Millipore#PHCC00000)計數(shù)測定細 胞密度。將細胞稀釋成每毫升含44, 000個細胞的溶液。調(diào)整密度后的細胞溶液以每孔90 微升加入細胞實驗板中。孔板置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時后加入不同濃度的待 試化合物。細胞在10%胎牛血清存在下與化合物一起培養(yǎng)72小時。使用CellTiter-Glo? LuminescentCellViabilityAssaykit(見廠家說明書）測定ATP的含量來評估細胞生 長抑制。簡要來講，每個孔中加入30y1CeMT'iter-G丨試劑，搖板10分鐘，誘導細胞裂 解，用FluoroskanAscentFL(Thermo)檢測記錄螢光信號。從二甲基亞砜處理72小時的 細胞得到最大的信號值。從單獨的培養(yǎng)基（細胞數(shù)為零）得到最小信號值。抑制率％= (最大信號值-化合物信號值V(最大信號值-最小信號值）X100。使用GraphPadPrism V5. 0(GraphPadSoftware,SanDiego,CA)軟件處理數(shù)據(jù)。通過S形劑量-反應曲線擬合計 算IC5。值。
[0148] 2、實驗結(jié)果
[0149] 上述實驗結(jié)果如下表所示。
[0150] 表2腫瘤細胞增殖抑制結(jié)果
[0151]
[0152] 注：1 表示IC5?！?yM，II表示 5yM彡IC5。〉1yM，III表示 1yM彡IC50> 0? 5yM，IVg示 0? 5yM>IC50> 0? 1yM，Vg示IC50< 0? 1yM。
[0153] 從上述結(jié)果我們可以看出，本發(fā)明提供的化合物對SW620、ZR-75-1、MDA-MB-231 腫瘤細胞株均有抑制活性，且部分化合物活性較高。
[0154] 三、細胞周期抑制實驗
[0155] 1、實驗方法
[0156] 本實驗采用的細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（Beyotime，C1052)是一種采用經(jīng) 典的碘化丙啶染色（Propidiumstaining，即PIstaining)方法進行細胞周期與細胞凋亡 分析的檢測試劑盒。碘化丙啶（Propidium，簡稱PI)是一種雙鏈DNA的熒光染料。碘化丙 啶和雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光，并且熒光強度和雙鏈DNA的含量成正比。細胞內(nèi)的DNA 被碘化丙啶染色后，可以用流式細胞儀對細胞進行DNA含量測定，然后根據(jù)DNA含量的分布 情況，可以進行細胞周期和細胞凋亡分析。
[0157] 將MDA-MB-231細胞按每孔3X105個接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24小時。加入待試 化合物或參照物（PD-0332991或LY2835219) 24h后，lOOOrcf離心3min收集細胞，PBS(磷 酸鹽緩沖溶液）洗兩次；加入預冷的70%乙醇4°C固定過夜，lOOOrcf離心lOmin，1XPBS洗 兩次；加入PI染色液染色30min;用流式細胞儀檢測并分析細胞周期G1阻滯。
[0158] 2、實驗結(jié)果
[0159] ⑶K4和⑶K6在腫瘤細胞周期中與cyclinD結(jié)合促使G1期進入S期。⑶K4/6抑 制劑選擇性阻滯腫瘤細胞G1期進入S期。流式細胞術檢測MDA-MB-231乳腺癌細胞周期結(jié) 果表明，本發(fā)明提供的CDK4/6抑制劑化合物以濃度依賴方式使G1期細胞生長停止和S期 細胞減少，如下表所示。
[0160] 表3細胞周期實驗結(jié)果
[0161]
[0162] 四、蛋白免疫印跡（WesternBlot)實驗
[0163] 1、實驗方法
[0164] MDA-MB-231單層培養(yǎng)生長，加入待試化合物或參考化合物（PD-0332991或 LY2835219)培養(yǎng)培養(yǎng)16小時后，用預冷的PBS洗兩次，收集細胞，用生物樣品均質(zhì)器勻漿 2-3次，13,OOOrpm于4°C離心10min，取上清液。采用Branfor法測定蛋白濃度，加入上樣緩 沖液（Beyotime，#P0015L)于100°C煮8min，以8% -10%SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至 ?乂〇?膜，膜用含5%的脫脂奶粉封閉451^11，加一抗|3-&(^111化31'，#4970)、詘(020)1^此^ mAb(CST，#9313)、Phospho_Rb(Ser780) (D59B7)RabbitmAb(CST，#8180)于4°C下孵育過夜， 然后用TBST液洗膜 3X10min。以熒光二抗IRDye@680CWGoat(polyclonal)Anti-Rabbit lgG(H+L)，HighlyCrossAdsorbed(LI-C0R，#926-68071)室溫下避光孵育 2h后再洗膜，洗 滌條件同上。最后將膜置于LI-C0ROdyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)上檢測成像，結(jié)果如圖 1所示。
[0165] 2、實驗結(jié)果
[0166] ⑶K4/6可通過將腫瘤抑制蛋白Rb蛋白磷酸化而使Rb蛋白失去對細胞周期的阻滯 作用。CDK4/6抑制劑可阻止腫瘤抑制蛋白Rb的失活從而恢復Rb對細胞周期的阻滯作用。 由圖1中可以看出，本發(fā)明提供的化合物1、2作用于MDA-MB-231乳腺癌細胞，能有效降低Rb在Ser780位點的磷酸化。
[0167] 實施例7藥代動力學（PK)實驗
[0168] 1、實驗方法
[0169] 雄性SD大鼠，體重300-350克，試驗前過夜禁食。待試化合物溶解在30 %磺丁 基-f3-環(huán)糊精（SBE-0-⑶）中，以20mg/kg灌胃給藥。給藥后15分鐘、30分鐘和1、2、3、 4、6、8及24小時尾端斷口取血，每時間點約0. 3ml，置于含K2-EDTA的離心管中，離心處理 (2, 000g，10分鐘，4°C)取血衆(zhòng)，儲存在-80°C的超低溫冰箱中。取50yL的血漿樣品與5 微升內(nèi)標（IS)混合，用乙酸乙酯萃取。真空干燥后殘留物重新溶于乙腈中。對樣品進行過 濾，并注入到LC-MS/MS分析，測定待試化合物的濃度。
[0170] 2、實驗結(jié)果
[0171] 結(jié)果如下表和圖2-4所示。
[0172] 表4藥代動力學實驗結(jié)果：
[0173]
[0174] 表中：T_是指達峰時間，C_是指最大血藥濃度，T1/2為半衰期，AUClast是指0-24 小時時間-濃度曲線下面積，AUCinf是指0-Inf時間-濃度曲線下面積。
[0175] 從上述結(jié)果中可以看出，本發(fā)明提供的化合物1、2經(jīng)灌胃給藥后，吸收良好，血液 暴露量高。與對照物H)-0332991比較，該類化合物C_高了約4-7倍，AUC大了約3-9倍。 一期臨床結(jié)果顯示，palbociclib(PD-0332991) 口服吸收血液暴露量較低，由于消除半衰期 長（平均值25. 9小時），重復每天給藥導致藥物蓄積（KeithT，etal.ClinCancerRes 18:568, 2011)。化合物1、2 口服吸收好，Cmax和AUC顯著提高，而半衰期相對較短。
[0176] 實施例8藥效學實驗
[0177] 1、實驗方法
[0178] 從中國科學院上海細胞庫獲取MDA-MB-435乳腺癌細胞。凍存的細胞在37°C的水 浴中解凍后放置加入10%胎牛血清（FBS)、1%胰島素（上海寶曼生物科技有限公司）的 RPMI1640培養(yǎng)基中，在5%C02的組織培養(yǎng)孵化器培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當細胞培養(yǎng)達到所需的 數(shù)量，細胞收集后，用不含血清的Dulbecco磷酸鹽緩沖液（DPBS)清洗。將懸浮在0. 1毫升 的RPMI1640中3. 5X106個細胞和0? 1毫升ECMgel(Sigma-Aldrich)注入每只小鼠右后 側(cè)翼皮下區(qū)域并小心避開血管。成功移植的提示是在皮膚下形成一個圓形凸出的團塊。在 植入兩周左右即可測量出腫瘤大小。使用卡尺測量腫瘤的大小。并用以下公式計算腫瘤體 積：腫瘤體積=(長X寬2)/2,腫瘤生長變化率（T/C% ) = 100XAT/AC。
[0179] 2、實驗結(jié)果
[0180] ro-0332991以150mg/kg每日一次口服給藥第6天后平均體重明顯下降，隨后 將劑量調(diào)整為l〇〇mg/kg，每日一次口服給藥?；衔?以75mg/kg每日兩次口服給藥， H)-0332991和化合物1給藥2周后停止給藥，并繼續(xù)觀察腫瘤大小和體重變化。
[0181] 結(jié)果如圖5和圖6所示，圖5為腫瘤體積大小變化曲線圖，圖6為小鼠體重變化曲 線圖。H)-0332991和化合物1抑制腫瘤生長，給藥14天后，PD-0332991和化合物1的T/C 值分別為41 %和25%。提示最大耐受量時化合物1比H)-0332991抗癌活性更高和安全性 更大。停藥后第6天（即D20)，H)-0332991和化合物1的T/C值分別為35%和32%。提 示兩者作用較長。
[0182] 以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實 施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存 在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。
[0183] 以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來 說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護 范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1. 式I所示的嘧啶或吡啶并吡啶酮類化合物或者其藥學上可接受的鹽或立體異構 體：其中：Y選自：C或N，且當Y選取N，則無R6取代； R1選自：C1-C6烷基，C3-C6環(huán)烷基，C3-C6環(huán)烷基取代甲基； R2選自：鹵素，C0R5,COOR5; R3選自：H，C1-C6烷基； R4選自：C1-C6烷基，羥基取代C1-C6烷基，烷氧基取代C1-C6烷基，苯基，鹵素取代苯 基； R5選自：H，C1-C6烷基，C1-C6含氟烷基；C3-C6環(huán)烷基； R6 選自：H，F(xiàn)，CN，CH3; m選自：0，1或2 ; n選自：1，2或3 ; P選自：1，2或3。2. 根據(jù)權利要求1所述的嘧啶或吡啶并吡啶酮類化合物或者其藥學上可接受的鹽或 立體異構體，其特征在于， R4選自：C1-C6烷基，羥基取代C1-C6烷基，烷氧基取代C1-C6烷基。3. 根據(jù)權利要求2所述的嘧啶或吡啶并吡啶酮類化合物或者其藥學上可接受的鹽或 立體異構體，其特征在于， R4選自：甲基，乙基，丙基，異丙基。4. 根據(jù)權利要求1所述的嘧啶或吡啶并吡啶酮類化合物或者其藥學上可接受的鹽或 立體異構體，其特征在于， m選自;n選自：2 ; P選自：1或2。5. 根據(jù)權利要求1所述的嘧啶或吡啶并吡啶酮類化合物或者其藥學上可接受的鹽或 立體異構體，其特征在于， Y選自：N。6. 根據(jù)權利要求1-5任一項所述的嘧啶或吡啶并吡啶酮類化合物或者其藥學上可接 受的鹽或立體異構體，其特征在于， R1選自：C3-C6環(huán)烷基； R2 選自：COR5; R3選自：C1-C6烷基； R5選自：C1-C6烷基； R6選自：H。7. 根據(jù)權利要求6所述的嘧啶或吡啶并吡啶酮類化合物或者其藥學上可接受的鹽或 立體異構體，其特征在于， 札選自：環(huán)戊基； R2 選自：COR5; R3選自：甲基； R5選自：甲基，乙基； R6選自：H。8. 根據(jù)權利要求1所述的嘧啶或吡啶并吡啶酮類化合物或者其藥學上可接受的鹽或 立體異構體，其特征在于，選自如下化合物：9. 權利要求1-8任一項所述的嘧啶或吡啶并吡啶酮類化合物或者其藥學上可接受的 鹽或立體異構體在制備防治腫瘤藥物中的應用。10. 根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征在于：所述腫瘤為實體腫瘤和血液腫瘤。11. 根據(jù)權利要求10所述的應用，其特征在于：所述實體腫瘤和血液腫瘤包括乳腺癌， 脂肪肉瘤，非小細胞肺癌，肝癌，卵巢癌，膠質(zhì)母細胞瘤，黑素瘤，多發(fā)性骨髓瘤和套細胞淋 巴瘤。12. 根據(jù)權利要求11所述的應用，其特征在于：所述乳腺癌包括：在絕經(jīng)后女性雌激素 受體陽性和/或人表皮生長因子受體2陰性的局部晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌。13. -種防治腫瘤的藥物組合物，其特征在于，包括作為活性成份的權利要求1-8任一 項所述的嘧啶或吡啶并吡啶酮類化合物或者其藥學上可接受的鹽或立體異構體，以及藥學 上可接受的載體。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種式Ⅰ所示的嘧啶或吡啶并吡啶酮類化合物及其應用，屬于藥物制備技術領域。該類化合物能夠選擇性的抑制細胞周期依賴性激酶(Cdks)CDK4和CDK6，而對CDK2激酶幾乎無抑制活性，因此，該類化合物可用于CDK4和CDK6所參與的細胞周期控制失調(diào)導致各種疾病，特別是惡性腫瘤的治療中。
【IPC分類】A61K31/55, A61P35/02, A61P35/00, C07D471/04, A61K31/4545, A61K31/519
【公開號】CN105130986
【申請?zhí)枴緾N201510646418
【發(fā)明人】蔡雄, 錢長庚, 李軍旗, 卿遠輝, 王艷艷, 薛偉才, 游華金
【申請人】廣州科擎新藥開發(fā)有限公司
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年9月30日