專利名稱：一種提高微藻生物量及其生理活性產(chǎn)物產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用超聲波處理提高微藻生物量及其生理活性產(chǎn)物產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
超聲波在物質(zhì)介質(zhì)中的相互作用機(jī)制可分為加熱作用、空化作用及機(jī)械傳質(zhì)作用，其作用的強(qiáng)弱與超聲波的頻率和強(qiáng)度有關(guān)。低強(qiáng)度超聲波依靠機(jī)械振動(dòng)和穩(wěn)態(tài)空化效應(yīng)使傳質(zhì)邊界層減薄，溶質(zhì)粒子運(yùn)動(dòng)加速，提高生物反應(yīng)速度；適宜的低強(qiáng)度超聲波作用于動(dòng)植物細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生胞內(nèi)微流、胞內(nèi)物質(zhì)的旋轉(zhuǎn)及渦流運(yùn)動(dòng)，提高細(xì)胞膜和細(xì)胞壁穿透性，這些效應(yīng)可以提高細(xì)胞的新陳代謝功能。低頻率、低功率的超聲波處理，可在細(xì)胞表面造成微傷，使細(xì)胞壁局部破裂，從而改變細(xì)胞質(zhì)膜的通透性，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放或使胞外物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)(ChistiY等，Trends Biotechnol，2003；王武等，無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2002)。用超聲波處理生產(chǎn)ATP的啤酒酵母后，細(xì)胞膜的通透性比其他方法處理得更高(段學(xué)輝等，華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2000)。廢紙發(fā)酵生產(chǎn)酒精過程中，用超聲處理可使酒精產(chǎn)量提高近20％。青霉素發(fā)酵過程經(jīng)超聲波處理，青霉素產(chǎn)量可提高10％以上(王武等，無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2002)。超聲波用于提高污泥厭氧消化處理效果(Hogan F等，Water Sci Technol，2004)，用超聲波輔助的方法提高污水污泥消化中可溶性化合物的氧需求(Gronroos A等，Ultrason Sonochem，2005)。超聲波強(qiáng)度和反應(yīng)器規(guī)模對(duì)連續(xù)光照攪拌罐中各種廢紙的酶糖化作用動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生影響(Li C等，Ultrason Sonochem，2005)。超聲波用于微藻代謝產(chǎn)物的代謝調(diào)控方面的報(bào)道少見，它對(duì)湛江等鞭金藻的生物學(xué)效應(yīng)顯著，使藻生長(zhǎng)速率常數(shù)、脂肪酸不飽和度提高(李文權(quán)等，海洋學(xué)報(bào)，2002)。用于控制富營(yíng)養(yǎng)化湖水的藍(lán)藻水華(Lee TJ等，Water Sci Technol，200；Ahn CY等，Environ Sci Technol，2003)，用于分裂螺旋藻細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模快速和選擇性的提取藻藍(lán)蛋白(Furuki T等，J Appl Phycol，2003)，生物凈化水質(zhì)(Mason TJ等，Ultrason Sonochem，2003)，收獲微藻(BosmaR等，J Appl Phycol，2003)。高頻率(1.7MHz)、低強(qiáng)度(0.6Wcm-2)的超聲波能有效抑制藍(lán)藻細(xì)胞的快速增殖，經(jīng)過超聲輻照過的細(xì)胞生長(zhǎng)速率降低為對(duì)照組的38.9％(Tang JW等，J Appl Phycol，2003)。利用超聲波能促進(jìn)微生物細(xì)胞生長(zhǎng)、加強(qiáng)生物催化能力，已研制或有概念性的超聲波生物反應(yīng)器面世(Chisti Y等，Trends Biotechnol，2003)。
紫球藻(Porphyridium cruentum)屬紅藻門的單細(xì)胞藻，富含多種生物活性物質(zhì)，其蛋白質(zhì)含量為32.1％，氨基酸含量為29.54％；碳水化合物39.4％，總膳食纖維21.7％；灰份17.6％，水分7.8％，每千克干藻粉鈣、鎂、鉀和鋅含量分別為20000mg、4100mg、9500mg和92mg；每千克干藻粉β-胡蘿卜素240mg、維生素B618mg；有毒重金屬鉛、砷和汞含量符合有關(guān)規(guī)定(黃鍵等，食品與發(fā)酵工業(yè)，2005)。近年來的研究表明紫球藻及其胞外多糖具有(1)抗病毒作用；(2)調(diào)血脂作用(陳必鏈等，應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2004)；(3)抗炎作用或抗腫瘤細(xì)胞作用；(5)抗輻射作用；(6)降血糖作用(劉麗平等，中國(guó)海洋藥物，2005)。由于紫球藻及其胞外多糖藥效學(xué)的研究已取得明顯進(jìn)展，因此提高紫球藻生物量和生理活性產(chǎn)物產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
薔薇藻(Rhodella reticulata)是與紫球藻同屬紅藻門的單細(xì)胞藻，細(xì)胞外包被著一層粘質(zhì)鞘，由細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后產(chǎn)生胞外水溶性粘多糖形成。薔薇藻含豐富的藻膽蛋白、胞外多糖和不飽和脂肪酸等天然產(chǎn)物。尤其胞外多糖的物化性質(zhì)與紫球藻極為相似(Geresh S等，J Biochem Biophys Methods，2002)，因此，可能具有類似紫球藻及其胞外多糖的抗病毒、降血糖以及降血脂等功能，國(guó)外許多學(xué)者圍繞薔薇藻的胞外多糖、藻膽蛋白、光合系統(tǒng)等方面進(jìn)行了研究(Mihova SG等，J Biotechnol，1996)，取得了良好的進(jìn)展。
微綠球藻(Nannochloropsis sp)是金藻門的一種海洋單細(xì)胞微藻，具有易培養(yǎng)、繁殖迅速、營(yíng)養(yǎng)豐富的特點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用較為廣泛，近年來在泥蚶、蟹(沈和定等，上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999)、蝦(成文靖等，水利漁業(yè)，2002)等育苗及輪蟲(劉新富等，海洋科學(xué)，2002；Lubzens E等，Aquaculture，1995；Chebil L等，Aquacultural Eng，1998)培養(yǎng)中應(yīng)用較佳的優(yōu)良餌料。藻粉含有37.6％可利用碳水化合物，28.8％粗蛋白質(zhì)和18.4％總脂肪，還含有Ca、K、Na、Mg、Zn、Fe、Mn、Cu、Ni，脂肪酸含量5.0％16∶0，4.7％16∶1ω7，3.8％18∶1ω9，0.4％18∶2ω6，0.7％20∶4ω6和2.2％20∶5ω3(Rebolloso-Fuentes MM等，AgricFood Chem，2001)。在富含氮、磷的培養(yǎng)基中，該藻EPA含量可達(dá)到總脂肪酸的35％(魏東等，海洋科學(xué)，2000)。目前，國(guó)際市場(chǎng)上密度為12×109cells/mL藻液售價(jià)76歐元/L(http//www.bluebiotech.de)。因此，如何提高微綠球藻培養(yǎng)密度和脂肪酸含量，成為國(guó)際上藻類學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是參照均勻設(shè)計(jì)表中的“3因素7水平7組”實(shí)驗(yàn)方案，通過均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化，運(yùn)用DPS軟件對(duì)均勻設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行回歸分析并建立相應(yīng)的模型，確定在微藻生長(zhǎng)過程不同的時(shí)間段所采用的超聲波處理微藻時(shí)的電流、處理時(shí)間和脈沖時(shí)間的“3因素7水平”的劑量，實(shí)現(xiàn)提高微藻生物量和生理活性產(chǎn)物量(胞外多糖、藻膽蛋白或不飽和脂肪酸)的目的。
本發(fā)明所述的3因素7水平的取值分別為電流21％～39％，處理時(shí)間5s～245s，脈沖0.5s～9.5s。
本發(fā)明所述的在微藻生長(zhǎng)過程中超聲波進(jìn)行處理的時(shí)間段為每天處理1次、每天處理2次、隔天處理1次、第4天處理1次或第6天處理1次。
本發(fā)明所述的薇藻是指紅藻門的單細(xì)胞類群的紫球藻、薔薇藻和金藻門的微綠球藻。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案如下將微藻培養(yǎng)液裝于250mL三角瓶中培養(yǎng)，于培養(yǎng)周期中的1-6天內(nèi)某一時(shí)間段，用電流為21-39％、脈沖5.0-9.5s和處理時(shí)間45-205s的某一因素值進(jìn)行超聲波處理，其生物量、胞外多糖、藻膽蛋白、不飽和脂肪酸的含量分別有較大的提高。
1、當(dāng)用超聲波處理微藻培養(yǎng)液以提高生長(zhǎng)生物量時(shí)，將微藻培養(yǎng)液裝于250mL三角瓶中于培養(yǎng)的第一天，采用劑量為電流27-39％、脈沖6.5-9.5s和處理時(shí)間125-165s對(duì)微藻培養(yǎng)液第4天處理1次。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時(shí)的生物量與未經(jīng)處理的微藻相比，提高了13-31.5％。
2、當(dāng)用超聲波處理微藻培養(yǎng)液以提高胞外多糖含量時(shí)，將微藻培養(yǎng)液裝于250mL三角瓶中培養(yǎng)，采用劑量為電流21-30％、脈沖5.0-9.5s和處理時(shí)間125-205s對(duì)微藻培養(yǎng)液進(jìn)行隔天處理1次或第6天處理1次。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時(shí)的生物量與未經(jīng)處理的微藻相比，胞外多糖提高了38-46.5％。
3、當(dāng)用超聲波處理微藻培養(yǎng)液以提高藻膽蛋白含量時(shí)，將微藻培養(yǎng)液裝于250mL三角瓶中培養(yǎng)，采用劑量為電流21-36％、脈沖5.0-8.0s和處理時(shí)間45-165s對(duì)微藻培養(yǎng)液培養(yǎng)至第4天處理1次或第6天處理1次。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時(shí)的生物量與未經(jīng)處理的微藻相比，藻膽蛋白提高了13-18.5％。
4、當(dāng)用超聲波處理微藻培養(yǎng)液以提高不飽和脂肪酸時(shí)，將微藻培養(yǎng)液裝于250mL三角瓶中培養(yǎng)，采用劑量為電流21-36％、脈沖5.0-6.5s和處理時(shí)間85-125s對(duì)第1天微藻培養(yǎng)液處理1次。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時(shí)的生物量與未經(jīng)處理的微藻相比，不飽和脂肪酸提高了13-18.5％。
本發(fā)明所采用的超聲波處理處理方法，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、方法易行、操作安全，可使微藻的生物量、胞外多糖、藻膽蛋白、不飽和脂肪酸等生理活性產(chǎn)物產(chǎn)量提高10％-60％，有較大的推廣價(jià)值。
具體實(shí)施方案下面結(jié)合具體的實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1將紫球藻(Porphyridium cruentum)培養(yǎng)液裝于250mL三角瓶中培養(yǎng)，于培養(yǎng)的第一天，按照劑量為電流39％、脈沖9.5s和處理時(shí)間125s因素指標(biāo)，將超聲波儀(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)調(diào)整好后，對(duì)微藻培養(yǎng)液第4天處理1次。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時(shí)的生物量與未經(jīng)處理的紫球藻相比，提高了25.5％。同時(shí)，胞外多糖、藻膽蛋白、不飽和脂肪酸的含量也相應(yīng)有所提高。
實(shí)施例2將薔薇藻(Rhodella reticulata)培養(yǎng)液裝于250mL三角瓶中培養(yǎng)，于培養(yǎng)的第一天，按照劑量為電流27％、脈沖8.0s和處理時(shí)間165s因素指標(biāo)，將超聲波儀(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)調(diào)整好后，對(duì)微藻培養(yǎng)液第4天處理1次。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時(shí)的生物量與未經(jīng)處理的薔薇藻相比，提高了28.5％。同時(shí)，胞外多糖、藻膽蛋白、不飽和脂肪酸的含量也相應(yīng)有所提高。
實(shí)施例3將微綠球藻(Nannochloropsis sp)培養(yǎng)液裝于250mL三角瓶中培養(yǎng)，于培養(yǎng)的第一天起，按照劑量為電流27％、脈沖6.5s和處理時(shí)間165s因素指標(biāo)，超聲波儀(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)調(diào)整好后，對(duì)微藻培養(yǎng)液進(jìn)行隔天處理1次。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時(shí)的生物量與未經(jīng)處理的微綠球藻相比，生物量提高了32.5％。同時(shí)，不飽和脂肪酸和藻膽蛋白的含量也相應(yīng)有所提高。
實(shí)施例4將紫球藻(Porphyridium cruentum)培養(yǎng)液裝于250mL三角瓶中培養(yǎng)，按照劑量為電流24％、脈沖9.5s和處理時(shí)間205s因素指標(biāo)，將超聲波儀(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)調(diào)整好后，對(duì)微藻培養(yǎng)液隔天處理1次。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時(shí)的胞外多糖含量與未經(jīng)處理的紫球藻相比，胞外多糖提高了45.5％。同時(shí)，生物量、藻膽蛋白、不飽和脂肪酸的含量也相應(yīng)有所提高。
實(shí)施例5將薔薇藻(Rhodella reticulata)培養(yǎng)液裝于250mL三角瓶中培養(yǎng)，按照劑量為電流30％、脈沖5.5s和處理時(shí)間135s因素指標(biāo)，將超聲波儀(VC750，Sonicsand materials，Inc，USA)調(diào)整好后，對(duì)培養(yǎng)至第6天的微藻培養(yǎng)液處理1次。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時(shí)的胞外多糖含量與未經(jīng)處理的薔薇藻相比，胞外多糖提高了42.5％。同時(shí)，生物量、藻膽蛋白、不飽和脂肪酸的含量也相應(yīng)有所提高。
實(shí)施例6將紫球藻(Porphyridium cruentum)培養(yǎng)液裝于250mL三角瓶中培養(yǎng)，按照劑量為電流33％、脈沖6.5s和處理時(shí)間45s因素指標(biāo)，將超聲波儀(VC750，Sonicsand materials，Inc，USA)調(diào)整好后，對(duì)培養(yǎng)至第6天的微藻培養(yǎng)液處理1次。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時(shí)的藻膽蛋白含量與未經(jīng)處理的紫球藻相比，藻膽蛋白提高了18.5％。同時(shí)，生物量、胞外多糖、不飽和脂肪酸的含量也相應(yīng)有所提高。
實(shí)施例7將薔薇藻(Rhodella reticulata)培養(yǎng)液裝于250mL三角瓶中培養(yǎng)，按照劑量為電流21％、脈沖7.5s和處理時(shí)間165s因素指標(biāo)，將超聲波儀(VC750，Sonics andmaterials，Inc，USA)調(diào)整好后，對(duì)培養(yǎng)至至第4天的微藻培養(yǎng)液處理1次；培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時(shí)的藻膽蛋白含量與未經(jīng)處理的薔薇藻相比，藻膽蛋白提高了14.5％。同時(shí)，生物量、胞外多糖、不飽和脂肪酸的含量也相應(yīng)有所提高。
實(shí)施例8
將紫球藻(Porphyridium cruentum)培養(yǎng)液裝于250mL三角瓶中培養(yǎng)，于培養(yǎng)的第一天，按照劑量為電流30％、脈沖6.5s和處理時(shí)間85s因素指標(biāo)，將超聲波儀(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)調(diào)整好后，對(duì)微藻培養(yǎng)液處理1次。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時(shí)的不飽和脂肪酸含量與未經(jīng)處理的紫球藻相比，不飽和脂肪酸提高了13.5％。同時(shí)，生物量、胞外多糖、藻膽蛋白的含量也相應(yīng)有所提高。
實(shí)施例9將薔薇藻(Rhodella reticulata)培養(yǎng)液裝于250mL三角瓶中培養(yǎng)，于培養(yǎng)的第一天，按照劑量為電流33％、脈沖5.0s和處理時(shí)間100s因素指標(biāo)，將超聲波儀(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)調(diào)整好后，對(duì)微藻培養(yǎng)液處理1次。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時(shí)的不飽和脂肪酸含量與未經(jīng)處理的薔薇藻相比，不飽和脂肪酸提高了18.5％。同時(shí)，生物量、胞外多糖、藻膽蛋白的含量也相應(yīng)有所提高。
實(shí)施例10將微綠球藻(Nannochloropsis sp)培養(yǎng)液裝于250mL三角瓶中培養(yǎng)，于培養(yǎng)的第一天，按照劑量為電流21％、脈沖6.5s和處理時(shí)間125s因素指標(biāo)，將超聲波儀(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)調(diào)整好后，對(duì)微藻培養(yǎng)液處理1次。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時(shí)的微綠球藻中不飽和脂肪酸含量與未經(jīng)處理的微綠球藻相比，不飽和脂肪酸提高了18.5％。同時(shí)，生物量和藻膽蛋白也相應(yīng)有所提高。
權(quán)利要求
1.一種采用超聲波處理微藻的方法，其特征是于微藻培養(yǎng)周期中的1-6天內(nèi)，用電流為21-39％、脈沖5.0-9.5s和處理時(shí)間45-205s的因素值進(jìn)行超聲波處理，以提高其生物量、胞外多糖、藻膽蛋白、不飽和脂肪酸的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波處理微藻的方法，其特征是所述的薇藻是指紅藻門的單細(xì)胞類群的紫球藻、薔薇藻和金藻門的微綠球藻。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波處理微藻的方法，其特征是提高生長(zhǎng)生物量時(shí)，于微藻培養(yǎng)的第4天，采用劑量為電流27-39％、脈沖6.5-9.5s和處理時(shí)間125-165s對(duì)微藻培養(yǎng)液處理1次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波處理微藻的方法，其特征是提高胞外多糖含量時(shí)，采用劑量為電流21-30％、脈沖5.0-9.5s和處理時(shí)間125-205s對(duì)微藻培養(yǎng)液進(jìn)行隔天處理1次或第6天處理1次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波處理微藻的方法，其特征是提高藻膽蛋白含量時(shí)，采用劑量為電流21-36％、脈沖5.0-8.0s和處理時(shí)間45-165s對(duì)微藻培養(yǎng)液培養(yǎng)至第4天處理1次或第6天處理1次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波處理微藻的方法，其特征是提高不飽和脂肪酸含量時(shí)，采用劑量為電流21-36％、脈沖5.0-6.5s和處理時(shí)間85-125s對(duì)第1天微藻培養(yǎng)液處理1次。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用超聲波處理提高微藻生物量及其生理活性產(chǎn)物產(chǎn)量的方法。本發(fā)明參照均勻設(shè)計(jì)表實(shí)驗(yàn)方案，通過均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化，運(yùn)用DPS軟件進(jìn)行回歸分析并建立相應(yīng)的模型，確定在微藻生長(zhǎng)過程不同的時(shí)間段所采用的超聲波處理微藻時(shí)的電流、處理時(shí)間和脈沖時(shí)間的劑量，具體是將微藻培養(yǎng)液裝于250mL三角瓶中培養(yǎng)，于培養(yǎng)周期中的1－6天內(nèi)某一時(shí)間段，用電流為21－39％、脈沖5.0－9.5s和處理時(shí)間45－205s的某一因素值進(jìn)行超聲波處理，其生物量、胞外多糖、藻膽蛋白、不飽和脂肪酸的含量分別有較大的提高。本發(fā)明所采用的超聲波處理處理方法，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、方法易行、操作安全，可使微藻生物量、胞外多糖、藻膽蛋白、不飽和脂肪酸等生理活性產(chǎn)物產(chǎn)量提高10％－60％，有較大推廣價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/12GK1699548SQ200510080859
公開日2005年11月23日 申請(qǐng)日期2005年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月28日
發(fā)明者陳必鏈, 王娟, 黃鍵 申請(qǐng)人:福建師范大學(xué)