專利名稱：攜帶基于hGluc基因的miRNA傳感器的重組AAV病毒庫(kù)及用途的制作方法
攜帶基于hG I uc基因的m i RNA傳感器的重組AAV病毒庫(kù)及
用途本發(fā)明屬于生物技術(shù)發(fā)明領(lǐng)域。是我們申報(bào)的中國(guó)專利“AAV病毒反向感染技 術(shù)及AAV病毒陣列(申請(qǐng)?zhí)?00910009059. 6)”的延續(xù)和擴(kuò)展。本發(fā)明具體涉及用攜 帶了受miRNA調(diào)控表達(dá)Gluc基因的重組AAV病毒作為檢測(cè)活細(xì)胞中miRNA活性的生 物傳感器，即“受miRNA調(diào)控表達(dá)Gluc基因的重組AAV病毒傳感器”，其英文可表述為 “rAAV-(Flue)-Gluc-miRNA sensor”。其中，“rAAV-(Flue)-Gluc-miRNA sensor”中所提及 的“ (Flue) ”是結(jié)構(gòu)中所包含的內(nèi)參基因元件。這種生物傳感器檢測(cè)活細(xì)胞中miRNA活性 所使用的是AAV病毒反向感染技術(shù)。rAAV-(Flue)-Gluc-miRNA sensor 的基因組的組成元件包括AAV ITR- ( ρ ο 1 y A - F 1 u c - P G K promoter) - Insulator -(CMV promoter-Gluc-mirT-polyA)-AAV ITR ；其中，(polyA-Fluc-PGK promoter)是 Fluc 的表 達(dá)單元；(CMV promoter-Gluc-mirT-polyA)是 Gluc 的表達(dá)單元；Gluc 是 hGluc (人源化的 Gluc)，也可以使用天然的 Gluc (Gaussia 熒光素酶，Gaussia luciferase, Gluc)。rAAV-(Flue)-Gluc-miRNA sensor的作用是探測(cè)活細(xì)胞中能與 rAAV-(Flue)-Gluc-miRNA sensor 所攜帶的 miRNA 靶序列(“miRNA 靶序列”簡(jiǎn)寫為“mirT”) 相對(duì)應(yīng)的miRNA的活性。將已知的所有mirT分別置于Gluc基因與polyA之間，制備成一系 列攜帶基于Gaussia熒光素酶基因的miRNA傳感器，構(gòu)成一個(gè)重組AAV病 毒庫(kù)(rAAV-(Flue)-Gluc-miRNA sensor庫(kù))。將該庫(kù)中全部的或部分的 rAAV-(Flue)-Gluc-miRNA sensor按相同的Fluc表達(dá)效率有序包被在細(xì)胞培養(yǎng)支持物上 (如96孔板或384孔板)，在無菌條件下制成可長(zhǎng)期儲(chǔ)存放置的重組AAV病毒陣列。應(yīng)用重組AAV病毒陣列時(shí)，將活細(xì)胞懸液加入預(yù)置了 rAAV-(Flue)-Gluc-miRNA sensor陣列的細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，重組AAV病毒將“反式感染”所加入的細(xì)胞，感染了這些 病毒的細(xì)胞內(nèi)的Gluc基因?qū)⒈磉_(dá)并分泌到培養(yǎng)上清中；細(xì)胞內(nèi)源性miRNA將特異性地和 rAAV-(Flue)-Gluc-miRNA sensor中與之互補(bǔ)的mirT相結(jié)合，并對(duì)Gluc的表達(dá)產(chǎn)生不同 程度的抑制作用。通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中Gluc酶的活性，可以比較和計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)各種 miRNA的活性水平。背景microRNA (miRNA)是長(zhǎng)度在18 25個(gè)核苷酸左右的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。 miRNA在進(jìn)化上高度保守，具有轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控功能。miRNA由基因組DNA編碼，在RNA 聚合酶II的作用下被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。這些miRNA通過RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)靶向到達(dá)mRNA，進(jìn)而產(chǎn)生miRNA阻遏翻譯或引導(dǎo)miRNA對(duì)mRNA 進(jìn)行酶切的功能。最近有研究表明，miRNA具有多種生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡 等。有研究人員發(fā)現(xiàn)線蟲體內(nèi)的異時(shí)性基因lin-4編碼的miRNA與lin-14反義互補(bǔ)。據(jù) 估計(jì)，脊椎動(dòng)物基因組編碼多達(dá)1000種不同的miRNA，研究人員推測(cè)，這些miRNA可能調(diào)控至少30%的基因的表達(dá)。盡管研究人員目前已在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)超過700多種miRNA，但仍需 進(jìn)一步研究以了解這些分子的確切的細(xì)胞學(xué)功能，及其在疾病發(fā)生中所扮演的角色。有研 究報(bào)道，miRNA具有腫瘤抑制因子及癌基因的作用。那些在癌癥發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用的 miRNA被稱作oncogenic miRNA,即oncomiR。oncomiR的失調(diào)與基因突變或表觀遺傳變異 有關(guān)，這些變異包括缺失突變、擴(kuò)增突變、點(diǎn)突變及DNA異常甲基化等。Lu等人采用串珠流式細(xì)胞miRNA表達(dá)譜分析技術(shù)對(duì)來自人惡性腫瘤組織的miRNA 進(jìn)行系統(tǒng)表達(dá)分析，其中包括結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌和胃癌。miRNA表達(dá)譜成功對(duì)低分化腫瘤 進(jìn)行了分類。研究揭示了 miRNA表達(dá)水平在癌癥診斷中的重要作用[Lu J，Getz G，Miska EA，et al. (2005). Nature. 435，834-838]。Bottoni 等人則采用芯片技術(shù)及 RT-PCR 分析了 垂體腺瘤和正常垂體樣本中的全部miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)水平可以區(qū)分垂體微腺瘤 和垂體巨腺瘤，還有一些miRNA參與細(xì)胞增殖與凋亡的過程。miRNA可以作為有效的診斷 標(biāo)志，提高對(duì)垂體腺瘤的分類水平[Bottoni A, Zatelli MC, Ferracin M, et al. (2007). J Cell Physiol. 210,370-377. ]。Lee 等人采用原位 RT-PCR 技術(shù)，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn) miR221、 miR301和miR376a的異常表達(dá)只在胰腺癌細(xì)胞中出現(xiàn)，而沒有在良性胰腺腫瘤及正常間質(zhì) 和導(dǎo)管處出現(xiàn)。miRNA的異常表達(dá)可以作為胰腺腫瘤發(fā)生的研究線索，同時(shí)也可能為胰腺癌 診斷提供新的生物學(xué)標(biāo)志[Lee EJ, Gusev Y，Jiang J，et al. (2007). Int J Cancer. 120， 1046-1054.]。microRNA在癌癥預(yù)后判斷中的作用Takamizawa等人報(bào)道指出，let_7miRNA的 表達(dá)往往在人肺癌中缺失，而let-7miRNA表達(dá)的減少與術(shù)后生存期的減短顯著相關(guān)。此 外，let-7miRNA在A549肺腺癌細(xì)胞株中的過表達(dá)可在體外抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。他們的 研究結(jié)果表明了 let_7miRNA表達(dá)水平的改變具有潛在臨床和生物學(xué)作用[Takamizawa J， Konishi H,Yanagisawa K, et al. (2004). Cancer Res. 64，3753-3756. ]。Yanaihara 等人的 研究可以區(qū)分肺癌組織和非惡性腫瘤組織的miRNA表達(dá)模式。前體miRNA hsa-miR155的 高表達(dá)和hSa-let-7a-2的低表達(dá)與肺腺癌的低生存率相關(guān)。他們的研究表明，miRNA不僅 可以作為肺癌的診斷學(xué)標(biāo)志，還可以作為預(yù)后預(yù)測(cè)的標(biāo)志[Yanaihara N, Caplen N, Bowman Ε, et al. (2006). Cancer Cell. 9，189-198]。Roldo 等人則發(fā)現(xiàn)，miR21 在胰腺腫瘤中的過 表達(dá)與高Ki67增殖指數(shù)及出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移高度相關(guān)。他們的研究結(jié)果表明，miRNA表達(dá)水平的 改變與惡性腫瘤的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)相關(guān)[Roldo C,Missiaglia E,Hagan JP, et al. (2006). J Clin Oncol. M，4677-4684.]。此外，Bloomston等人將胰腺癌細(xì)胞中的miRNA的表達(dá)水平與正常 胰腺和慢性胰腺炎組織細(xì)胞的miRNA進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞中miRNA表達(dá)水平與 后兩者不同，可以有效區(qū)分開來。miR196a-2的高表達(dá)可以用于預(yù)測(cè)不良預(yù)后[Bloomston M, Frankel WL, Petrocca F, et al. U007)·JAMA. 297，1901—1908·]。某些miRNA表達(dá)狀態(tài)受到癌細(xì)胞中表觀遺傳學(xué)改變的控制，比如DNA甲基化和組 蛋白修飾。采用染色質(zhì)修飾藥物激活腫瘤抑制性miRNA可以靶向調(diào)節(jié)癌基因，這一策略也 許能在不久的將來成為癌癥的新型治療方法。miRNA可以與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)中的生物 學(xué)標(biāo)志相結(jié)合，成為癌癥診斷和判斷預(yù)后的參考指標(biāo)[Cho WC. (2007). Mol Cancer. 6, 25.； Cho WC, Cheng CH. (2007). Expert Rev Proteomics. 4，401-410.]。盡管每個(gè) miRNA 可以 調(diào)控成百個(gè)靶向基因，但在癌癥研究中鑒別出miRNA的準(zhǔn)確靶點(diǎn)仍然是一大難題。此外， 由于干細(xì)胞可以分化發(fā)育成為多種類型的細(xì)胞，因而成為研究者們矚目的焦點(diǎn)。已有研究指出miRNA通路在干細(xì)胞分化中起調(diào)控作用，而其機(jī)制是否可用于癌癥的預(yù)防與治療還需 要進(jìn)一步石if究[Cho WC. Afuture of cancer prevention and cures :highlights of the Centennial Meeting of the American Association for Cancer Research. (2007). Ann Oncol.]。miRNA在多種病理過程中的功能的發(fā)現(xiàn)，使得對(duì)疾病進(jìn)行分子水平的診斷和預(yù)后 預(yù)測(cè)成為可能，對(duì)于癌癥尤其如此。Andrew Fire和Craig Mello因發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象——雙鏈RNA誘導(dǎo)的基因沉默 而獲2006年度諾貝爾獎(jiǎng)。自從在一些生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)相互作用的反義RNA具有調(diào)控功能以 來，轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)節(jié)便躋身于主要基因調(diào)控機(jī)制的行列。miRNA通過堿基互補(bǔ)誘導(dǎo)RNA 干擾路徑，從而抑制靶向mRNA。數(shù)以百計(jì)的miRNA的發(fā)現(xiàn)使我們對(duì)于RNA干擾現(xiàn)象在生物 醫(yī)學(xué)上的意義有了全新的認(rèn)識(shí)。研究者的目光開始集中于利用反義寡核苷酸抑制miRNA功 能，或者采用小干擾RNA類技術(shù)研究miRNA?？茖W(xué)家們致力于揭開miRNA生物學(xué)的神秘面 紗，挖掘其在疾病治療方面的應(yīng)用潛力。對(duì)患者進(jìn)行的有關(guān)oncomiR的大型高通量研究， 可以對(duì)癌癥進(jìn)行新的分類，并對(duì)患者預(yù)后做出更為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。聯(lián)合基因組學(xué)、微RNA組 學(xué)(miRomics)以及蛋白質(zhì)組學(xué)的高通量靶向分析，有助于我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶 點(diǎn)ο下表羅列出部分microRNA的表達(dá)與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷、預(yù)后
的關(guān)系
microRNA腫瘤發(fā)牛診斷預(yù)后miR9神經(jīng)母細(xì)胞瘤
權(quán)利要求
1.本發(fā)明所述的AAV病毒反向感染技術(shù)，其技術(shù)特征是將重組AAV病毒預(yù)先包被并晾 干在細(xì)胞培養(yǎng)支持物上，以便在加入活細(xì)胞懸液時(shí)，所包被的AAV病毒能有效反向感染后 加入的細(xì)胞。
2.依據(jù)權(quán)利要求1，被預(yù)先包在細(xì)胞培養(yǎng)支持物上的重組AAV病毒，是被預(yù)先設(shè)計(jì)分布 成為AAV病毒陣列，其特征在于將一種或多種重組腺相關(guān)病毒(AAV)有序地包被在細(xì)胞培 養(yǎng)支持物上、晾干制備成可存放的重組AAV病毒陣列產(chǎn)品，所包被的重組AAV病毒在存放過 程中仍保持感染細(xì)胞的能力。
3.依據(jù)權(quán)利要求1，被預(yù)先包在細(xì)胞培養(yǎng)支持物上的重組AAV病毒內(nèi)的mirT與細(xì)胞內(nèi) miRNA作用而調(diào)控重組AAV病毒所攜帶的報(bào)告基因Gluc表達(dá)水平，這種重組AAV病毒是具 有細(xì)胞miRNA活性檢測(cè)基因傳感器作用的重組AAV病毒。
4.依據(jù)權(quán)利要求3，本發(fā)明所述的包裝成AAV病毒的、用于細(xì)胞miRNA檢測(cè)的基因傳感 器的基因組組成元件及順序?yàn)锳AV ITR- (polyA-Fluc-PGK promoter) -Insulator- (CMVpr omoter-Gluc-mirT-polyA)-AAV ITR0
5.依據(jù)權(quán)利要求4，本發(fā)明所述的mirT是已知的和新發(fā)現(xiàn)的各種miRNA的靶序 列，所有的由不同的mirT所包裝成的重組AAV病毒共同組成為重組AAV病毒庫(kù)，稱為 rAAV-(Flue)-Gluc-miRNA sensor 庫(kù)。
6.依據(jù)權(quán)利要求4，基因組組成元件Gluc基因可以是人源化的Gluc基因(hGluc基 因)，也可以是天然的Gluc基因。
7.依據(jù)權(quán)利要求4，本發(fā)明所述在AAV病毒的兩個(gè)ITR之間、Gluc表達(dá)盒之外插入了 一個(gè)獨(dú)立的、可作為AAV病毒定量的內(nèi)參照的Fluc基因表達(dá)盒，所述的Fluc基因表達(dá)盒由 啟動(dòng)子、Fluc基因、polyA組成。
8.依據(jù)權(quán)利要求4，本發(fā)明所述在AAV病毒的兩個(gè)ITR之間、Gluc表達(dá)盒與Fluc基因 表達(dá)盒之間放置絕緣子序列hsulator，以防止兩個(gè)表達(dá)盒之間的干擾。
9.依據(jù)權(quán)利要求2，本發(fā)明所述的AAV病毒基因傳感器陣列可用于測(cè)定各種干預(yù)因素 (如各種藥物、試劑、理化因素等)對(duì)細(xì)胞中miRNA活性譜的影響。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及用攜帶了受miRNA調(diào)控表達(dá)Gluc基因的重組AAV病毒作為檢測(cè)活細(xì)胞中miRNA活性的生物傳感器，即“受miRNA調(diào)控表達(dá)Gluc基因的重組AAV病毒傳感器”，將該生物傳感器的重組AAV病毒庫(kù)有序地包被在細(xì)胞培養(yǎng)支持物上(如96孔板或384孔板上)，在無菌條件下制成可以長(zhǎng)期儲(chǔ)存放置的重組AAV病毒陣列。在應(yīng)用該重組AAV病毒陣列時(shí)，將活細(xì)胞懸液加入該生物傳感器的重組AAV病毒庫(kù)陣列中，重組AAV病毒將“反式感染”所加入的細(xì)胞并表達(dá)Gluc基因、分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中；細(xì)胞中內(nèi)源性的miRNA將特異性地和與之互補(bǔ)的miRNA靶序列(mirT)相結(jié)合，并對(duì)Gluc的表達(dá)產(chǎn)生不同程度的抑制作用。通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中Gluc酶的活性，可以比較和計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)各種miRNA的活性水平。
文檔編號(hào)C12N15/86GK102061311SQ20091022372
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2009年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者吳小兵, 田文洪, 董小巖 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所, 北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司