專利名稱：一種抗黃曲霉花生種皮rna提取與熒光定量pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗黃曲霉花生種皮RNA提取與熒光定量PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
植物具有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)富含單寧、萜烯、色素、酚等次生代謝物以及 蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子。細(xì)胞破碎后這些物質(zhì)被釋放出來，以不同方式干擾RNA的提 取，如酚類物質(zhì)氧化后可使RNA活性喪失，多糖可形成難溶膠狀物質(zhì)與RNA —起被沉淀等。 另外，在植物細(xì)胞破碎后，植物本身的RNA酶(RNase)以及操作體系中的RNase均會(huì)對(duì)mRNA 進(jìn)行降解，并且RNase極為穩(wěn)定，在實(shí)驗(yàn)操作中很難將它們徹底除去。對(duì)于不同植物、不同 組織或不同生理狀態(tài)下的植物材料其細(xì)胞與組織的成分各不相同，因此，必須針對(duì)不同植 物組織的特點(diǎn)，慎重選擇不同的提取方法，同時(shí)盡量避免上述因素對(duì)RNA提取的影響。
在分子生物學(xué)研究中，從植物組織中提取純度高、完整性好的RNA是進(jìn)行許多分 子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的前提，也是基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)之一，如RT-PCR、RACE、Northern印跡、熒光定量PCR和 構(gòu)建cDNA文庫等實(shí)驗(yàn)成功與否，在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量?；ㄉN皮是花生抵御黃 曲霉侵染的首要屏障，也是克隆抗病基因的重要材料，從花生種皮中提取高質(zhì)量的RNA是 克隆花生種皮中抗病基因的重要前提。以花生種皮為材料提取RNA會(huì)遇到很大的困難?；?生是地上開花地下結(jié)果的植物，花生種皮會(huì)隨著時(shí)間而變得越來越薄，越來越不容易剝?nèi)?且量越來越少，在取樣過程中要保證組織細(xì)胞的RNA完全不降解，有一定的難度；花生種皮 富含多糖、酚類化合物以及一些成分復(fù)雜的次級(jí)代謝產(chǎn)物，更重要的是花生種皮發(fā)育過程 中伴隨著成熟期的臨近，RNA含量越來越少，因此在提取過程中要最大限度地抑制RNase的
活性，并快速去除各種代謝產(chǎn)物，以保證提取樣品的完整性與純度及之后逆轉(zhuǎn)錄的活性等。
研究如何抑制來自材料本身內(nèi)源RNase的同時(shí)，更要注意外源RNase的污染。 目前提取植物總RNA的方法很多，包括強(qiáng)變性劑法、苯酚法、陰離子去污劑法、
LiCL-尿素法、CTAB法、熱硼酸法等。這些方法各有各的優(yōu)點(diǎn)，但由于上述原因，這些方法都
不適合花生種皮RNA的提取。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗黃曲霉花生種皮RNA提取與熒光定量PCR檢測(cè)方法， 它提取的RNA質(zhì)量好，可用于大量提取花生種皮RNA，且可用于熒光定量PCR。
為了解決背景技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案l、于冰上5mL離 心管中加入預(yù)冷lmL(可以多加)裂解液(964iiL裂解液+36iiL巰基乙醇)；2、從液氮中迅 速取出適量(兩到三個(gè)花生的種皮即可)花生種皮在液氮中充分研磨至粉末，倒入O. lg的 粉末至離心管中，充分渦旋使之混勻；3、加入0. lmL 2M NaAc (pH4. 0)混勻，加入lmL水飽和 酚，充分振蕩使之混勻，加入0.4mL的氯仿/異戊醇(49 : 1)劇烈震蕩混勻；4、冰浴10min 后在4°C ， 12000rpm條件下離心15min ;取上水相(千萬不要吸到雜質(zhì))，加入到另外處理好 的離心管中；5、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : l)抽提，充分震蕩混勻。重復(fù)4和5直至蛋白消失；6、冰浴10min后在4°C ， 12000rpm條件下離心15min ;取上水相(千萬 不要吸到雜質(zhì))，加入到另外處理好的離心管中；7、加入1/2體積的10M的LiCL(最終濃度 為2. 5M)和0. 1倍體積異丙醇混勻；-20。C沉淀過夜后4°C， 12000rpm條件下離心20min ;8、 沉淀溶于300 ii LDEPC水(可適量增加)，加入0. 1倍體積5M NaAc (pH5. 2)和1倍體積異 丙醇，-20。C沉淀30min以上后4°C， 12000rpm條件下離心15min (若有沉淀，可繼續(xù)步驟6， LiCL不用再次加)；9、70%乙醇洗滌沉淀2次，每次靜置2min，4。C， 12000rpm條件下離心 5min，室溫晾干5min ;沉淀溶于30 y LDEPC水，分裝后檢測(cè)，-8(TC保存。
本發(fā)明具有以下有益效果提取花生種皮RNA看似過程所需時(shí)間較長(zhǎng)，實(shí)際只需3 個(gè)小時(shí)左右(過夜沉淀不算在內(nèi))，所需試劑用量少，可多個(gè)樣本同時(shí)大量提取。同時(shí)，提取 所用樣品少，兩到三個(gè)花生的種皮即可提取1管經(jīng)電泳檢測(cè)亮度大、濃度高的RNA。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明具體實(shí)施方式
采用以下技術(shù)方案1 、于冰上5mL離心管中加入預(yù)冷lmL (可 以多加)裂解液(964 L裂解液+36 L巰基乙醇)；2、從液氮中迅速取出適量(兩到三個(gè) 花生的種皮即可)花生種皮在液氮中充分研磨至粉末，倒入0. lg的粉末至離心管中，充分 渦旋使之混勻；3、加入0. lmL 2M NaAc (pH4. 0)混勻，加入lmL水飽和酚，充分振蕩使之混 勻，加入0. 4mL的氯仿/異戊醇(49 : 1)劇烈震蕩混勻；4、冰浴lOmin后在4°C ， 12000rpm 條件下離心15min ;取上水相(千萬不要吸到雜質(zhì))，加入到另外處理好的離心管中；5、加 入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : l)抽提，充分震蕩混勻。重復(fù)4和5直至蛋白 消失；6、冰浴10min后在4°C， 12000rpm條件下離心15min ;取上水相(千萬不要吸到雜 質(zhì))，加入到另外處理好的離心管中；7、加入1/2體積的10M的LiCL(最終濃度為2. 5M)和 0. 1倍體積異丙醇混勻；-20。C沉淀過夜后4°C， 12000rpm條件下離心20min ;8、沉淀溶于 300 ii LDEPC水(可適量增加)，加入0. 1倍體積5M NaAc (pH5. 2)和1倍體積異丙醇，_20°C 沉淀30min以上后4°C ， 12000rpm條件下離心15min (若有沉淀，可繼續(xù)步驟6， LiCL不用再 次加)；9、70%乙醇洗滌沉淀2次，每次靜置2min，4。C， 12000rpm條件下離心5min，室溫晾 干5min ;沉淀溶于30 y LDEPC水，分裝后檢測(cè)，-8(TC保存。 本具體實(shí)施方式
提取花生種皮RNA看似過程所需時(shí)間較長(zhǎng)，實(shí)際只需3個(gè)小時(shí)左 右(過夜沉淀不算在內(nèi))，所需試劑用量少，可多個(gè)樣本同時(shí)大量提取。同時(shí)，提取所用樣品 少，兩到三個(gè)花生的種皮即可提取1管經(jīng)電泳檢測(cè)亮度大、濃度高的RNA。
權(quán)利要求
一種抗黃曲霉花生種皮RNA提取與熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于1、于冰上5mL離心管中加入預(yù)冷1mL(可以多加)裂解液(964μL裂解液+36μL巰基乙醇)；2、從液氮中迅速取出適量(兩到三個(gè)花生的種皮即可)花生種皮在液氮中充分研磨至粉末，倒入0.1g的粉末至離心管中，充分渦旋使之混勻；3、加入0.1mL 2MNaAc(pH4.0)混勻，加入1mL水飽和酚，充分振蕩使之混勻，加入0.4mL的氯仿/異戊醇(49∶1)劇烈震蕩混勻；4、冰浴10min后在4℃，12000rpm條件下離心15min；取上水相(千萬不要吸到雜質(zhì))，加入到另外處理好的離心管中；5、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提，充分震蕩混勻。重復(fù)4和5直至蛋白消失；6、冰浴10min后在4℃，12000rpm條件下離心15min；取上水相(千萬不要吸到雜質(zhì))，加入到另外處理好的離心管中；7、加入1/2體積的10M的LiCL(最終濃度為2.5M)和0.1倍體積異丙醇混勻；-20℃沉淀過夜后4℃，12000rpm條件下離心20min；8、沉淀溶于300μLDEPC水(可適量增加)，加入0.1倍體積5MNaAc(pH5.2)和1倍體積異丙醇，-20℃沉淀30min以上后4℃，12000rpm條件下離心15min(若有沉淀，可繼續(xù)步驟6，LiCL不用再次加)；9、70％乙醇洗滌沉淀2次，每次靜置2min，4℃，12000rpm條件下離心5min，室溫晾干5min；沉淀溶于30μLDEPC水，分裝后檢測(cè)，-80℃保存。
全文摘要
一種抗黃曲霉花生種皮RNA提取與熒光定量PCR檢測(cè)方法，它涉及一種抗黃曲霉花生種皮RNA提取與熒光定量PCR檢測(cè)方法。1、裂解液預(yù)冷，離心管置于冰上；2、液氮預(yù)冷研缽后，取花生種皮于研缽中充分研磨至粉末；3、冰浴10min在4℃，12000rpm條件下離心15min后取上水相(千萬不可吸到雜質(zhì))；4、1/2體積的10M的LiCL和0.1倍體積異丙醇混勻-20℃沉淀過夜；提取的RNA質(zhì)量好，可用于大量提取花生種皮RNA，且可用于熒光定量PCR。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101724626SQ20091022372
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者萬書波, 劉宇, 單世華, 張廷婷, 李春娟, 閆彩霞 申請(qǐng)人:山東省花生研究所