klenow DNA聚合酶處理免疫沉淀DNA和蛋白質(zhì)復(fù)合物；
[0047]

【權(quán)利要求】
1.一種DTT處理結(jié)合CHIP與EMSA體內(nèi)外分析擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子HSFl三聚體形成的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一、逆境處理擬南芥小苗和熱激因子HSFl ； 步驟二、DTT處理逆境脅迫后擬南芥小苗和純化的蛋白； 步驟三、將上述各種體內(nèi)逆境處理和未處理的小苗用甲醛交聯(lián)和染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)，獲得染色質(zhì)免疫沉淀DNA ； 步驟四、利用電泳遷移率變動(dòng)分析EMSA研究不同逆境在體外對(duì)HSFl的激活。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟一中，逆境處理擬南芥小苗和熱激因子HSFl的具體步驟為: 逆境處理擬南芥小苗和熱激因子HSFl: (1.D逆境處理擬南芥小苗: 取生長(zhǎng)4周的小苗放入培養(yǎng)buffer中進(jìn)行以下逆境處理: (1)熱激處理:39°C水浴中震蕩培養(yǎng)30min； (2)酸脅迫:經(jīng)琥珀酸調(diào)整后pH值為3.5，在真空下處理20min ； (3)堿脅迫:經(jīng)Tris調(diào)整后pH值為8.0,在真空下處理20min ；(4)H2O2脅迫(氧化脅迫):加入H2O2使其終濃度為0.4mM,在真空下處理45min ； (5)鹽脅迫:加入NaCl使其終濃度為1.2M,在真空下處理45min ； (6)滲透脅迫:加入山梨醇使其終濃度為1.7M,在真空下處理45min ； (7)對(duì)照:不經(jīng)過(guò)任何逆境處理； (1.2)逆境處理熱激因子HSFl: (1.2.DHSFl的非變性表達(dá)純化； (1.2.2) HSFl的體外逆境處理； (1)熱脅迫:取140μ I純化后的HSFl重組蛋白，39°C處理30min ； (2)酸脅迫:琥珀酸0.05M, pH為6.5，處理20min ； (3)堿脅迫=Tris濃度為0.33M，pH為8.8，處理20min ； (4)H2O2脅迫(氧化脅迫):過(guò)氧化氫濃度為0.4mM,處理45min ； (5)鹽脅迫=NaCl濃度為1M，處理Ih； (6)滲透脅迫:山梨糖醇濃度為1M，處理Ih； (7)對(duì)照:不經(jīng)過(guò)任何逆境處理。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟二中，DTT處理逆境脅迫后擬南芥小苗和純化的蛋白的具體步驟包括: (1)DTT處理逆境脅迫后擬南芥小苗； 將上述各種逆境處理和未處理的小苗，在室溫下浸入交聯(lián)緩沖液中，加入50mMDTT在真空下處理Ih ； (2)DTT處理逆境脅迫后純化的蛋白； 取140ul蛋白質(zhì)分別用熱、酸、堿、H2O2逆境處理后，用DTT處理；將DTT加入至終濃度為5mM，25°C條件下放置30min。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟三中，染色質(zhì)免疫沉淀的具體步驟為: (1)、封閉和洗滌蛋白A瓊脂糖膠； 在1.5ml Eppendorf管中加入60 μ 150%懸浮的蛋白A瓊脂糖膠,每次以Iml裂解緩沖液 I (50mM HEPES-K0H, ρΗ7.5，140mM NaCl, ImM EDTA, 1% TritonX-100,0.1 %脫氧膽酸鈉，ImM PMSF)洗滌兩次，lOOOrpm，4°C，離心lmin，收集蛋白A瓊脂糖膠，再加ImlI % BSA于上述蛋白A瓊脂糖膠中，4°C共培養(yǎng)6h封閉其非特異性位點(diǎn)； 用Iml裂解緩沖液I洗封閉后的蛋白A瓊脂糖膠，lOOOrpm，4°C，離心lmin，收集沉淀；重復(fù)洗滌一次，離心收集沉淀； (2)、抗血清與擬南芥細(xì)胞上清液共培養(yǎng)； 加60 μ I抗AHSF的抗血清于上述擬南芥細(xì)胞上清液中，4°C共培養(yǎng)4h ;對(duì)照實(shí)驗(yàn)中加等體積的PBS緩沖液； (3)、蛋白A瓊脂糖膠和抗體共溫育后的擬南芥細(xì)胞共培養(yǎng)； 蛋白A瓊脂糖膠沉淀轉(zhuǎn)入與抗體共溫育后的擬南芥細(xì)胞破碎液中，4 °C冰浴培養(yǎng)30min一 Ih ; lOOOrpm, 4°C,離心 lmin,收集沉淀； (4)、洗滌蛋白A瓊脂糖膠； (5)、洗脫免疫沉淀DNA和蛋白質(zhì)復(fù)合物； (6)、KlenowDNA聚合酶處理免疫沉淀DNA和蛋白質(zhì)復(fù)合物；免疫沉淀?合物90 μ?1mMdNTPsI μ?10 ? buffer10 μ?Klenow(2 U/μΙ)I μ? 在0.5ml的Eppendorf管中依次加入上述試劑和免疫沉淀復(fù)合物，混勻后并短暫離心，在 25°C反應(yīng) 30min，75°C加熱 1min ； (7)、蛋白酶K水解蛋白； 加入等體積(102 μ I) lmg/ml 蛋白酶 K (溶于 50mM Tris, 1mM EDTA, 0.3 %SDS, ρΗ7.5)，60°C水浴過(guò)夜； (8)、免疫沉淀DNA的分離純化； 向上述獲得的免疫沉淀DNA洗脫液中加入等體積的苯酚/氯仿(1:1)混合物，渦旋混勻；14000rpm離心3min,將上清轉(zhuǎn)至新的1.5ml離心管中；加等體積苯酹/氯仿(1:1)，混勻后14000rpm離心3min ;取上清,加等體積氯仿抽提，14000rpm離心3min ;上清轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中；加1/10體積的醋酸鈉，2.5倍體積100%的乙醇及20 μ g糖元，-20°C，靜置過(guò)夜；14000rpm離心30min ;去上清,M 70%酒精洗沉淀；14000rpm離心30min ;抽干，加入20 μ ITE緩沖液(或無(wú)菌水)溶解沉淀，-20°C保存； (9)、PCR分析免疫沉淀DNA； 根據(jù)己發(fā)表的擬南芥熱激基因及非熱激基因的全基因序列分別設(shè)計(jì)啟動(dòng)子區(qū)引物18.2P、70P和編碼區(qū)的引物18.2C ； 用以下體系進(jìn)行PCR檢測(cè)；10 X PCR buffer2μ1
PCR擴(kuò)增的參數(shù)為:94°C預(yù)變性5min，然后以94°C 20s為變性參數(shù)，49_56°C 20s為退火參數(shù)，72°C 1s為延伸參數(shù)，循環(huán)數(shù)為25 ;經(jīng)10% DNA聚丙烯酰氨凝膠分析PCR產(chǎn)物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(9)中，所述啟動(dòng)子區(qū)引物18.2P、70P和編碼區(qū)的引物18.2C的序列分別為:啟動(dòng)子區(qū)引物18.2P序列為:
AtHSP 18.2/-229u:5’ -ATT TTT CTT GGC ATT TCA GG-3’
AtHSP 18.2/-243d:5’ -GCA TTT CGG TCT TGT TTC A_3’ (52°C ) 啟動(dòng)子區(qū)引物70P序列為:
AtHSP 70/-304u:5’ -AAA TTG TCA AAT AGT AAC TC-3’
AtHSP 70/-325d:5’ -ATG TTA ATT GGG TGA TGA A -3’ 編碼區(qū)的引物18.2C序列為:
AtHSP 18.2/-5014u:5’ -TGA CGT TGT TTA AAT CTG TTC-3，
AtHSP 18.2/-5033d:5’ -CCG TAC GCA TCC TTC TC-3，。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟四利用電泳遷移率變動(dòng)分析EMSA研究不同逆境在體外對(duì)HSFl的激活的具體步驟為: (1)、探針的制備: 采用與保守序列相同的片斷做為探針，用Touch down PCR合成雙鏈；
Perfect-HSE: 5，-GGCTTCAAGAAGCTTCTATG-3，，5，-CATAGAAGCTTCTTGAAGCC-3’(3，生物素標(biāo)記) (2)、EMSA結(jié)合反應(yīng): 如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng): 陰性對(duì)照反應(yīng):其中陰性對(duì)照I為未經(jīng)任何逆境處理；陰性對(duì)照2為未加DTT:
樣品反應(yīng):加入逆境處理HSFl:
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104198719SQ201410335904
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】郭麗紅, 劉艷芳, 蘇源, 楊曉虹, 陳子牛 申請(qǐng)人:昆明學(xué)院