專利名稱：編碼甘薯八氫番茄紅素脫氫酶的cDNA序列的制作方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及甘薯(Ipomoea batatas)中表達(dá)的編碼八氫番茄紅素脫氫酶(Ipomoeabatatas phytoene desaturase)的cDNA序列。
背景技術(shù)：
β-胡蘿卜素(β-Carotene)的生物合成主要發(fā)生于高等植物、藻類、真菌和細(xì)菌體內(nèi)，動(dòng)物體內(nèi)不能從頭合成β-胡蘿卜素。β-胡蘿卜素是維生素A(Vitamin A)的前體，在人體內(nèi)可根據(jù)需要轉(zhuǎn)化為維生素A。它具有營養(yǎng)、著色的雙重作用，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)認(rèn)定的A類優(yōu)秀有營養(yǎng)的食品添加劑(foodadditives)。近年來，越來越多的醫(yī)學(xué)研究表明，β-胡蘿卜素可抗多種癌癥，特別是可降低肺癌發(fā)病率。β-胡蘿卜素在淬滅自由基，增強(qiáng)人體免疫力，預(yù)防心血管疾病等保護(hù)人類健康方面起著重要的作用。
天然β-胡蘿卜素順式異構(gòu)體比例高，目前化學(xué)合成法還無法合成β-胡蘿卜素順式異構(gòu)體，而順式異構(gòu)體已被臨床證明其抗癌、抗心血管疾病以及保健功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于全反式異構(gòu)體。
類胡蘿卜素合成是一個(gè)十分龐大的次生代謝途徑，β-胡蘿卜素的合成從牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)開始，依次經(jīng)八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素脫氫酶、ζ-胡蘿卜素脫氫酶和β-胡蘿卜素環(huán)化酶的催化，最終合成β胡蘿卜素，八氫番茄紅素脫氫酶是β胡蘿卜素合成的關(guān)鍵酶之一。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報(bào)道過本專利申請(qǐng)中提及的編碼甘薯八氫番茄紅素脫氫酶的cDNA序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供編碼甘薯八氫番茄紅素脫氫酶的cDNA序列。
在本發(fā)明中，“分離的”cDNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒、粘粒等。在產(chǎn)生本發(fā)明的編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的核苷酸序列時(shí)，可以將編碼甘薯八氫番茄紅素脫氫酶的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成甘薯八氫番茄紅素脫氫酶基因的表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
本發(fā)明的編碼甘薯八氫番茄紅素脫氫酶的cDNA序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
獲得有關(guān)的序列后，用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工化學(xué)合成的方法來合成有關(guān)序列。在本申請(qǐng)之前，現(xiàn)有技術(shù)已完全可以通過先合成多個(gè)多核苷酸小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得編碼本發(fā)明甘薯八氫番茄紅素合成酶的核酸序列。然后，可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。
表2列出了本發(fā)明的編碼甘薯八氫番茄紅素脫氫酶基因與番茄的八氫番茄紅素脫氫酶基因(GenBank Accession No.X59948)序列的同源比較圖。
下面結(jié)合具體步驟，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些步驟僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列步驟中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等《分子克隆》、《實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
步驟1編碼甘薯八氫番茄紅素脫氫酶的cDNA序列的克隆1.組織分離(isolation)紅心甘薯品種金山72來源于福建農(nóng)林大學(xué)作物學(xué)院薯類研究室，在大田種植80天，取幼嫩塊根，用液氮速凍。
2.總RNA的分離(total RNA isolation)和檢測取根部，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Invitrogen，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，電泳圖譜呈現(xiàn)出3條清晰可區(qū)分的條帶，其中28SRNA∶18SRNA比值約為2∶1，表明總RNA基本上未降解，可用于編碼甘薯八氫番茄紅素脫氫酶的cDNA序列的克隆。
3.全長cDNA序列的克隆(Cloning of Full-length cDNA)進(jìn)行全長cDNA序列克隆，分四個(gè)階段進(jìn)行(1)RT-PCR根據(jù)黃水仙、玉米、番茄、胡蘿卜、辣椒的編碼八氫番茄紅素脫氫酶的核酸保守序列，設(shè)計(jì)保守引物，保守序列的正向與反向引物分別為SEQ ID NO.1與SEQ ID NO.2。采用RT-PCR的方法(TaKaRa試劑盒)，得到保守序列pas con(531bp)，連接到T-easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，獲得的保守序列與已知番茄(Lycopersicon esculentum)、辣椒(C.annuum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)的八氫番茄紅素脫氫酶基因的同源性均為86％，初步認(rèn)為它是一個(gè)編碼甘薯八氫番茄紅素脫氫酶cDNA的一個(gè)片段。
(2)3’-RACE反轉(zhuǎn)錄總RNA，得到第一鏈cDNA。
第一輪PCR(引物為GR3(SEQ ID NO.9)+SEQ ID NO.3)第二輪PCR(GR3N(SEQ ID NO.10)+SEQ ID NO.4)得到pds3(1060bp)其它過程如同(1)所示。
測序結(jié)果已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)搜索，得到其核酸序列與已知番茄(Lycopersiconesculentum)和辣椒(C.annuum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)的八氫番茄紅素脫氫酶基因的同源性分別為86％、86％、84％，故可進(jìn)一步確認(rèn)它是一個(gè)八氫番茄紅素脫氫酶cDNA的片段。
(3)5’-RACE第一輪PCR GR5(SEQ ID NO.11)+SEQ ID NO.5第二輪PCR GR5N(SEQ ID NO.12)得到pds5(610bp)其它過程如同(1)所示。
(4)PCR擴(kuò)增甘薯八氫番茄紅素脫氫酶cDNA的編碼區(qū)通過組合使用上述方法，拼接候選的編碼甘薯八氫番茄紅素脫氫酶的全長cDNA序列，在獲得該序列(至少包含完整的開放讀框)信息的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)正向引物pdsF(SEQ ID NO.7)和反向引物pdsR(SEQ ID NO.8)，以總RNA經(jīng)Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄為模板，用高保真的Pyrobest酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94℃ 5min，隨之以94℃ 30sec、60℃ 30sec和72℃ 2min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸10min。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長度為1,845bp。
因此，組合上述4種方法得到的結(jié)果，獲得了編碼甘薯八氫番茄紅素脫氫酶的全長cDNA序列(表1)。
BLAST的結(jié)果證明從甘薯中新得到的基因確為八氫番茄紅素脫氫酶cDNA。由于已知的八氫番茄紅素脫氫酶能夠催化八氫番茄紅素形成六氫番茄紅素和ζ-胡蘿卜素，故推測該cDNA具有相同的功能。
步驟2甘薯八氫番茄紅素脫氫酶cDNA的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的甘薯八氫番茄紅素脫氫酶基因全長cDNA的長度為2,181bp，開放讀框位于184-1969位核苷酸，詳細(xì)序列見表1。將甘薯八氫番茄紅素脫氫酶基因的全長cDNA序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸同源性檢索，結(jié)果薯八氫番茄紅素合成酶cDNA與辣椒(Capsicum annuum)的八氫番茄紅素合成酶cDNA(GenBankAccession No.X68017)的在核苷酸水平上有76％的相同性，可以認(rèn)為兩者在功能上有很高相似性。
步驟3甘薯八氫番茄紅素脫氫酶cDNA的功能分析在該步驟中，將編碼甘薯八氫番茄紅素脫氫酶的cDNA序列構(gòu)建入植物表達(dá)載體之中，并轉(zhuǎn)化煙草，以鑒定其功能。
1.植物表達(dá)載體的構(gòu)建依據(jù)甘薯八氫番茄紅素脫氫酶全長cDNA序列(表1)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整閱讀框的引物，分別在正反引物上引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)正反引物分別引入SmaI和SacI酶切位點(diǎn)。以步驟1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，保證甘薯八氫番茄紅素酶的閱讀框完全正確。分別用內(nèi)切酶SmaI和SacI進(jìn)行37℃酶切3h，回收目的片段1,845bp；載體p2300用SmaI和Sacl內(nèi)切酶37℃酶切3h，分別回收目的片段。將經(jīng)酶切的甘薯八氫番茄紅素脫氫酶cDNA的目的片段與經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶切過的p2300載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，37℃培養(yǎng)20h，進(jìn)行重組子的PCR鑒定和酶切鑒定。
2.植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(1)取一份感受態(tài)農(nóng)桿菌EHA105，加入含甘薯八氫番茄紅素脫氫酶cDNA的植物表達(dá)載體約1μg，輕輕混勻；(2)于液氮中速凍2分鐘，37℃溫育5分鐘；(3)加入500μl YEB液體培養(yǎng)基，28℃輕搖2-4小時(shí)，消除感受態(tài)；(4)分別取50-200μl菌液，分別涂布于含適當(dāng)抗生素的YEB選擇平板上，28℃倒置培養(yǎng)兩天。
(5)鑒定呈陽性的農(nóng)桿菌EHA105單菌落，接種到含50mg/L利福平，100mg/L卡那霉素的20ml液體YEB培養(yǎng)基中，于28℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)30個(gè)小時(shí)至對(duì)數(shù)生長期，取適量農(nóng)桿菌用液體MS培養(yǎng)基稀釋20-30倍。
3.煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及再生(1)取無菌煙草葉片，切除葉片邊緣與中脈，于Ms+1.0mg/L NAA固體培養(yǎng)基中28℃預(yù)培養(yǎng)2天；(2)重新取出材料，放入無菌MS液體培養(yǎng)基稀釋過的帶有目的基因的農(nóng)桿菌中，浸泡15分鐘，然后在有28℃搖床中低速搖15分鐘；(3)取出小葉片，用無菌濾紙吸去多余菌液，于MS固體培養(yǎng)基中28℃暗培養(yǎng)兩天；(4)把小葉片，用加500mg/L Cb的無菌水洗兩次，無菌濾紙吸去多余菌液后，轉(zhuǎn)入含100mg/LKm和500mg/L Cb分化培養(yǎng)基M1中，28℃光下培養(yǎng)至分化出愈傷組織，直至長出芽，其間每15天繼代一次；(5)將長至3-5cm的芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基1/2Ms上誘導(dǎo)生根。
(6)經(jīng)鑒定為陽性轉(zhuǎn)基因煙草后，繼續(xù)培養(yǎng)成苗。
4.轉(zhuǎn)基因煙草葉片類胡蘿卜素的提取
(1)取各轉(zhuǎn)基因煙草葉片，迅速冷凍干燥，制成凍干粉，置真空干燥箱中避光保存，并盡快測定。
(2)準(zhǔn)確稱取凍干粉1.000g于具塞三角瓶中，加入提取液(丙酮∶乙醇＝3∶2)45mL，搖勻，蓋上瓶塞，用超聲波提取20分鐘，過濾于50mL容量瓶中并定容。取20mL濾液置分液漏斗中，加入10mL石油醚混勻，加入10mL蒸餾水進(jìn)行分配，取石油醚相置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，剩余水加入10mL石油醚進(jìn)行再分配，合并2次石油醚相置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，40-45℃蒸干，用2.0mL異丙醇溶解，過濾后上機(jī)測定。
5.高效液相色譜法測定轉(zhuǎn)基因煙草葉片類胡蘿卜素(1)β-胡蘿卜素標(biāo)樣的制備β-胡蘿卜素標(biāo)淮品(Sigma公司產(chǎn)品)1.0mg，用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解，溶液轉(zhuǎn)入25.0ml容量瓶中，用石油醚定容，濃度為0.04mg/ml，冰箱保存。臨用時(shí)，吸取1.0ml于10.0ml容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，此時(shí)濃度為0.004mg/ml。
(2)番茄紅素標(biāo)樣的制備番茄紅素標(biāo)淮品(Sigma公司產(chǎn)品)1.0mg，用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解，溶液轉(zhuǎn)入25.0ml容量瓶中，用石油醚定容，濃度為0.04mg/ml，冰箱保存。臨用時(shí)，吸取1.0ml于10.0ml容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，此時(shí)濃度為0.004mg/ml。
(3)測定方法流動(dòng)相乙腈∶三氯甲烷(92∶8)。檢測波長雙波長測定，470nm(0-min)和450nm(8-13min)。流速1.0mL/min。柱溫35℃。觀測樣品在470nm與450nm處有吸收峰的大小變化。
本發(fā)明涉及的記號(hào)及序列分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.1GGTGGAAAGGTAGCTGCT/aTGGAA(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.2GGCATGCAA/tAGT/cCTC/tTCAGG(3)SEQ ID NO.3的信息
(i)序列特征(A)長度22bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3CCGGATGAACTTTCGATGCAGT(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度22bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.4ACGGAAATCCGCCTGAGAGACT(5)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.5AGTCTCGTACCAGTCTCCGTCAT(6)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度25bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.6ACCCAGCACATATCTCGTGCCTCCA(7)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長度28bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.7TCCCCCGGGTGTGTGAGCAATGTTGAAT(8)SEQ ID NO.8的信息
(i)序列特征(A)長度25bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.8CGAGCTCGCGATTCTAGTGCACATT(9)SEQ ID NO.9的信息(i)序列特征(A)長度25bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.9GCTGTCAACGAIACGCTACGTAACG(10)SEQ ID NO.10的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.10CGCTACGTAACGGCATGACAGTG(11)SEQ ID NO.11的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.11CGACTGGAGCACGAGGACACTGA(12)SEQ ID NO.12的信息(i)序列特征(A)長度26bp(B)類型核苷酸
(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.12GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA
表1甘薯八氫番茄紅素脫氫酶全長cDNA序列表<110>福建農(nóng)林大學(xué)<120>甘薯八氫番茄紅素脫氫酶全長cDNA序列表<160>1<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>2181<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<221>gene<222>(1)…(2181)<400>Full length sequence of phytoene desaturase gene from Ipomoea batatas1CGAAAAAAAA TTTGACAACG ATTAGCTTCA ATTCAAATAT CCCATATGCA GTTTATAGAA61 AATTTTCCCC TGCTGTTCTT TCCCTCAAAA AGGATTAGTG GTGTGTGAGC AATGTTGAAT121 TGATACTCTT GAAGAATTAT AGTTTCCCAA AGTGATCGCG TTTTCAGTAT AGGATTTGGC181 AAAATGTCCC ACATTGGACA TGTTTCTGCT GTTAGCTTGC CGTCTTCCTC TAGAGTTGGT241 TGTCGTGTTG GTTCAGCAGA AGTAAATGCG CTATCATTTG GATCGAGCTA CTCAATGGGC301 TCTAAATTGA GGATTCCTAC TAGCAATGGT GTTATGCCCA AATTAGGGAG GGGGTACCGT361 CCTTTGAAGG TCGTTTGCAT GGACTATCCG AGGCCAGAAC TTGAGAATAC TGTTAACTAT421 ATCGAAGCTG CTTACCTGTC CTCTTCATTT CGTTCTGCTC CGCGTCCAAG TAAACCATTG481 GAAGTTGTTA TTGCTGGTGC CGGTTTGGCT GGGTTGTCTA CTGCAAAATA TTTAGCAGAT541 GCGGGCCACA AACCAATACT GCTGGAGGCA CGAGATGTGC TGGGAGGAAA GGTAGCTGCA601 TGGAAAGATG ATGACGGGGA CTGGTATGAG ACTGGCTTAC ACATATTCTT TGGGGCATAC661 CCGAATATAC AGAACCTGTT TGGAGAACTA GGCATCAATG ATCGCTTGCA GTGGAAGGAA721 CATTCTATGA TATTTGCAAT GCCAAACAAA CCAGGAGAGT TCAGCCGATT TGATTTCCCT781 GAAGTTTTAC CATCTCCATT TAACGGGGTG TGGGCCATCC TAAGGAATAA TGAGATGCTT841 ACGTGGCCGG AGAAAGTGAA GTTTGCTATT GGTCTGTTGC CAGCAATGCT TGGTGGACAG901 TCTTATGTTG AAGCTCAAGA TGGGATATCT GTTAAGGACT GGATGAGAAA GCAGGGTATA961 CCAGACAGGG TGACTGATGA GGTGTTCATT GCCATGTCAA AGGCTCTGAA TTTCATTAAT1021 CCGGATGAAC TTTCGATGCA GTGCATATTG ATTGCTTTGA ACAGATCTCT TCAGGAGAAA1081 CATGGTTCAA AAATGGCCTT TTTAGACGGA AATCCGCCAG AAAGGCTTTG CTTGCCGATT1141 GTTGAACATA TCAAGTCACG AGGCGGTAAA GTCAAACTTA ACTCACGTAT AAATAAAATT1201 GAGCTGAATG AAGATGGAAG TGTCAAGAGT TTTCTTCTAA GTAATGGAAC TGTTATTAAA
1261 GGAGATGCTT TTGTGTTCGC TGGGCCTGTT GATATCCTGA AGCTTCTTTT GCCCGAGGAC1321 TGGAAAGAGA TCCCATATTT CAAAAAGCTG GAGAAATTAG TTGGAGTTCC CGTAATAAAT1381 GTTCATATAT GGTTTGACAG AAAACTGAAG AACACATACG ATCATCTCCT CTTTAGCAGA1441 AGCTCACTTC TGAGTGTGTA TGCTGACATG TCGGTAACAT GCAAGGAATA TTACAACCCC1501 AATCAGTCTA TGTTGGAGTT GGTGTTCGCG CCTGCAGAAG AATGGGTGTC AAAAAGCGAC1561 TCAGAAATTA TAGAAGCTAC GATGAAGGAA CTAGCCAAAT TGTTTCCCGA CGAAATTTCT1621 GCTGATCAGA GCAAAGCAAA AATACTGAAG TACCATGTTG TCAAAACTCC AAGGTCTGTG1681 TACAAAACCG TGCCAGGATG TGAGCCATGT CGCCCCTTGC AAAAATCCCC CATAGACGGA1741 TTCTATTTAG CAGGCGACTA CACGAAACAG AAGTACTTGG CTTCAATGGA AGGCGCTGTT1801 CTATCCGGGA AGCTTTGTGC ACAGGCGATT TTAAAGGATT ACGAGTCACT CCTCGCTCGA1861 CAGCAGAAAA TGCTGGCCGA GGCAAGCGCA AACATCAGTT GAAAACGAAC TTAACCTGTT1921 CTAATGTGCA CTAGAATCGC GAGGTCGTTG AACCAAGTTA TTTAGGTAGA TTGTGTACAG1981 TACTGCATAT ACCAAGAACA CACCAAAATT GAGAAGAAGA TGCAATGTGT AACCTGGTAA2041 AAGGACAAGC TAGGAAACAT CTGAATTCAT GTAAAGCTGA TATACCATGT TTGTTGATGC2101 TGTTAAGAAT TTTGAAGGTC CATAGCCTTC TTTACTAAGT AGCAATCCAG CCTGTTTACA2161 TCTGTTTTAG CAAAAAAAAA A
表2 Percent Identity70％in nt overlap1CTTTTACTAGTTATAGCATTCGGTATCTTTTTCTGGGTAACTGCCAAACCACCACAAATT61 ACAAGTTTCCATTTAACTCTTCAACTTCAACCCAACCAAATTTATTTCCTTAATTGTGCA121 GAACCACTCCCTATATCTTCTAGGTGCTTTCATTCGTTCCGAGGTAAGAAAAGATTTTTG181 TTTCTTTGAATGCTTTATGCCACTCGTTTAACTTCTGAGGTTTGTGGATCTTTTAGGCGA1..............CGAAAAAAAATTTGACAACGATTAGCTTCAATTCAAATATCCCATA| |||||||| | ||||| |||| |241 CTTTTTTTTTTTTTGTATGTAAAATTTGTTTCATAAATGCTTC...TCAACATAAATCTT47 TGCAGTTTATAGAAAATTTTCCCCTGCTGTTCTTTCCCTCAAAAAGGATTAGTGGTGTGT|| || || ||| || | | |||| | ||| |||298 GACAAAGAGAAGGAATTTTACCAAGTATTTAGGTTCAGAAATGGATAATTTTCTTACTGT107 GAGCAATGTTGAATTGATACTCTTGAAGAATTATAGTTTCC.......CAAAGTGATCGC|| || | || | | ||| || |||| || |358 GAAATATCCTTATGGCAGGTTTTACTGTTATTTTTCAGTAAAATGCCTCAAATTGGACTT160 GTTTTCAGTATAGGATTTGGCAAAATGTCCCACATTGGACATGTTTCTGCTGTTAGCTTG||||| ||| || || ||||| |418 GTTTCTGCTGTTAACTTGAGAGTCCAAGGTAGTTCAGCTTATCTTTGGAGCTCGAGGT..
220 CCGTCTTCCTCTAGAGTTGGTTGTCGTGTTGGTTCAGCAGAAGTAAATGCGCTATCATTT||||||| | || || |||| | ||||| || ||| || ||| |||476 .CGTCTTCTTTGGGAACTGAAAGTCGAGATGGTTGCTTGCAAAGGAATTCGTTATGTTTT280 GGATCGAGCTACTCAATGGGCTCTAAATTGAGGATTCCTACTAGCAATGGTGTTATGCCC| ||| | |||||||| |||| || ||||| |||| | ||| |535 GCTGGTAGCGAATCAATGGGTCATAAGTTAAAGATTCGTACTCCCCATGCCACGACCAGA340 AAATTAGGGAGGGGGTACCGTCCTTTGAAGGTCGTTTGCATGGACTATCCGAGGCCAGAA| ||| | | || | | ||||| |||||||| ||||| || ||||| || |||||595 AGATTGGTTAAGGACTTGGGGCCTTTAAAGGTCGTATGCATTGATTATCCAAGACCAGAG400 CTTGAGAATACTGTTAACTATATCGAAGCTGCTTACCTGTCCTCTTCATTTCGTTCTGCT|| || ||||| ||||||||| | || ||||| | | || || | || ||| || ||655 CTGGACAATACAGTTAACTATTTGGAGGCTGCATTTTTATCATCAACGTTCCGTGCTTCT460 CCGCGTCCAAGTAAACCATTGGAAGTTGTTATTGCTGGTGCCGGTTTGGCTGGGTTGTCT||||| |||| |||||||||||| |||||||||||||||| ||||||| ||| ||||||715 CCGCGCCCAACTAAACCATTGGAGATTGTTATTGCTGGTGCAGGTTTGGGTGGTTTGTCT
520 ACTGCAAAATATTTAGCAGATGCGGGCCAGAAACCAATACTGCTGGAGGCACGAGATGTG|| ||||||||||| |||||||| || |||||||| ||||||||||||||| | |||||775 ACAGCAAAATATTTGGCAGATGCTGGTCACAAACCGATACTGCTGGAGGCAAGGGATGTT580 CTGGGAGGAAAGGTAGCTGCATGGAAAGATGATGACGGGGACTGGTATGAGACTGGCTTA|| || |||||||||||||||||||||||||||| || || ||||| |||||||| ||835 CTAGGTGGAAAGGTAGCTGCATGGAAAGATGATGATGGAGATTGGTACGAGACTGGTTTG640 CACATATTCTTTGGGGCATACCCGAATATACAGAACCTGTTTGGAGAACTAGGCATCAAT|| |||||||||||||| ||||| ||||| |||||||||||||||||| |||| || ||895 CATATATTCTTTGGGGCTTACCCAAATATTCAGAACCTGTTTGGAGAATTAGGGATTAAC700 GATCGCTTGCAGTGGAAGGAACATTCTATGATATTTGCAATGCCAAACAAACCAGGAGAG||||| ||||| |||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||| ||||||||955 GATCGATTGCAATGGAAGGAACATTCAATGATATTTGCAATGCCAAGCAAGCCAGGAGAA760 TTCAGCCGATTTGATTTCCCTGAAGTTTTACCATCTCCATTTAACGGGGTGTGGGCCATC|||||||| ||||||||| | |||| |||||| |||| || || || | | ||||||1015 TTCAGCCGCTTTGATTTCTCCGAAGCTTTACCCGCTCCTTTAAATGGAATTTTAGCCATC820 CTAAGGAATAATGAGATGCTTACGTGGCCGGAGAAAGTGAAGTTTGCTATTGGTCTGTTG||| |||||| || |||||||| ||||| |||||||| || ||||| ||||| || |||1075 TTAAAGAATAACGAAATGCTTACATGGCCAGAGAAAGTCAAATTTGCAATTGGACTCTTG880 CCAGCAATGCTTGGTGGACAGTCTTATGTTGAAGCTCAAGATGGGATATCTGTTAAGGAC|||||||||||||| || || ||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||1135 CCAGCAATGCTTGGAGGGCAATCTTATGTTGAAGCTCAAGATGGGATAAGTGTTAAGGAC940 TGGATGAGAAAGCAGGGTATACCAGACAGGGTGACTGATGAGGTGTTCATTGCCATGTCA|||||||||||||| ||| | || ||||||||||| ||||||||||||||||| ||||||1195 TGGATGAGAAAGCAAGGTGTGCCGGACAGGGTGACAGATGAGGTGTTCATTGCTATGTCA1000 AAGGCTCTGAATTTCATTAATCCGGATGAACTTTCGATGCAGTGCATATTGATTGCTTTG||||| || || || || || || || |||||||| ||||||||||| ||||| || |||1255 AAGGCACTCAACTTTATAAACCCTGACGAACTTTCAATGCAGTGCATTTTGATCGCATTG1060 AACAGATCTCTTCAGGAGAAACATGGTTCAAAAATGGCCTTTTTAGACGGAAATCCGCCA||||| | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || ||||| ||1315 AACAGGTTTCTTCAGGAGAAACATGGTTCAAAAATGGCCTTTTTAGATGGTAATCCTCCT1120 GAAAGGCTTTGCTTGCCGATTGTTGAACATATCAAGTCACGAGGCGGTAAAGTCAAACTT|| || |||||| |||||||||||||||| || ||||| ||| || |||||| |||1375 GAGAGACTTTGCATGCCGATTGTTGAACACATTGAGTCAAAAGGTGGCCAAGTCAGACTG1180 AACTCACGTATAAATAAAATTGAGCTGAATGAAGATGGAAGTGTCAAGAGTTTTCTTCTA|||||||| ||||| || |||||||||||||| ||||||||||||||||||||| | ||
1435 AACTCACGAATAAAAAAGATTGAGCTGAATGAGGATGGAAGTGTCAAGAGTTTTATACTG1240 AGTAATGGAACTGTTATTAAAGGAGATGCTTTTGTGTTCGCTGGGCCTGTTGATATCCTG||| | || | || || | |||||||||||||||| || | || || ||||| |1495 AGTGACGGTAGTGCAATCGAGGGAGATGCTTTTGTGTTTGCCGCTCCAGTGGATATTTTC1300 AAGCTTCTTTTGCCCGAGGACTGGAAAGAGATCCCATATTTCAAAAAGCTGGAGAAATTA|||||||| ||||| || |||||||||||||| ||||||||| ||||| ||||||| |||1555 AAGCTTCTATTGCCTGAAGACTGGAAAGAGATTCCATATTTCCAAAAGTTGGAGAAGTTA1360 GTTGGAGTTCCCGTAATAAATGTTCATATATGGTTTGACAGAAAACTGAAGAACACATAC|| ||||| || || |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||1615 GTCGGAGTACCTGTGATAAATGTACATATATGGTTTGACAGAAAACTGAAGAACACATAT1420 GATCATCTCCTCTTTAGCAGAAGCTCACTTCTGAGTGTGTATGCTGACATGTCGGTAACA|||||| | ||||| |||||||||||||| || |||||||||||||||||||| || |||1675 GATCATTTGCTCTTCAGCAGAAGCTCACTGCTCAGTGTGTATGCTGACATGTCTGTTACA1480 TGCAAGGAATATTACAACCCCAATCAGTCTATGTTGGAGTTGGTGTTCGCGCCTGCAGAA|| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| || || |||||||||1735 TGTAAGGAATATTACAACCCCAATCAGTCTATGTTGGAATTGGTTTTTGCACCTGCAGAA1540 GAATGGGTGTCAAAAAGCGACTCAGAAATTATAGAAGCTACGATGAAGGAACTAGCCAAA|| ||| | ||||||||||||||||||| || || ||||||||||||||||| |1795 GAGTGGATATCTCGCAGCGACTCAGAAATTATTGATGCAACGATGAAGGAACTAGCAACG1600 TTGTTTCCCGACGAAATTTCTGCTGATCAGAGCAAAGCAAAAATACTGAAGTACCATGTT| ||||| || |||||||| || ||||| |||||||||||||| |||||||||||||||1855 CTTTTTCCTGATGAAATTTCAGCAGATCAAAGCAAAGCAAAAATATTGAAGTACCATGTT1660 GTCAAAACTCCAAGGTCTGTGTACAAAACCGTGCCAGGATGTGAGCCATGTCGCCCCTTG||||||||||| |||||||| || ||||| |||||||| || || || ||||| || ||1915 GTCAAAACTCCGAGGTCTGTTTATAAAACTGTGCCAGGTTGTGAACCCTGTCGGCCTTTA1720 CAAAAATCCCCCATAGACGGATTCTATTTAGCAGGCGACTACACGAAACAGAAGTACTTG|||| |||||| ||||| || || |||||||| || ||||||||||||||||| ||||||1975 CAAAGATCCCCAATAGAGGGGTTTTATTTAGCCGGTGACTACACGAAACAGAAATACTTG1780 GCTTCAATGGAAGGCGCTGTTCTATCCGGGAAGCTTTGTGCACAGGCGATTTTAAAGGAT|||||||||||||||||||| |||| || ||||||||||| || || ||| || |||||2035 GCTTCAATGGAAGGCGCTGTCTTATCAGGAAAGCTTTGTGCTCAAGCTATTGTACAGGAT1840 TACGAGTCACTCCTCGCTCGACAGCAGAAAATGCTGGCCGAGGCAAGCGCAAACATCAGT|| |||| ||| | | |||| || | | || | || ||||||| ||2095 TATGAGTTACTTGTTGGACGTAGCCAAAAGAAGTTGTCGGAAGCAAGCGTAGTTTAGCTT
1900 TGAAAACGAACTTAACCTGTTCTAATGTGCACTAGAATCGCGAGGTCGTTGAACCAAGTT|| || | || | || | | | || || |||2155 TGTGGTTATTATTTAGCTTCTGTACACTAAATTTATGATGCAAGAAGCGTTGTACACAAC1960 ATTTAGGTAGATTGTGTACAGTACTGCATATACCAAGAACACACCAAAATTGAGAAGAAG|| |||| ||||| ||| || | || ||| | |2215 ATATAGAAGAAGAGTGCGAGGTGAAGCAAGTAGGAGAAATGTTAGGAAAGCTCCTATACA2020 ATGCAATGTGTAACCTGGTAAAAGGACAAGCTAGGAAACATCTGAATTCATGTAAAGCTG||||2275 AAAGGATGGCATG...............................................
2080 ATATACCATGTTTGTTGATGCTGTTAAGAATTTTGAAGGTCCATAGCCTTCTTTACT...
|||||| | |||| | |||2288 ................................TTGAAGAT...TAGCATCTTTTTAATCC2137 .AAGTAGCAATCCAGCCTGTTTACATCTGTTTTAGCAAAAAAAAAA||||||| | | | | ||2313 CAAGTTTAAATATAAAGCATATTTTATGGAATTC上列甘薯八氫番茄紅素脫氫酶的cDNA序列下列番茄八氫番茄紅素脫氫酶的核酸序列(GenBank Accession No.X59948)
權(quán)利要求
1.編碼甘薯八氫番茄紅素脫氫酶的cDNA序列，其特征是從紅心甘薯塊根分離克隆而得，其全長cDNA核苷酸序列的長度為2,181bp，其中開放閱讀框位于184-1868位核苷酸，具體如下1 CGAAAAAAAA TTTGACAACG ATTAGCTTCA ATTCAAATAT CCCATATGCA GTTTATAGAA61AATTTTCCCC TGCTGTTCTT TCCCTCAAAA AGGATTAGTG GTGTGTGAGC AATGTTGAAT121 TGATACTCTT GAAGAATTAT AGTTTCCCAA AGTGATCGCG TTTTCAGTAT AGGATTTGGC181 AAAATGTCCC ACATTGGACA TGTTTCTGCT GTTAGCTTGC CGTCTTCCTC TAGAGTTGGT241 TGTCGTGTTG GTTCAGCAGA AGTAAATGCG CTATCATTTG GATCGAGCTA CTCAATGGGC301 TCTAAATTGA GGATTCCTAC TAGCAATGGT GTTATGCCCA AATTAGGGAG GGGGTACCGT361 CCTTTGAAGG TCGTTTGCAT GGACTATCCG AGGCCAGAAC TTGAGAATAC TGTTAACTAT421 ATCGAAGCTG CTTACCTGTC CTCTTCATTT CGTTCTGCTC CGCGTCCAAG TAAACCATTG481 GAAGTTGTTA TTGCTGGTGC CGGTTTGGCT GGGTTGTCTA CTGCAAAATA TTTAGCAGAT541 GCGGGCCACA AACCAATACT GCTGGAGGCA CGAGATGTGC TGGGAGGAAA GGTAGCTGCA601 TGGAAAGATG ATGACGGGGA CTGGTATGAG ACTGGCTTAC ACATATTCTT TGGGGCATAC661 CCGAATATAC AGAACCTGTT TGGAGAACTA GGCATCAATG ATCGCTTGCA GTGGAAGGAA721 CATTCTATGA TATTTGCAAT GCCAAACAAA CCAGGAGAGT TCAGCCGATT TGATTTCCCT781 GAAGTTTTAC CATCTCCATT TAACGGGGTG TGGGCCATCC TAAGGAATAA TGAGATGCTT841 ACGTGGCCGG AGAAAGTGAA GTTTGCTATT GGTCTGTTGC CAGCAATGCT TGGTGGACAG901 TCTTATGTTG AAGCTCAAGA TGGGATATCT GTTAAGGACT GGATGAGAAA GCAGGGTATA961 CCAGACAGGG TGACTGATGA GGTGTTCATT GCCATGTCAA AGGCTCTGAA TTTCATTAAT1021 CCGGATGAAC TTTCGATGCA GTGCATATTG ATTGCTTTGA ACAGATCTCT TCAGGAGAAA1081 CATGGTTCAA AAATGGCCTT TTTAGACGGA AATCCGCCAG AAAGGCTTTG CTTGCCGATT1141 GTTGAACATA TCAAGTCACG AGGCGGTAAA GTCAAACTTA ACTCACGTAT AAATAAAATT1201 GAGCTGAATG AAGATGGAAG TGTCAAGAGT TTTCTTCTAA GTAATGGAAC TGTTATTAAA1261 GGAGATGCTT TTGTGTTCGC TGGGCCTGTT GATATCCTGA AGCTTCTTTT GCCCGAGGAC1321 TGGAAAGAGA TCCCATATTT CAAAAAGCTG GAGAAATTAG TTGGAGTTCC CGTAATAAAT1381 GTTCATATAT GGTTTGACAG AAAACTGAAG AACACATACG ATCATCTCCT CTTTAGCAGA1441 AGCTCACTTC TGAGTGTGTA TGCTGACATG TCGGTAACAT GCAAGGAATA TTACAACCCC1501 AATCAGTCTA TGTTGGAGTT GGTGTTCGCG CCTGCAGAAG AATGGGTGTC AAAAAGCGAC1561 TCAGAAATTA TAGAAGCTAC GATGAAGGAA CTAGCCAAAT TGTTTCCCGA CGAAATTTCT1621 GCTGATCAGA GCAAAGCAAA AATACTGAAG TACCATGTTG TCAAAACTCC AAGGTCTGTG1681 TACAAAACCG TGCCAGGATG TGAGCCATGT CGCCCCTTGC AAAAATCCCC CATAGACGGA1741 TTCTATTTAG CAGGCGACTA CACGAAACAG AAGTACTTGG CTTCAATGGA AGGCGCTGTT1801 CTATCCGGGA AGCTTTGTGC ACAGGCGATT TTAAAGGATT ACGAGTCACT CCTCGCTCGA1861 CAGCAGAAAA TGCTGGCCGA GGCAAGCGCA AACATCAGTT GAAAACGAAC TTAACCTGTT1921 CTAATGTGCA CTAGAATCGC GAGGTCGTTG AACCAAGTTA TTTAGGTAGA TTGTGTACAG1981 TACTGCATAT ACCAAGAACA CACCAAAATT GAGAAGAAGA TGCAATGTGT AACCTGGTAA2041 AAGGACAAGC TAGGAAACAT CTGAATTCAT GTAAAGCTGA TATACCATGT TTGTTGATGC2101 TGTTAAGAAT TTTGAAGGTC CATAGCCTTC TTTACTAAGT AGCAATCCAG CCTGTTTACA2161 TCTGTTTTAG CAAAAAAAAA A
全文摘要
本發(fā)明提供了編碼甘薯八氫番茄紅素脫氫酶的cDNA序列，從紅心甘薯塊根分離克隆而得，其全長cDNA的長度為2,181bp，開放閱讀框1,685bp，詳細(xì)序列如表1，八氫番茄紅素脫氫酶催化八氫番茄紅素脫氫，依次形成六氫番茄紅素和ζ－胡蘿卜素，是甘薯β－胡蘿卜素合成的關(guān)鍵酶，因此該cDNA序列有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/53GK1757735SQ200510080849
公開日2006年4月12日 申請(qǐng)日期2005年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月27日
發(fā)明者鄭金貴, 陳選陽, 劉峰, 許明, 黃志偉 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)