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重組表達(dá)載體、工程菌、制備方法及其應(yīng)用與流程

文檔序號(hào):12056454閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種重組載體,其特征在于,含有IL-18基因片段;所述IL-18基因片段的序列如SEQ ID No.1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體,其特征在于,所述質(zhì)粒載體為pBV220。

3.一種工程菌,其特征在于,整合有如權(quán)利要求1或2所述的重組載體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的工程菌,其特征在于,宿主菌為大腸桿菌DH5α菌株。

5.利用如權(quán)利要求1或2所述的重組載體制備IL-18的方法,其特征在于,包括如下步驟:

步驟1:構(gòu)建獲得工程菌;所述工程菌整合有如權(quán)利要求1或2所述的重組載體;

步驟2:取所述工程菌,經(jīng)活化、發(fā)酵、誘導(dǎo)培養(yǎng),獲得包涵體;

步驟3:取所述包涵體,經(jīng)洗滌、溶解、復(fù)性后,經(jīng)純化、活性測(cè)定,獲得IL-18。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,步驟3中所述純化具體為經(jīng)羥基磷灰石層析柱層析,收集目的峰蛋白,再經(jīng)Sephacryl S-200-HR凝膠層析柱層析,收集100min~120min間出現(xiàn)的蛋白峰。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述羥基磷灰石層析柱層析上樣液的流速為10-20ml/min;用平衡液充分流洗雜蛋白到基線后,分別用含0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L和1.0mol/L NaCl的平衡液洗脫,收集洗脫峰,經(jīng)SDS蛋白電泳鑒定,目的蛋白存在于0.1mol/L NaCl洗脫峰中;

Sephacryl S-200-HR凝膠層析柱層析上樣液的流速為2-5ml/min。

8.根據(jù)權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,步驟1中所述重組載體的構(gòu)建方法為含IL-18的基因用EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ雙酶切,與用EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ雙酶切的載體pBV220連接,構(gòu)建含IL-18基因的重組載體pBV220-IL-18;

所述工程菌的構(gòu)建方法為取所述重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,構(gòu)建獲得工程菌株DH5α-pBV220IL-18;

步驟2中的所述活化具體為:取所述工程菌接種到含Amp的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)12~16h;挑取單個(gè)菌落接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)12~16h;

步驟2中所述發(fā)酵具體為:取所述活化獲得的菌液按1~10%(v/v)的比例接種到含Amp的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi),28~32℃搖床培養(yǎng)12~16h;將菌液按5~10%(v/v)的比例接種到發(fā)酵罐內(nèi),28~32℃條件下培養(yǎng)至菌液濃度達(dá)到OD600為2.0-3.0;

步驟2中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)具體為:取所述發(fā)酵獲得的菌液于42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3-6h,同時(shí)持續(xù)補(bǔ)加填料液,所述填料液與所述發(fā)酵獲得的菌液體積比為5%~10%;氨水自動(dòng)調(diào)節(jié)pH7.0;

所述填料液以1000ml為單位按下列比例配制:

蛋白胨 100g

酵母提取物 100g

葡萄糖 200g(700ml水溶解單獨(dú)高壓,8磅)

所述獲得包涵體具體為:取所述誘導(dǎo)培養(yǎng)后的培養(yǎng)液離心收集菌體,用TE緩沖液懸浮,冰浴條件下,高壓勻漿破碎菌體,反復(fù)4次;離心破碎后的菌體,收集沉淀,即為包涵體;

步驟3中所述溶解具體為:按照2-10%(v/v)的比例加入包涵體溶解液,4℃條件下,磁力攪拌溶解5-10h;4℃,9000rpm,離心10min,收集上清液;

所述包涵體溶解液以1000ml為單位按下列比例配制:

8mol尿素 480g

10mM DTT 1.65g

用20mmol PB緩沖液(pH7.0-8.0)定容到100

步驟3中所述復(fù)性具體為:按照10-20%的比例緩慢加入包涵體復(fù)性液,使蛋白濃度降到0.2%,4℃復(fù)性12-20h;

所述包涵體復(fù)性液以1000ml為單位按下列比例配制:

20mmol PB緩沖液(pH7.0-8.0) 1000ml

DTT(20mM) 3.1g。

9.根據(jù)權(quán)利要求5至8任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,步驟3所述活性測(cè)定具體為:

人白血病細(xì)胞KG1細(xì)胞傳代培養(yǎng):用含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基,5%CO2,37℃培養(yǎng)U937細(xì)胞;當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2×106個(gè)細(xì)胞/ml時(shí)傳代;傳代細(xì)胞密度為4×105細(xì)胞/ml;

將hrIL-18用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基配制成50nmol備用;取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,于前5列每孔加100μl 20%FCS 1640培養(yǎng)基配制的細(xì)胞密度為2×106細(xì)胞/ml,A、B、C、D排加ConA,終濃度為0.5mg/L;E、F、G、H孔不加ConA;于第1-5列每孔內(nèi)分別加入100μl 10倍稀釋的hrIL-18,混勻,第一列終濃度為25nmol;(每個(gè)稀釋度4孔);混均后,將細(xì)胞培養(yǎng)板置37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)24h;

用ELISA法測(cè)IFN-γ效價(jià)收集培養(yǎng)上清,獲得IL-18活性。

10.根據(jù)權(quán)利要求5至9任一項(xiàng)制得的IL-18在制備治療眼底血管病變的藥物中的應(yīng)用。

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