司，二甲基亞砜(DMSO)、0· 25%胰酶（含EDTA)購于 Solarbio公司，5-溴脫氧尿苷(5-Brdu)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于美國Sigma公司，LDH測 試盒購于南京建成生物工程研究所，NOS試劑盒(分型）南京建成生物工程研究所，ATP酶試 劑盒(南京建成生物工程研究所），cTnI酶聯(lián)免疫吸附測試試劑盒、CK-MB酶聯(lián)免疫吸附測試 試劑盒購于武漢優(yōu)爾生。
[0030] CO2培養(yǎng)箱（Thermo Forma)，CKX41 相差顯微鏡（OLUMPUS) ,Model 450 自動酶標(biāo)儀 (美國Bio-Rad公司），96孔板(JET)，722sp可見分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司），可調(diào) 式微量移液器(Thermo Forma)，單人單面超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備總廠），XD-101型倒置 生物顯微鏡（南京江南光電），DW-40L262(低溫保存箱）、DW-86L628立式超低溫保存箱 (Haier特種電器有限公司），手提式壓力蒸汽滅菌器、立式蒸汽滅菌器(廣州華南醫(yī)藥器械 有限公司），JA2003微量天平（上海第二天平儀器廠），5415D型低溫高速離心機(jī)（德國 Eppendorf)，LQP-B-4顆粒制冰機(jī)(上海安亭）。
[0031] 二、試驗方法
[0032] 1、心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)
[0033]具體步驟：（1)超凈工作臺中，將乳鼠放置于250mL燒杯中，噴以75%酒精進(jìn)行皮膚 消毒。（2)左手捏住鼠背部，右手持無菌眼科剪在胸骨正中偏左平劍突刺入胸腔，抬起剪刀 頭端，向前挑起剪一縱向切口，再平劍突往左右剪開約2cm，左手捏住背部皮膚擠壓胸部，就 可以見跳動的心臟，換無菌彎鑷將心臟取出，置于冷的PBS溶液培養(yǎng)皿中。用無菌眼科剪和 鑷除去心房、結(jié)締組織及細(xì)胞膜后將心臟放入IOmL西林瓶中，用冷PBS溶液反復(fù)沖洗三遍， 洗凈殘血。（3)用無菌彎剪剪碎心臟(約1~2mm大?。尤肜銹BS溶液，并沖洗無菌彎鑷，用 吸管將小組織塊懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，冷PBS再清洗兩遍。（4)第一、二次消化:按預(yù)溫好的 胰酶與組織塊以2:1的比例緩慢沿離心管壁緩慢加入，室溫下以無菌吸管反復(fù)輕柔吹打幫 助消化，觀察組織塊出現(xiàn)絲狀物，上清變渾濁，根據(jù)濁度停止消化，吸出第一、二次消化的上 清液，棄去。（5)繼續(xù)消化，步驟同(4)，直至小組織炔基本消化完全為止。收集細(xì)胞懸液。（6) 將所有細(xì)胞懸液過200目細(xì)胞篩，加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，冷PBS洗滌， 1000 rpm離心2次，每次8min，棄去上清。（7)臺盼蘭計數(shù)：（6)所得沉淀中加入適量DMEM培養(yǎng) 基，制成細(xì)胞懸液，取〇. 4%臺盼蘭染液IOyL與細(xì)胞懸液90yL混勻，室溫放置2~3min，將清 潔的細(xì)胞計數(shù)板放置在倒置顯微鏡臺上，在蓋玻片邊緣滴1~2滴已染色好的細(xì)胞懸液，鏡 檢可見圓形分散的細(xì)胞分布在各處，活細(xì)胞整體完整，透明而不著色，而不健康細(xì)胞會著 色，計數(shù)時除去，計數(shù)四大方格的細(xì)胞數(shù)。壓線的細(xì)胞只記左線和上線者，細(xì)胞團(tuán)按一個細(xì) 胞計數(shù)，按以下公式計算懸液的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞數(shù)/mL=四大方格細(xì)胞數(shù)總數(shù)/4 X 10000 X稀 釋倍數(shù)(8)按3 X IO5~5 X IO5細(xì)胞密度接種到培養(yǎng)瓶中，放入95 %O2，5 % CO2培養(yǎng)箱中差速 貼壁約2h。差速貼壁后的細(xì)胞懸液接種至培養(yǎng)板中，前48h加入終濃度為100μ mol/L的5-Brdu，以抑制非心肌細(xì)胞的生長，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每24h進(jìn)行換液。
[0034] 2、過氧化氫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立
[0035] 選取培養(yǎng)3~4天、生長良好、搏動規(guī)律的心肌細(xì)胞，吸棄孔內(nèi)舊培養(yǎng)基，換新培養(yǎng) 基，同時加入終濃度為600ymol/L的H 2O2，重置于CO2培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)24h，建立H2O 2誘發(fā)心 肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。
[0036] 3、實(shí)驗分組及給藥
[0037] 化合物（I)給藥設(shè)低、中、高三個劑量組，濃度分別為0.6、6和60ymol/L;陽性藥物 維拉帕米(Verapamil)組的終濃度為25ymol/L。選擇生長良好、搏動規(guī)律的細(xì)胞，隨機(jī)分為： 正常（contro 1);模型(Mode 1);陽性藥物組;溶媒對照組(DMSO);化合物（I)低、中、高劑量， 共7組，每組設(shè)6個復(fù)孔。各組均于造模前12h吸去孔內(nèi)舊培養(yǎng)液，換成Hanks液以使各組細(xì)胞 同步生長（即平衡），各給藥組在造模前加入相應(yīng)藥物預(yù)孵2h。除正常組外，平衡后的各組細(xì) 胞均按上方法加入建立心肌細(xì)胞H 2O2損傷模型。造模結(jié)束后吸取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，-20 °〇冰箱保存待測生化指標(biāo)。各組心肌細(xì)胞則按常規(guī)方法加入適量0.125%胰蛋白酶消化，4 °C、800rpm離心10min，棄去上清，以生理鹽水制成2 X IO6~3 X IO6細(xì)胞懸液，-80°C冰箱保存 備用。
[0038] 4、MTT法測定心肌細(xì)胞存活力
[0039]用96孔板培養(yǎng)的各組心肌細(xì)胞于造模后加入IOyL MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h，傾去培養(yǎng)液， 加入DMSO 150yL，平板震蕩器震蕩5min，使結(jié)晶物充分溶解。以Hanks液培養(yǎng)調(diào)零，用酶標(biāo)儀 以570/630nm雙波長測定去除本底光吸收值后的吸光度(0D值），重復(fù)3次。
[0040] 5、心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力的測定
[0041] 實(shí)驗原理:乳酸脫氫酶(LDH)能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與2,4_二硝基苯肼反 應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕紅色，通過比色可求出酶活力。樣品前處理， 按照下表進(jìn)行。依照試劑盒要求將輔酶I、堿性溶液適當(dāng)稀釋。
[0042]
[0043] 計算心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中 LDH活力：LDH活力(U/L) = (ODu-ODc) / ( ODs-ODb ) X Cs X N X 1000 A為培養(yǎng)液的稀釋倍數(shù)。
[0044] 6、統(tǒng)計分析
[0045] 數(shù)據(jù)采用平均值土標(biāo)準(zhǔn)差（[土 s)表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)，計 量資料組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。
[0046]三、結(jié)果及結(jié)論
[0047] 1、過氧化氫損傷前后心肌細(xì)胞活力
[0048] 正常組的細(xì)胞存活率按100 %計，試驗結(jié)果顯示= H2O2應(yīng)激損傷后心肌細(xì)胞存活率 較正常組心肌細(xì)胞下降（P〈〇.05) ;DMS0溶媒組與模型組相比較，DMSO對心肌細(xì)胞存活率無 影響(P>0.05);而化合物（I)各給藥組均能使心肌細(xì)胞存活率明顯增加(P〈0.01)。結(jié)果見表1 (*P〈0 · Olvs正常組，#P〈0 · Olvs模型組，APX) · 05vs模型組）。
[0049 ] 2、心肌細(xì)胞過氧化氫損傷培養(yǎng)液中LDH的活性
[0050] 與正常組比，模型組LDH含量明顯增高(P〈0.01);與模型組比較，溶媒組的LDH含量 無顯著性差異(P>〇.05)，而化合物（I)低、中、高劑量組、陽性藥物組的LDH活性明顯降低(P〈 0 · 01)。結(jié)果見表2(*P〈0 · Olvs正常組，#P〈0 · Olvs模型組，APX) · 05vs模型組）。
[0051] 提示化合物(I)可以進(jìn)一步研究開發(fā)成心肌細(xì)胞保護(hù)的藥物。
[0052] 表1化合物(I)對H2O2應(yīng)激損傷后心肌細(xì)胞存活率的影響(X ± s，η = 6)

[0054] 表2化合物（I)對H2O2應(yīng)激損傷后心肌細(xì)胞LDH含量影響(x 土 s，n = 6)
[0057] 片劑的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:7的 比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0058] 實(shí)施例4
[0059] 口服液的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸 檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口 服液。
[0060] 實(shí)施例5
[0061]膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒 石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重 量比為1:7的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0062] 實(shí)施例6
[0063] 注射液的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸 檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾， 灌封滅菌制成注射液。
[0064] 實(shí)施例7
[0065] 無菌粉針的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水 中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封 得粉針劑。
[0066] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I):P2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含W下操作步驟：（a)將吳榮 英的干燥近成熟果實(shí)粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次 用石油酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正 下醇萃取物；（b)步驟(a)中正下醇取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個柱體積，再 用70%乙醇洗脫8個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟 (b)中70 %乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為40:1、20:1、10:1和5:1的二氯 甲燒-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積 比為8:1、5:1和2:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八燒 基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個 柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述用乙醇熱回流提取 采用的乙醇濃度為75 %。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。5. -種藥物組合物，其特征在于：其中含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物（I) 和藥學(xué)上可接受的載體。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備屯、肌保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備屯、肌保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檸檬苦素類化合物、制備方法和心肌保護(hù)的用途，屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域。該化合物為首次報道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的檸檬苦素類化合物，可以從吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)中提取、分離純化得到。本研究證實(shí)該化合物能使H2O2應(yīng)激損傷后心肌細(xì)胞存活率明顯增加，LDH活性明顯降低，可以用來開發(fā)成心肌保護(hù)的藥物。
【IPC分類】C07J73/00, A61P9/00, A61K31/585
【公開號】CN105503998
【申請?zhí)枴緾N201511023707
【發(fā)明人】吳金鳳
【申請人】吳金鳳
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月30日