用于治療黑色素瘤的檸檬苦素化合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從九里香的干燥根皮中分離得到的一種檸檬 苦素類化合物，含其的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 九里香Murraya exotica L.為蕓香科九里香屬植物，主要分布在我國云南、貴州、 湖南、廣東、廣西、福建、海南、臺(tái)灣等省區(qū)，以及亞洲一些熱帶及亞熱帶地區(qū)，其氣香，味苦、 辛，有麻舌感，具有行氣止痛、活血散瘀之功效，用于胃痛、風(fēng)濕痹痛，也用于治療牙痛、跌撲 腫痛、蟲蛇咬傷。很早以前，我國南方就將九里香作為一種民間用藥，用于治療各種病癥，特 別是炎性病變和鎮(zhèn)痛。
[0003]近年來，中外學(xué)者對(duì)九里香的化學(xué)成分進(jìn)行了大量研究，從其葉、根皮、果實(shí)等部 位中分離得到了多種化合物，主要包括香豆素類、黃酮類、生物堿類以及揮發(fā)油等。九里香 含有大量的香豆素類成分，這類成分的常見特征為在7-甲氧基或5,7_二甲氧基香豆素骨架 的C8位帶有異戊二烯單位，以氧化、酯化或骨架重排等多種形式存在。九里香含有多種黃酮 類化合物，還含有黃酮苷類成分。九里香的葉中含有大量的黃酮類和香豆素類化合物，而九 里香的根、皮中主要含有生物堿類成分。揮發(fā)油類是九里香的主要化學(xué)成分之一。其揮發(fā)油 成分的含量因品種、采收季節(jié)、地區(qū)不同而存在差異，含量的高低影響九里香的藥材質(zhì)量及 臨床療效。
[0004] 現(xiàn)代藥理研究表明九里香具有殺蟲、消炎鎮(zhèn)痛、抗菌及抗氧化等作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種從九里香的干燥根皮中分離得到的一種檸檬苦素類化 合物，含其的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I):
[0009]所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將九里香的干燥根皮粉碎， 用70~80 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽 和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫8個(gè)柱 體積，收集70 %洗脫液，減壓濃縮得70 %乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70 %乙醇洗脫濃縮 物用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1、60:1、35 :1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脫得到5個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、15:1和 5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個(gè)柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0010] 進(jìn)一步地，步驟(a)中，用75%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0011] 進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為DlOl型大孔吸附樹脂。
[0012] 藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物(I)和藥學(xué)上可接受的載體。
[0013] 所述的化合物(I)在制備治療黑色素瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 所述的藥物組合物在制備治療黑色素瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0016] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對(duì) 人和動(dòng)物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0017] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時(shí)，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
【附圖說明】
[0018] 圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[0019] 圖2為化合物（I)計(jì)算E⑶和實(shí)驗(yàn)E⑶圖；
[0020]圖3為BrdU免疫熒光檢測細(xì)胞增殖結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0022] 主要材料、試劑來源及儀器類型：
[0023]乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限 公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0024]實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0025] (a)九里香的干燥根皮（IOkg)粉碎，用75 %乙醇熱回流提取(30L X 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（6L)，依次用石油醚(6L X 3次）、乙酸乙酯（6L X 3次）和水飽和的正丁醇 (6LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(381g)和正丁醇萃取物；（b)步驟 (a)中乙酸乙酯萃取物用DlOl大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70%乙醇 洗脫8個(gè)柱體積，收集70 %洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物（125g); (c)步驟(b)中 70 %乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1 (8個(gè)柱體積）、60 :1 (8個(gè)柱體 積）、35:1 (8個(gè)柱體積）、15:1 (10個(gè)柱體積)和1:1 (6個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得 到5個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4(27g)用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1(8個(gè)柱 體積）、15:1(8個(gè)柱體積)和5:1(6個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步 驟(d)中組分2(15g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇 水溶液等度洗脫，收集8~12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I) (151mg)〇
[0026] 結(jié)構(gòu)確證：白色無定形粉末;HR-ESIMS顯示[Μ+Na]+為m/z 621.1910,結(jié)合核磁特 征可得分子式為C31H34O12，不飽和度為15。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ρρηι，DMS0_d6，400MHz):H-3 (4.85，s)，H-5(2.80，s)，H-6(4.19，s)，H-ll(6.27，s)，H-14(1.73，dd，J=11.8,7.4)，H-15 (2.63，dd，J=18.8,7.4)，H-15(2.76，dd，J=18.8，11.8)，H-17(5.05，s)，H-18(0.96，s)，H-19(1.39，s)，H-21(7.26，br，s)，H-22(6.17，br，s)，H-23(7.34，t，J=1.7)，H-28(0.98，s)， H-29(0.71，s)，H-30(2.63，s)，H-2'（5.83，dq，J=15.5，1.7)，H-3'（7.07，dq，J=15.5， 7.0)，H-4'（1.94，dd，J = 7.0，1.7)，7-0CH3(3.83，s)，6-OH(3.00，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù) (ppm, DMSO-de ,100MHz) ：208.7(C,1-C) ,78.2(C, 2-0,85.1 (CH, 3-0,39.2(C, 4-0,50.0 (CH，5-C)，68.7(CH，6-C)，175.2(C，7-C)，73.3(C，8-C)，136.8(C，9-C)，51.6(C，10-C)， 125.7(CH，n-C)，202.7(C，12-C)，58.3(C，13-C)，37.6(CH，14-C)，28.3(CH2，15-C)，168.6 (C，16-C)，81.7(CH，17-C)，22.8(CH 3，18-C)，14.6(CH3，19-C)，121.4(C，20-C)，139.9(CH， 21-C)，108.7(CH，22-C)，143.2(CH，23-C)，21.2(CH 3,28-C)，21.7(CH3,29-C)，63.8(CH，30-C)，164.2(C，1'-C)，120.7(CH，2'-C)，147.0(CH，3'-C)，18.1(CH 3,4'-C)，52.8(CH3,7-OCH3);碳原子標(biāo)記參見圖I。紅外光譜顯示該化合物含有羥基和羰基基團(tuán)（3454CHT 1和 1736CHT1)。1H和13CNMR數(shù)據(jù)的分析表明該化合物為檸檬苦素結(jié)構(gòu)，包含四個(gè)叔甲基，一個(gè)甲 氧基，一個(gè)三取代雙鍵，一個(gè)三取代的環(huán)氧乙烷，兩個(gè)酮羰基，兩個(gè)酯羰基，一個(gè)2-丁烯酸乙 酯結(jié)構(gòu)以及一個(gè)β-單取代呋喃環(huán)。HMBC譜中，]\^-19〇!11.39,8)和!1-3〇0!12.63,8)與(：-1(5 C208.7)的相關(guān)性表明C-I為酮羰基。兩個(gè)含氧碳信號(hào)（SC78.2，2-C;63.8，30-C)以及質(zhì)子信 號(hào)（δΗ2.63，s，Η-30)表明該化合物含有一個(gè)30，2-環(huán)氧基團(tuán)。此外，2-丁烯酸乙酯結(jié)構(gòu)與C-3 0〇85.1)位相連；腿8(：譜中，!1-3(3!14.85,8)，!1-2'（3!15.83，(^，了=15.5，1.7!^)和!1-3'（5 !17.〇7，(^，1=15.5,7.〇抱）與(：-1'0(：164.2)的相關(guān)性驗(yàn)證了上述推論。!1-2'和!1-3'之間的 耦合常數(shù)(J = 15.5Hz)表明2-丁烯酸乙酯結(jié)構(gòu)為E構(gòu)型。HMBC譜中，-OCH3(δΗ3.83，s)與C-7 0(：175.2)，!1-60!14.19,8)與(：-50〇5〇.〇)和(：-7的相關(guān)性表明(：-60〇68.7)連有一個(gè)甲氧 羰基片段。此外，6-OH(3.00，s)與C-5，C-6和C-7的相關(guān)性表明C-6位還連有一個(gè)羥基。根據(jù) HMBC 譜中 H-170H5.O5，s)與 〇2〇0(：121.4)，(：-210(：139.9)和(：-22(5(：1〇8.7)的相關(guān)性，可 推斷呋喃環(huán)位于C-17位上。ROESY譜中，H-5與Me-29,以及H-5與H-17的相關(guān)性表明它們?yōu)棣?構(gòu)型。此外，Η-14與Me-18的交叉峰表明Me-18和Η-14是α構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和 ROESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一 步通過E⑶試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致(圖2)。
[0027]實(shí)施例2:化合物（I)藥理作用試驗(yàn) [0028] -、材料和儀器
[0029] 人Α375黑色素瘤細(xì)胞株由第三軍醫(yī)大學(xué)贈(zèng)?；衔铮↖)自制，制備方法見實(shí)施例1， HPLC歸一化純度大于98% JMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶購自美國Gibco公司。ΜΤΤ(3-(4,5-二甲 基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽；四甲基偶氮唑藍(lán)）、DMS0(二甲基亞砜）、BrdU購自美國 Sigma公司。鼠抗BrdU多克隆抗體購自美國ABcam公司。山羊抗鼠二抗購自美國Cel 1 signaling公司。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Promega公司。
[0030] 恒溫CO2培養(yǎng)箱，普通冰箱，-80度冰箱均為美國Forma公司產(chǎn)品。超凈工作臺(tái)（中國 蘇州凈化工程公司）。倒置顯微鏡，倒置熒光顯微鏡(Olympus公司）。電熱恒溫培養(yǎng)箱（中國 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。自動(dòng)酶標(biāo)儀（日本W(wǎng)ako公司）。紫外分光光度儀(美國Beckman公司）。 J6-HC高速離心機(jī)(美國Beckman公司）。低溫微量離心機(jī)(德國Eppendorf公司）。振蕩搖床 (美國Forma公司）。
[0031]二、試驗(yàn)方法 [0032] 1、細(xì)胞培養(yǎng)