專(zhuān)利名稱(chēng)：游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞催化合成α－熊果苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCCNO.1243游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷的制備方法。
背景技術(shù)：
α-熊果苷具有顯著的抑制酪氨酸酶活性，減少酪氨酸酶在皮膚中的沉積，對(duì)皮膚有漂白、防色變和祛斑的功效；是國(guó)際公認(rèn)的正在極力推廣的高效、安全的美白劑，是美白、祛斑、防曬化妝品理想的添加成份。
固定化微生物細(xì)胞(immobilized cells)技術(shù)是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新興生物技術(shù)，在化工、發(fā)酵生產(chǎn)、能源、醫(yī)藥等行業(yè)，實(shí)際應(yīng)用效果顯著。它是利用物理或化學(xué)的手段將游離微生物細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域，并使其保持活性反復(fù)利用的方法。固定化微生物細(xì)胞技術(shù)與傳統(tǒng)的懸浮生物處理法相比，固定化細(xì)胞有提高單位體積的菌密度，菌體易回收，對(duì)環(huán)境的耐受力增強(qiáng)(如pH值、溫度、有機(jī)溶劑、有毒物質(zhì)等)等優(yōu)點(diǎn)。
目前，由于利用化學(xué)合成方法很難合成a-熊果苷，而關(guān)于a-熊果苷的制備方法主要是通過(guò)以α糖苷酶為催化劑，催化合成對(duì)苯二酚與葡萄糖為α-熊果苷。由于α糖苷酶價(jià)格昂貴，且采用上述方法制備α-熊果苷產(chǎn)率不高，這勢(shì)必導(dǎo)致生產(chǎn)成本高居不下，給實(shí)際推廣應(yīng)用帶來(lái)了很大困難。所以α-熊果苷一般通過(guò)微生物發(fā)酵催化合成，但這種方法也存在以下一些問(wèn)題一、利用發(fā)酵液生產(chǎn)α-熊果苷產(chǎn)物后續(xù)處理工藝復(fù)雜、設(shè)備投資及操作費(fèi)用均較大；二、利用發(fā)酵液生產(chǎn)α-熊果苷的周期較長(zhǎng)；三、利用發(fā)酵液生產(chǎn)α-熊果苷單位體積α-熊果苷的產(chǎn)量較低。
為了克服這些問(wèn)題，游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞是最好的解決辦法。海藻酸鹽凝膠作為一種廣泛應(yīng)用的細(xì)胞固定化介質(zhì)，具有固定化溫度低、強(qiáng)度高、化學(xué)穩(wěn)定性好、無(wú)毒、包埋效率高且價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，利用野油菜黃單胞菌游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞多次重復(fù)使用，縮短了生產(chǎn)周期、提高了α-熊果苷的產(chǎn)率，降低α-熊果苷的生產(chǎn)成本，使大規(guī)模生產(chǎn)α-熊果苷成為了可能。其中固定化細(xì)胞即采用包埋法對(duì)野油菜黃單胞菌CGMCC NO.1243進(jìn)行固定化，并用此固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷。該制備方法通過(guò)選用合適的固定化條件對(duì)野油菜黃單胞菌CGMCC NO.1243進(jìn)行固定化，再以此固定化細(xì)胞作為催化劑，加入反應(yīng)物對(duì)苯二酚與蔗糖，在最佳反應(yīng)條件下催化合成α-熊果苷。該方法具有固定化細(xì)胞活性高，穩(wěn)定性好，易于回收、再生和重復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn)；其工藝操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、操作安全等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是游離細(xì)胞催化合成α-熊果苷的方法，該方法由下列工藝步驟組成a.野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243細(xì)胞的制備，其中包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)；b.游離細(xì)胞催化合成α-熊果苷；c.游離細(xì)胞的回收及多次重復(fù)使用；d.游離細(xì)胞催化合成的α-熊果苷的分離純化。
固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷的方法，該方法由下列工藝步驟組成A.野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243細(xì)胞的制備，其中包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)；B.固定化野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243的制備；C.固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷；D.固定化細(xì)胞的回收及多次重復(fù)使用；E.固定化細(xì)胞催化合成的α-熊果苷的分離純化。
本發(fā)明的具體工藝步驟及工藝條件是步驟a和步驟A中野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243細(xì)胞的制備挑取1環(huán)斜面保存的野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243菌株，加入到體積為50ml的液體培養(yǎng)基中，在25-40℃，120r/min搖床培養(yǎng)24-48h后得一級(jí)種子液；再將一級(jí)種子液10-15％接種到含200ml上述培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，在25-40℃，140r/min搖床培養(yǎng)24-48h得二級(jí)種子液；以10-15％二級(jí)種子液接種發(fā)酵罐，發(fā)酵液在6000r/min，4℃離心15min得野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243細(xì)胞。
種子液及發(fā)酵罐培養(yǎng)基由下列重量份組分組成蔗糖60份、(NH4)2SO42份、硫酸鎂0.5份、氯化鈉2份、CaCl2·2H2O 0.05份、ZnCl20.01份、FeCl2·4H2O 0.1份、Na2MoO4·2H2O 0.05份、維生素B1 0.002份、維生素B12 0.005份、泛酸鈣0.004份、煙酸0.001份、對(duì)氨基苯甲酸納0.002份和水1000份，pH7.0；發(fā)酵的工藝條件為種子液接種量為10-15％，pH值為7.0，培養(yǎng)溫度為25-40℃，通風(fēng)量為0.4-0.6vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為120-160r/min，發(fā)酵時(shí)間為48-72h。
步驟b中游離細(xì)胞催化合成α-熊果苷的反應(yīng)條件為在10mmol/L磷酸緩沖溶液中，細(xì)胞濃度為100-200g/L，反應(yīng)物對(duì)苯二酚物質(zhì)量濃度為45-70mmol/1，蔗糖物質(zhì)量濃度為100-200mmol/l，反應(yīng)溫度為30-55℃，反應(yīng)時(shí)間為36-72小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為160-200轉(zhuǎn)/分鐘。在此反應(yīng)條件下，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)75-92％(以對(duì)苯二酚計(jì)算，下同)，每升反應(yīng)液中含α-熊果苷10-15g。
步驟c中游離細(xì)胞的回收再重復(fù)使用在游離細(xì)胞催化合成α-熊果苷反應(yīng)結(jié)束后，在6000r/min，4℃離心15min即可把游離細(xì)胞回收，回收的細(xì)胞用10mmol/L磷酸緩沖溶液洗滌2-3次，再次投入含有反應(yīng)物對(duì)苯二酚和蔗糖的10mmol/L的磷酸緩沖溶液中進(jìn)行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243細(xì)胞多次催化合成α-熊果苷，在此條件下，菌體游離細(xì)胞在轉(zhuǎn)化了5-8周期時(shí)，細(xì)胞仍保持75％的活力，從而降低了發(fā)酵細(xì)胞及產(chǎn)物后續(xù)處理費(fèi)用，大大節(jié)省了生產(chǎn)成本。
步驟d中游離細(xì)胞催化合成的α-熊果苷的分離純化包括以下四個(gè)步驟；①將反應(yīng)完成后的磷酸緩沖溶液在6000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心15分鐘除去菌體；②把經(jīng)過(guò)①步驟的磷酸緩沖溶液通過(guò)極性大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行分離純化，極性大孔吸附樹(shù)脂柱為大孔吸附樹(shù)脂S-8柱；③把經(jīng)過(guò)②步驟大孔吸附樹(shù)脂柱的流出液真空干燥，即可得到純度為98％以上的α-熊果苷，真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為65度，干燥后的成品為白色粉末狀；④把經(jīng)過(guò)③步驟的α-熊果苷粗品溶于水后進(jìn)行結(jié)晶，即得到純度為99.5％以上得α-熊果苷純品，結(jié)晶溫度為4度。
步驟B中野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243細(xì)胞固定化將質(zhì)量百分比濃度為2-7％的海藻酸鈉加蒸餾水煮沸溶解，冷卻后與等體積細(xì)胞濃度為150-300g/L的菌懸液混勻，取長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)?mm×6mm的乳膠管，在一端采用內(nèi)徑約1.0mm-4.0mm的滴頭。將乳膠管裝入蠕動(dòng)泵，調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵速度至50-100滴/min。在攪拌條件下，將混合液逐滴滴入0.1-1.0mol/L硼酸和0.5-2.0mol/L CaCl2混合溶液中，形成大小均勻的固定化凝膠珠，直徑最大差值≤0.5mm，固化5-15h后取出，制得直徑為1-5mm凝膠珠。
步驟C中固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷的反應(yīng)條件為
在10mmol/L硼酸緩沖溶液中，固定化細(xì)胞即細(xì)胞固定化后的凝膠珠濃度為150-300g/L，反應(yīng)物對(duì)苯二酚物質(zhì)量濃度為50-80mmol/l，蔗糖物質(zhì)量濃度為200-350mmol/l，反應(yīng)溫度為30-60℃，反應(yīng)時(shí)間為36-72小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為150-200轉(zhuǎn)/分鐘。在此反應(yīng)條件下，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)75-92％，每升反應(yīng)液中含α-熊果苷10-16g。
步驟D中固定化細(xì)胞的回收再重復(fù)使用在固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷反應(yīng)結(jié)束后，利用過(guò)濾即可把固定化細(xì)胞回收，回收的固定化細(xì)胞用10mmol/L硼酸緩沖溶液洗滌2-3次，再次投入含有反應(yīng)物對(duì)苯二酚和蔗糖的10mmol/L硼酸緩沖溶液中進(jìn)行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)海藻酸鈉固定化野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243細(xì)胞多次催化合成α-熊果苷，在此條件下，菌體固定化細(xì)胞使用了5-9周期時(shí)，固定化細(xì)胞仍保持75％以上的活力，為實(shí)現(xiàn)α-熊果苷的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
步驟E中固定化細(xì)胞催化合成的α-熊果苷的分離純化包括以下四個(gè)步驟；①將反應(yīng)完成后的硼酸緩沖溶液用濾紙過(guò)濾除去固定化細(xì)胞凝膠珠；②把經(jīng)過(guò)①步驟的硼酸緩沖溶液通過(guò)極性大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行分離純化，極性大孔吸附樹(shù)脂柱為大孔吸附樹(shù)脂S-8柱；③把經(jīng)過(guò)②步驟大孔吸附樹(shù)脂柱的流出液真空干燥，即可得到純度為98％以上的α-熊果苷，真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為65度，干燥后的成品為白色粉末狀；④把經(jīng)過(guò)③步驟的α-熊果苷粗品溶于水后進(jìn)行結(jié)晶，即得到純度為99.5％以上得α-熊果苷純品，結(jié)晶溫度為4度。
本發(fā)明提供的利用野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷的方法，適用于以海藻酸鈉、海藻酸鈣、聚乙烯醇(PVA)或硅膠為固定化介質(zhì)固定化野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243細(xì)胞催化合成α-熊果苷。
本發(fā)明所用的野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243已經(jīng)在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為野油菜黃單胞菌CGMCCNO.1243。
本發(fā)明所取得的技術(shù)進(jìn)步在于本發(fā)明是通過(guò)野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷，解決了直接用發(fā)酵液催化合成α-熊果苷所導(dǎo)致的產(chǎn)物后期分離工藝復(fù)雜，催化劑回收再利用困難，生產(chǎn)成本高居不下的難題；野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞提高了單位體積的菌密度，使菌體對(duì)環(huán)境的耐受力增強(qiáng)(如pH值、溫度、有機(jī)溶劑、有毒物質(zhì)等)，這不但大大縮短了發(fā)酵周期，降低了生產(chǎn)成本，且反應(yīng)后產(chǎn)物的分離純化工藝條件更簡(jiǎn)單，生產(chǎn)操作更安全性。采用本發(fā)明生產(chǎn)的α-熊果苷產(chǎn)量高，每升反應(yīng)液中含10-16gα-熊果苷，細(xì)胞壽命為5-9周期，具有重大工業(yè)化意義。
實(shí)施例以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1(a)菌體細(xì)胞的制備挑取1環(huán)斜面保存的野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243菌株，加入到體積為50ml的液體培養(yǎng)基中，在35℃，130r/min搖床培養(yǎng)48h后得一級(jí)種子液；再將10％的一級(jí)種子液接種到含200ml上述培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，在35℃，140r/min搖床培養(yǎng)36h后得二級(jí)種子液；以10％二級(jí)種子液接種發(fā)酵罐，發(fā)酵液在6000r/min，4℃離心15min得野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243細(xì)胞。
種子液及發(fā)酵罐培養(yǎng)基由下列重量份組分組成蔗糖60份、(NH4)2SO42份、硫酸鎂0.5份、氯化鈉2份、CaCl2·2H2O 0.05份、ZnCl20.01份、FeCl2·4H2O 0.1份、Na2MoO4·2H2O 0.05份、維生素B1 0.002份、維生素B12 0.005份、泛酸鈣0.004份、煙酸0.001份、對(duì)氨基苯甲酸納0.002份，和水1000份，pH7.0；發(fā)酵的工藝條件為種子液接種量為10％，pH值為7.0，培養(yǎng)溫度為35℃，通風(fēng)量為0.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min，發(fā)酵時(shí)間為60h。
(b)游離細(xì)胞催化合成α-熊果苷的反應(yīng)條件在10mmol/L磷酸緩沖溶液中，游離細(xì)胞濃度為150g/L，反應(yīng)物對(duì)苯二酚物質(zhì)量濃度為45mmol/l，蔗糖物質(zhì)量濃度為100mmol/l，反應(yīng)溫度為35℃，反應(yīng)時(shí)間為72小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘。在此反應(yīng)條件下，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)91.5％，每升反應(yīng)液中含α-熊果苷11.2g。
(c)游離細(xì)胞的回收及多次重復(fù)使用在游離細(xì)胞催化合成α-熊果苷反應(yīng)結(jié)束后，在6000r/min，4℃離心15min即可把游離細(xì)胞回收，回收的細(xì)胞用10mmol/L磷酸緩沖溶液洗滌2-3次，再次投入含有反應(yīng)物對(duì)苯二酚和蔗糖的10mmol/L的磷酸緩沖溶液中進(jìn)行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243細(xì)胞多次催化合成α-熊果苷，在此條件下，菌體游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化8周期，α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率分別為91.5％、91.5％、90.7％、90.2％、89％、88％、85％、82％，對(duì)應(yīng)的α-熊果苷質(zhì)量濃度為11.2g/L、11.2g/L、11.1g/L、11g/L、10.9g/L、10.8g/L、10.4g/L、10g/L。所以游離細(xì)胞在使用8次后，細(xì)胞活力仍保持在80％以上。
(d)α-熊果苷的分離純化，包括以下四個(gè)步驟；①將反應(yīng)完成后的磷酸緩沖溶液在6000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心15分鐘除去菌體；②把經(jīng)過(guò)①步驟的磷酸緩沖溶液通過(guò)極性大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行分離純化，極性大孔吸附樹(shù)脂柱為大孔吸附樹(shù)脂S-8柱；③把經(jīng)過(guò)②步驟大孔吸附樹(shù)脂柱的流出液真空干燥，即可得到純度為98％以上的α-熊果苷，真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為65度，干燥后的成品為白色粉末狀；④把經(jīng)過(guò)③步驟的α-熊果苷粗品溶于水后進(jìn)行結(jié)晶，即得到純度為99.5％以上得α-熊果苷純品，結(jié)晶溫度為4度。
實(shí)施例2(a)菌體細(xì)胞的制備重復(fù)實(shí)施例1中的(a)步驟制備菌體細(xì)胞；(b)游離細(xì)胞催化合成α-熊果苷的反應(yīng)條件在10mmol/L磷酸緩沖溶液中，游離細(xì)胞濃度為200g/L，反應(yīng)物對(duì)苯二酚物質(zhì)量濃度為60mmol/1，蔗糖物質(zhì)量濃度為200mmol/l，反應(yīng)溫度為45℃，反應(yīng)時(shí)間為72小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘。在此反應(yīng)條件下，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)92％，每升反應(yīng)液中含α-熊果苷15g。
(c)游離細(xì)胞的回收及多次重復(fù)使用在游離細(xì)胞催化合成α-熊果苷反應(yīng)結(jié)束后，在6000r/min，4℃離心15min即可把游離細(xì)胞回收，回收的細(xì)胞用10mmol/L磷酸緩沖溶液洗滌2-3次，再次投入含有反應(yīng)物對(duì)苯二酚和蔗糖的10mmol/L的磷酸緩沖溶液中進(jìn)行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243游離細(xì)胞多次催化合成α-熊果苷，在此條件下，菌體游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化6周期，α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率分別為92％、92％、91.5％、87％、80％、75％，對(duì)應(yīng)的α-熊果苷質(zhì)量濃度為15g/L、15g/L、14.9g/L、14.2g/L、13.1g/L、12.2g/L。所以游離細(xì)胞在使用5次后，細(xì)胞活力仍保持在75％。
(d)α-熊果苷的分離純化，包括以下四個(gè)步驟；
①將反應(yīng)完成后的磷酸緩沖溶液在6000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心15分鐘除去菌體；②把經(jīng)過(guò)①步驟的磷酸緩沖溶液通過(guò)極性大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行分離純化，極性大孔吸附樹(shù)脂柱為大孔吸附樹(shù)脂S-8柱；③把經(jīng)過(guò)②步驟大孔吸附樹(shù)脂柱的流出液真空干燥，即可得到純度為98％以上的α-熊果苷，真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為65度，干燥后的成品為白色粉末狀；④把經(jīng)過(guò)③步驟的α-熊果苷粗品溶于水后進(jìn)行結(jié)晶，即得到純度為99.5％以上得α-熊果苷純品，結(jié)晶溫度為4度。
實(shí)施例3(A)菌體細(xì)胞的制備重復(fù)實(shí)施例1中的(a)步驟制備菌體細(xì)胞；(B)菌體細(xì)胞的固定化將質(zhì)量百分比濃度為2％的海藻酸鈉加蒸餾水煮沸溶解，冷卻后和等體積細(xì)胞濃度為150g/L的菌懸液混勻，取長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)?mm×6mm的乳膠管，在一端采用內(nèi)徑約4.0mm的滴頭。將乳膠管裝入蠕動(dòng)泵，調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵速度至100滴/min。在攪拌條件下，將混合液逐滴滴入0.1mol/L硼酸和1.5mol/L CaCl2混合溶液中，形成大小均勻的固定化凝膠珠，直徑最大差值≤0.5mm，固化10h后取出，制得直徑為3mm的凝膠珠。
(C)固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷反應(yīng)條件為在10mmol/L硼酸緩沖溶液中，固定化細(xì)胞即細(xì)胞固定化后的凝膠珠濃度為150g/L，反應(yīng)物對(duì)苯二酚物質(zhì)量濃度為50mmol/l，蔗糖物質(zhì)量濃度為200mmol/l，反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘。在此反應(yīng)條件下，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)91.5％，每升反應(yīng)液中含α-熊果苷12.4g。
(D)固定化細(xì)胞的回收再重復(fù)使用在固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷反應(yīng)結(jié)束后，利用過(guò)濾即可把固定化細(xì)胞回收，回收的固定化細(xì)胞用10mmol/L硼酸緩沖溶液洗滌2-3次，再次投入含有反應(yīng)物對(duì)苯二酚和蔗糖的10mmol/L硼酸緩沖溶液中進(jìn)行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)海藻酸鈉固定化野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243細(xì)胞多次催化合成α-熊果苷。在此條件下，菌體游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化9周期，α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率分別為91.5％、91.5％、91％、89％、88％、85％、81％，79％、75％，對(duì)應(yīng)的α-熊果苷質(zhì)量濃度為12.4g/L、12.4g/L、12.3/L、12.1g/L、12g/L、11.6g/L、11g/L、10.7g/L、10.2g/L。所以游離細(xì)胞在使用9次后，細(xì)胞活力仍保持在75％以上。
(E)α-熊果苷的分離純化包括以下四個(gè)步驟；①將反應(yīng)完成后的硼酸緩沖溶液用濾紙過(guò)濾除去固定化細(xì)胞凝膠珠；②把經(jīng)過(guò)①步驟的硼酸緩沖溶液通過(guò)極性大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行分離純化，極性大孔吸附樹(shù)脂柱為大孔吸附樹(shù)脂S-8柱；③把經(jīng)過(guò)②步驟大孔吸附樹(shù)脂柱的流出液真空干燥，即可得到純度為98％以上的α-熊果苷，真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為65度，干燥后的成品為白色粉末狀；④把經(jīng)過(guò)③步驟的α-熊果苷粗品溶于水后進(jìn)行結(jié)晶，即得到純度為99.5％以上得α-熊果苷純品，結(jié)晶溫度為4度。
實(shí)施例4(A)菌體細(xì)胞的制備重復(fù)實(shí)施例1中的(a)步驟制備菌體細(xì)胞；(B)菌體細(xì)胞的固定化將質(zhì)量百分比濃度為5％的海藻酸鈉加蒸餾水煮沸溶解，冷卻后和等體積細(xì)胞濃度為200g/L的菌懸液混勻，取長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)?mm×6mm的乳膠管，在-端采用內(nèi)徑約2.0mm的滴頭。將乳膠管裝入蠕動(dòng)泵，調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵速度至75滴/min。在攪拌條件下，將混合液逐滴滴入0.1mol/L硼酸和1.5mol/L CaCl2混合溶液中，形成大小均勻的固定化凝膠珠，直徑最大差值≤0.5mm，固化15h后取出，制得直徑為5mm的凝膠珠。
(C)固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷反應(yīng)條件為在10mmol/L硼酸緩沖溶液中，固定化細(xì)胞即細(xì)胞固定化后的凝膠珠濃度為250g/L，反應(yīng)物對(duì)苯二酚物質(zhì)量濃度為65mmol/l，蔗糖物質(zhì)量濃度為250mmol/l，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘。在此反應(yīng)條件下，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)92％，每升反應(yīng)液中含α-熊果苷16g。
(D)固定化細(xì)胞的回收再重復(fù)使用在固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷反應(yīng)結(jié)束后，利用過(guò)濾即可把固定化細(xì)胞回收，回收的固定化細(xì)胞用10mmol/L硼酸緩沖溶液洗滌2-3次，再次投入含有反應(yīng)物對(duì)苯二酚和蔗糖的10mmol/L硼酸緩沖溶液中進(jìn)行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)海藻酸鈉固定化野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243細(xì)胞多次催化合成α-熊果苷。在此條件下，菌體游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化6周期，α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率分別為92％、92％，89％、85％、78％、75％，對(duì)應(yīng)的(α-熊果苷質(zhì)量濃度為16g/L、16g/L、15.7g/L、15g/L、13.8g/L、13.3g/L。所以游離細(xì)胞在使用6次后，細(xì)胞活力仍保持在75％以上。
(E)α-熊果苷的分離純化包括以下四個(gè)步驟；①將反應(yīng)完成后的硼酸緩沖溶液用濾紙過(guò)濾除去固定化細(xì)胞凝膠珠；②把經(jīng)過(guò)①步驟的硼酸緩沖溶液通過(guò)極性大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行分離純化，極性大孔吸附樹(shù)脂柱為大孔吸附樹(shù)脂S-8柱；③把經(jīng)過(guò)②步驟大孔吸附樹(shù)脂柱的流出液真空干燥，即可得到純度為98％以上的α-熊果苷，真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為65度，干燥后的成品為白色粉末狀；④把經(jīng)過(guò)③步驟的α-熊果苷粗品溶于水后進(jìn)行結(jié)晶，即得到純度為99.5％以上得α-熊果苷純品，結(jié)晶溫度為4度。
實(shí)施例5(A)菌體細(xì)胞的制備重復(fù)實(shí)施例1中的(a)步驟制備菌體細(xì)胞；(B)菌體細(xì)胞的固定化將質(zhì)量百分比濃度為7％的海藻酸鈉加蒸餾水煮沸溶解，冷卻后和等體積細(xì)胞濃度為250g/L的菌懸液混勻，取長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)?mm×6mm的乳膠管，在一端采用內(nèi)徑約1.0mm的滴頭。將乳膠管裝入蠕動(dòng)泵，調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵速度至50滴/min。在攪拌條件下，將混合液逐滴滴入0.1mol/L硼酸和1.5mol/L CaCl2混合溶液中，形成大小均勻的固定化凝膠珠，直徑最大差值≤0.5mm，固化15h后取出，制得直徑為1.5mm的凝膠珠。
(C)固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷反應(yīng)條件為在10mmol/L硼酸緩沖溶液中，固定化細(xì)胞即細(xì)胞固定化后的凝膠珠濃度為300g/L，反應(yīng)物對(duì)苯二酚物質(zhì)量濃度為70mmol/l，蔗糖物質(zhì)量濃度為200mmol/l，反應(yīng)溫度為35℃，反應(yīng)時(shí)間為60小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘。在此反應(yīng)條件下，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)81％，每升反應(yīng)液中含α-熊果苷15.4g。
(D)固定化細(xì)胞的回收再重復(fù)使用在固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷反應(yīng)結(jié)束后，利用過(guò)濾即可把固定化細(xì)胞回收，回收的固定化細(xì)胞用10mmol/L硼酸緩沖溶液洗滌2-3次，再次投入含有反應(yīng)物對(duì)苯二酚和蔗糖的10mmol/L硼酸緩沖溶液中進(jìn)行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)海藻酸鈉固定化野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243細(xì)胞多次催化合成α-熊果苷。在此條件下，菌體游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化5周期，α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率分別為81％、79％，78％、76％、75％，對(duì)應(yīng)的α-熊果苷質(zhì)量濃度為15.4g/L、15g/L、14.9g/L、14.5g/L、14.3g/L。所以游離細(xì)胞在使用5次后，細(xì)胞活力仍保持在75％以上。
(E)α-熊果苷的分離純化包括以下四個(gè)步驟；①將反應(yīng)完成后的硼酸緩沖溶液用濾紙過(guò)濾除去固定化細(xì)胞凝膠珠；②把經(jīng)過(guò)①步驟的硼酸緩沖溶液通過(guò)極性大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行分離純化，極性大孔吸附樹(shù)脂柱為大孔吸附樹(shù)脂S-8柱；③把經(jīng)過(guò)②步驟大孔吸附樹(shù)脂柱的流出液真空干燥，即可得到純度為98％以上的α-熊果苷，真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為65度，干燥后的成品為白色粉末狀；④把經(jīng)過(guò)③步驟的α-熊果苷粗品溶于水后進(jìn)行結(jié)晶，即得到純度為99.5％以上得α-熊果苷純品，結(jié)晶溫度為4度。
權(quán)利要求
1.游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于用野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243的游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞在緩沖溶液系統(tǒng)中催化對(duì)苯二酚與蔗糖合成α-熊果苷，其中游離細(xì)胞催化合成α-熊果苷的方法，該方法由下列工藝步驟組成a.野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243細(xì)胞的制備，其中包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)；b.游離細(xì)胞催化合成α-熊果苷；c.游離細(xì)胞的回收及多次重復(fù)使用；d.游離細(xì)胞催化合成的α-熊果苷的分離純化；固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷的方法，該方法由下列工藝步驟組成A.野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243細(xì)胞的制備，其中包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)；B.固定化野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243的制備；C.固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷；D.固定化細(xì)胞的回收及多次重復(fù)使用；E.固定化細(xì)胞催化合成的α-熊果苷的分離純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于所述的a和A步驟中的種子液及發(fā)酵罐培養(yǎng)基由下列重量份組分組成蔗糖60份、(NH4)2SO42份、硫酸鎂0.5份、氯化鈉2份、CaCl2·2H2O 0.05份、ZnCl20.01份、FeCl2·4H2O 0.1份、Na2MoO4·2H2O 0.05份、維生素B10.002份、維生素B12 0.005份、泛酸鈣0.004份、煙酸0.001份、對(duì)氨基苯甲酸納0.002份和水1000份，pH7.0。
3.據(jù)權(quán)利要求1或2所述的游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于發(fā)酵的工藝條件為種子液接種量為10-15％，pH值為7.0，培養(yǎng)溫度為25-40℃，通風(fēng)量為0.4-0.6vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為120-160r/min，發(fā)酵時(shí)間為48-72h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于所述的b步驟中的反應(yīng)條件為在10mmol/L磷酸緩沖溶液中，細(xì)胞濃度為100-200g/L，反應(yīng)物對(duì)苯二酚物質(zhì)量濃度為45-70mmol/l，蔗糖物質(zhì)量濃度為100-200mmol/l，反應(yīng)溫度為30-55℃，反應(yīng)時(shí)間為36-72小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為160-200轉(zhuǎn)/分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞催化合成的α-熊果苷的方法，其特征在于所述的d步驟中的游離細(xì)胞催化合成的α-熊果苷的分離純化包括以下四個(gè)步驟①將反應(yīng)完成后的磷酸緩沖溶液在6000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心15分鐘除去菌體；②把經(jīng)過(guò)①步驟的磷酸緩沖溶液通過(guò)極性大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行分離純化，極性大孔吸附樹(shù)脂柱為大孔吸附樹(shù)脂S-8柱；③把經(jīng)過(guò)②步驟大孔吸附樹(shù)脂柱的流出液真空干燥，即可得到純度為98％以上的α-熊果苷，真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為65度，干燥后的成品為白色粉末狀；④把經(jīng)過(guò)③步驟的α-熊果苷粗品溶于水后進(jìn)行結(jié)晶，即得到純度為99.5％以上得α-熊果苷純品，結(jié)晶溫度為4度。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243細(xì)胞的固定化介質(zhì)選自海藻酸鈉、海藻酸鈣、聚乙烯醇(PVA)或硅膠。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于所述的B步驟中固定化野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243的制備是利用海藻酸鈉包埋法制備，其步驟是先制得質(zhì)量百分比濃度為2-7％的海藻酸鈉水溶液，冷卻后與等體積細(xì)胞濃度為150-300g/L的菌懸液混勻，取長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)?mm×6mm的乳膠管，在一端采用內(nèi)徑約1.0mm-4.0mm的滴頭；將乳膠管裝入蠕動(dòng)泵，調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵速度至50-100滴/min；在攪拌條件下，將混合液逐滴滴入0.1-1.0mol/L硼酸和0.5-2.0mol/L CaCl2混合溶液中，形成大小均勻的固定化凝膠珠，直徑最大差值≤0.5mm，固化5-15h后取出，制得直徑為1-5mm凝膠珠。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于所述的C步驟中的反應(yīng)條件為在10mmol/L硼酸緩沖溶液中，固定化細(xì)胞即固定化后的凝膠珠濃度為150-300g/L，反應(yīng)物對(duì)苯二酚物質(zhì)量濃度為50-80mmol/l，蔗糖物質(zhì)量濃度為200-350mmol/l，反應(yīng)溫度為30-60℃，反應(yīng)時(shí)間為36-72小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為150-200轉(zhuǎn)/分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于所述的游離細(xì)胞的使用壽命為5-8周期，固定化細(xì)胞的使用壽命為5-9周期。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于所述的E步驟中的固定化細(xì)胞催化合成的α-熊果苷的分離純化包括以下四個(gè)步驟①將反應(yīng)完成后的硼酸緩沖溶液用濾紙過(guò)濾除去固定化細(xì)胞凝膠珠；②把經(jīng)過(guò)①步驟的硼酸緩沖溶液通過(guò)極性大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行分離純化，極性大孔吸附樹(shù)脂柱為大孔吸附樹(shù)脂S-8柱；③把經(jīng)過(guò)②步驟大孔吸附樹(shù)脂柱的流出液真空干燥，即可得到純度為98％以上的α-熊果苷，真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為65度，干燥后的成品為白色粉末狀；④把經(jīng)過(guò)③步驟的α-熊果苷粗品溶于水后進(jìn)行結(jié)晶，即得到純度為99.5％以上得α-熊果苷純品，結(jié)晶溫度為4度。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)CGMCC NO.1243游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞催化合成α－熊果苷的制備方法，它包括菌體細(xì)胞的制備，反應(yīng)體系的選擇，固定化載體的選擇，固定化細(xì)胞的制備，反應(yīng)條件的優(yōu)化和產(chǎn)物的提取等工藝步驟；本發(fā)明通過(guò)野油菜黃單胞菌游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞催化合成α－熊果苷，具有菌體可以多次重復(fù)利用，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)物提取工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，大大降低了生產(chǎn)成本低。采用本發(fā)明生產(chǎn)α－熊果苷產(chǎn)量高，每升反應(yīng)液中含有10－16g α－熊果苷，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化率可達(dá)92％，細(xì)胞壽命為5－9周期。α－熊果苷具有顯著的抑制酪氨酸酶活性，減少酪氨酸酶在皮膚中的沉積，對(duì)皮膚有漂白、防色變和祛斑的功效。
文檔編號(hào)C12R1/01GK1727493SQ20051008036
公開(kāi)日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2005年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月4日
發(fā)明者張鵬, 張淑榮, 劉春巧, 楊育紅 申請(qǐng)人:張鵬, 張淑榮, 劉春巧