專利名稱：一種原料乳前處理方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種原料乳前處理方法，特別是涉及用于原料乳中體細胞的計算機識 別和計數(shù)的原料乳前處理方法。
背景技術：
“原料乳”也稱為“原料奶”，通常是指從奶畜乳房中擠出的未經(jīng)過處理和加工(例 如加熱、消毒)的生鮮液體乳(包括牛乳、羊乳等)。正常的原料乳中沒有奶畜的體細胞，當奶畜患乳房炎時，原料乳中則混存有非乳 成分的細胞體。體細胞增加反映了奶畜患乳房炎程度，同時影響原料乳的品質。體細胞增 加容易導致如下的后果乳脂肪和乳蛋白質的分解，產(chǎn)生酸敗氣味；耐熱酶破壞蛋白質，導 致原料乳的熱穩(wěn)定性下降；耐熱菌增加。原料乳中的體細胞總數(shù)如果偏高，不僅會影響乳制 品企業(yè)的正常生產(chǎn)，而且會造成乳制品的質量安全風險。因此，對原料乳中的體細胞進行快速識別與計數(shù)，是增強原料乳質量控制水平的 主要技術手段之一。目前尚無關于合格的原料乳的體細胞數(shù)量或含量的行業(yè)標準或國家標 準，企業(yè)通?？刂茦藴蕿椴怀^50萬/毫升。原料乳中體細胞的識別與計數(shù)方法可以分為直接法和間接法兩種，其中直接法包 括人工顯微鏡檢測方法和計算機識別與自動計數(shù)方法；間接法包括流體細胞染色計數(shù)方法 和細胞染色后的熒光強度對比方法，其中流體細胞是指采用一套由微量泵、毛細管等液體 流動裝置，使細胞在移動過程中被檢測到的一種細胞形態(tài)。在原料乳中體細胞檢測的直接方法中，傳統(tǒng)的人工染色及顯微鏡檢測方法是我國 目前原料乳中體細胞檢測基本沿用的方法。由于操作時間長，檢測結果需要由人工目力識 別和記數(shù)，不同人員的操作結果差異大，所以其檢測數(shù)據(jù)對原料乳的收購質量判定和后續(xù) 生產(chǎn)質量控制沒有實時的指導意義。在原料乳中體細胞檢測的間接方法中，流體細胞染色計數(shù)的方法不僅對檢測裝置 的制造工藝要求很高，而且該方法的裝置可靠性尚不理想，檢測成本也過高。并且檢測過程 中染色劑的使用對環(huán)境造成的污染，因為幾乎所有的染色劑都有毒性，其保存、干燥和清洗 都會污染空氣和水體。有的染色劑還含有致癌物質。采用熒光強度對比的方法檢測原料乳 中的體細胞，雖然過程比較簡單，但是目前還缺乏對檢測準確性判定的客觀依據(jù)。而計算機識別與自動計數(shù)方法雖然具有直觀、準確、自動和快速的優(yōu)越性，但是對 原料乳樣品的前處理提出很高的要求。在利用計算機識別方法檢測原料乳中體細胞總數(shù)的 過程中，首先要通過生物顯微鏡和數(shù)碼圖像裝置獲取原料乳中體細胞的數(shù)字化圖像，然后 由計算機將數(shù)字化圖像采集與存儲，再由智能化的圖像識別軟件對體細胞圖像進行特征提 取，并且與數(shù)據(jù)庫中的標準特征圖像進行對比分析和統(tǒng)計，據(jù)此檢測出原料乳中的體細胞 總數(shù)。計算機識別方法突出的優(yōu)點，是其檢測過程具有良好的直觀性，是名副其實的直接檢 測，檢測的結果也有更好的可信度。原料乳中體細胞圖像識別的核心，是在積累大量圖像特 征和試驗對比數(shù)據(jù)的基礎上，建立體細胞圖像特征的數(shù)據(jù)庫。而提取原料乳中體細胞形態(tài)的固有特征，就是計算機對體細胞進行識別和計數(shù)的首要任務。要完成這個任務，則要求檢 測的樣品是基本透明的。也就是說，必須要求“看到”樣品。而原料乳樣品是一種包括真溶 液、膠體溶液、乳濁液的復雜體系。其中含有的脂肪球、蛋白質膠束等，對體細胞的檢測造成 了很大的干擾，直接進行識別分析是不可能的。所以，采用現(xiàn)有計算機識別與自動計數(shù)方法 需要對樣品進行前處理，其具體要求是圖像中體細胞邊緣特征明顯，沒有其他物質的成像 干擾，樣品中的體細胞數(shù)量在樣品處理前后有足夠的相關性，例如，處理后的樣品中的體細 胞能夠按比例保留。因此，為實現(xiàn)原料乳中體細胞的快速檢測，滿足現(xiàn)有計算機識別與計數(shù)技術的要 求，迫切需要一種對原料乳樣品進行前處理的方法，以利用現(xiàn)有計算機識別與自動計數(shù)方 法，實現(xiàn)原料乳中的體細胞的直觀、自動和快速檢測，同時提高識別的準確性和靈敏度，并 且減少檢測過程中的環(huán)境污染，實現(xiàn)對原料乳的收購質量判定和后續(xù)生產(chǎn)的質量控制的實 時指導。這對提高我國乳制品的質量安全水平，具有積極的促進作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面是提供一種原料乳前處理方法，以用于對原料乳中的體細胞進 行計算機識別與計數(shù)。一種原料乳前處理方法，包括如下步驟1)將原料乳按照稀釋后樣品重量稀釋前原料乳重量為1 3 1的重量比用水 進行稀釋；2)用濃度為8 9. 5% (重量)的枯草桿菌蛋白酶溶液水解稀釋后的樣品，所述枯 草桿菌蛋白酶溶液按照稀釋后樣品體積枯草桿菌蛋白酶溶液體積為2. 9 3. 1 0. 9 1. 1的體積比添加；水解溫度為20°C 30°C，水解時間為4 6分鐘；和3)用濃度為5 6% (重量)的吖啶橙溶液將水解后的樣品染色，所述吖啶橙溶 液按照水解后樣品體積吖啶橙溶液體積為98 102 1的體積比添加；染色時間為7 8分鐘。由此得到滿足原料乳中體細胞的計算機識別與計數(shù)要求的樣品。為了有效去除原料乳中的蛋白質，在本發(fā)明所述原料乳前處理方法的步驟2)中， 還可以替換選擇能夠水解原料乳中的蛋白(特別是酪蛋白)的其它蛋白酶，包括但不限于， 例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酶、木瓜蛋白酶、組織蛋白酶(A E)、彈性蛋白 酶等，也可以使用市售的蛋白酶制劑，如諾維信公司生產(chǎn)的堿性蛋白酶Alcalase 3.0T、風 味蛋白酶Flavouzyme 500MG、復合蛋白酶protamex等。上述蛋白酶或蛋白酶制劑可以單獨 使用一種，也可以兩種或多種組合使用。為了有效對原料乳中的體細胞進行染色，在本發(fā)明所述原料乳前處理方法 的步驟3)中，還可以使用能夠摻DNA的其它染料，包括但不限于，例如溴化乙錠、 DAP I, HO 33342 (Hoechst 33342), H033258 (Hoechst 33258) , DAPI (4, 6-diamidino 2-phenyl-indoledihydrochloride)、GoldView 以及 DNA Green 等。上述染料可以單獨使 用一種，也可以兩種或多種組合使用。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明所述原料乳前處理方法步驟1)中的所述水 為去離子水。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明所述原料乳前處理方法步驟1)中的所述重 量比為1. 5 2. 5 1，優(yōu)選為2 1。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明所述原料乳前處理方法步驟幻中的所述枯 草桿菌蛋白酶溶液的濃度為8. 5 9. 2% (重量)，優(yōu)選為9% (重量)。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明所述原料乳前處理方法步驟幻中的所述體 積比為3 1。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述原料乳前處理方法步驟幻中的所述水解溫度 為 20°C 22°C。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述原料乳前處理方法步驟2~)中的所述水解時間 為4. 5 5. 5分鐘，優(yōu)選為5分鐘。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述原料乳前處理方法步驟幻中的所述體積比為 99 101 1，優(yōu)選為 100 1。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述原料乳前處理方法步驟幻中的所述吖啶橙溶 液的濃度為5 5. 5% (重量)，優(yōu)選為5% (重量)。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述原料乳前處理方法步驟幻中的所述染色時間 為7. 5分鐘。本發(fā)明的原料乳前處理方法的應用并不僅限于原料乳中體細胞的計算機識別和 計數(shù)，也可應用于其它液體或飲料中的體細胞識別和計數(shù)。此外，由于原料乳中的體細胞數(shù) 是奶畜乳腺是否發(fā)生炎癥的一個重要指標，本發(fā)明的方法還可以用作奶畜乳房炎的識別和 判斷的參考。發(fā)明的有益效果在上述的對原料乳樣品的前處理中，采用了稀釋、水解、染色的3個連續(xù)和順序實 施的步驟，同時在稀釋倍數(shù)、水解蛋白酶的選擇、水解條件、染色劑選擇、染色條件等方面開 發(fā)了特殊的處理方法，能夠有效去除蛋白質(其中將酪蛋白去除90%以上)，得到了滿足原 料乳中體細胞計算機識別與計數(shù)要求的樣品。與人工顯微鏡檢測方法相比，將圖像的清晰 度提高了 12個灰度級以上，并且將計算機識別與計數(shù)的準確性提高了 55%以上。此外，由 于采用低毒性的吖啶橙，與其他檢測方法相比，使得檢測過程中由于染料揮發(fā)和清洗產(chǎn)生 的環(huán)境污染顯著減少(可減少30%以上)。
具體實施例方式下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1對原料牛乳的前處理1.將10毫升原料牛乳(北京小王莊奶牛場提供)用去離子水進行稀釋，稀釋后的 樣品重量為稀釋前的原料乳重量的2倍；2.將稀釋后的樣品按照每3毫升稀釋后樣品加1毫升枯草桿菌蛋白酶溶液(上海 蓮冠生物化工有限公司生產(chǎn)，濃度為8 9. 5% (重量))的比例，進行5分鐘的水解處理，水解的體系溫度為22°C ；3.使用濃度為5% (重量)的吖啶橙溶液(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司生 產(chǎn))對水解后的樣品進行染色，所述吖啶橙溶液按照水解后樣品體積吖啶橙溶液體積為 100 1的體積比添加；染色時間為7. 5分鐘。得到的樣品滿足了計算機識別與計數(shù)要求，詳見下面的實施例3和表1。實施例2體細胞的人工顯微鏡檢測將與實施例1中同一批次的原料牛乳樣品進行了人工顯微鏡檢測，具體步驟如 下1)配制美蘭染色液在圓底燒瓶中加入5細1乙醇、40ml四氯乙烷，加熱至70°C， 加入1. 2g美蘭，強烈搖動，使之迅速溶解，冷卻后，徐徐加入6ml冰醋酸，然后塞上密封塞， 放于棕色瓶中，貯存于干燥冷暗處備用；2)載玻片的清洗將濃度為4-6% (重量)的鹽酸和濃度為65-75% (重量)的 酒精按照1 4的重量比混和，然后將載玻片置于得到的鹽酸酒精混合液中浸泡2小時，取 出后用蒸餾水沖洗，自然干燥；3)將原料牛乳充分搖勻，用數(shù)字式微量注射器吸取0. Olml奶樣，用清潔的紗布擦 去針尖上粘附的試樣，將奶樣緩緩地注到載玻片上，在面積為Icm2的方格上用大頭針均勻 地涂抹；4)將載玻片水平放置在平整的玻璃板上，自然干燥；取出已干燥好的載玻片，投 入到二甲苯中進行脫脂處理，自然干燥；然后，用滴管吸取濃度為65 70% (重量)的酒 精，在每一個涂布的樣品上滴1 2滴，固定5分鐘；幻取出已固定好的載玻片，將其放在盛有美蘭染色液的染色缸里染色10 15秒， 然后將染色后的涂片放在清水里并水平地移動載玻片以洗掉多余的染色液，然后在自然條 件下干燥；6)顯微鏡下鏡檢計數(shù)；顯微鏡下觀察體細胞被染成深藍色，可以觀察到細胞的形 狀。測得體細胞含量為30-40萬-毫升(見下面的表1)。實施例3對實施例1中得到的樣品進行計算機識別和計數(shù)將按照實施例1中的前處理得到的樣品，采用現(xiàn)有的計算機識別和計數(shù)方法進行 體細胞的計算機識別和計數(shù)首先通過生物顯微鏡G4X 3型生物顯微鏡，上海光學儀器 廠)和圖像裝置(DH-HV2001UC數(shù)碼攝像機，大恒光電技術公司)獲取原料乳中體細胞的數(shù) 字化圖像，然后由計算機將數(shù)字化圖像采集與存儲，再由智能化的圖像識別軟件(WSW智能 圖像處理軟件，VI. 0，華中科技大學人工智能研究所開發(fā))對體細胞圖像進行特征提取，并 且與數(shù)據(jù)庫中的標準特征圖像進行對比分析和統(tǒng)計，據(jù)此檢測出原料乳中的體細胞含量為 41. 5萬/毫升(見下面的表1)。表1.原料乳體細胞的檢測效果比較(人工顯微鏡檢測和經(jīng)前處理后計算機識別 和計數(shù))
權利要求
1.一種原料乳前處理方法，包括如下步驟1)將原料乳按照稀釋后樣品重量稀釋前原料乳重量為1 3 1的重量比用水進行 稀釋；2)用濃度為8 9.5% (重量)的枯草桿菌蛋白酶溶液水解稀釋后的樣品，所述枯草桿 菌蛋白酶溶液按照稀釋后樣品體積枯草桿菌蛋白酶溶液體積為2. 9 3. 1 0. 9 1. 1 的體積比添加；水解溫度為20°C 30°C，水解時間為4 6分鐘；和3)用濃度為5 6%(重量)的吖啶橙溶液將水解后的樣品染色，所述吖啶橙溶液按 照水解后樣品體積吖啶橙溶液體積為98 102 1的體積比添加；染色時間為7 8分 鐘。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述步驟1)中的重量比為2 1。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述步驟幻中的枯草桿菌蛋白酶溶液的濃度為9% (重量)。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述步驟幻中的體積比為3 1。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述步驟2)中的水解溫度為20 22°C。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述步驟幻中的水解時間為5分鐘。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述步驟3)中的體積比為100 1。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述步驟幻中的吖啶橙溶液的濃度為5%(重 量)O
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述步驟幻中的染色時間為7.5分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種原料乳前處理方法，特別是涉及用于原料乳中體細胞的計算機識別和計數(shù)的原料乳前處理方法，包括1)將原料乳按照稀釋后樣品重量稀釋前原料乳重量為1～3∶1的重量比用水進行稀釋；2)用濃度為8～9.5％(重量)的枯草桿菌蛋白酶溶液水解稀釋后的樣品，所述枯草桿菌蛋白酶溶液按照稀釋后樣品體積枯草桿菌蛋白酶溶液體積為2.9～3.1∶0.9～1.1的體積比添加；水解溫度為20℃～30℃，水解時間為4～6分鐘；和3)用濃度為5～6％(重量)的吖啶橙溶液將水解后的樣品染色，所述吖啶橙溶液按照水解后樣品體積吖啶橙溶液體積為98～102∶1的體積比添加；染色時間為7～8分鐘。
文檔編號C12Q1/24GK102071245SQ200910223590
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月24日 優(yōu)先權日2009年11月24日
發(fā)明者劉剛, 趙化平, 趙秀忠 申請人:中國農(nóng)業(yè)機械化科學研究院