本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,具體為一種特異性抑制padi2基因表達的sirna及其重組載體和應(yīng)用。
背景技術(shù):
rna干擾(rnainterference,rnai)是動植物中廣泛存在的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制。1998年美國科學(xué)家andrewfire在秀麗新小桿線蟲c.elegans體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)將正義鏈和反義鏈的混合物(即dsrna)所產(chǎn)生的基因沉默效應(yīng)至少10倍于反義核苷酸的抑制作用,而且能在子代中誘導(dǎo)出同樣的基因抑制現(xiàn)象。對rnai現(xiàn)象的機理研究表明,微量sirna即能通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默使大量靶rna沉默,而這種高效、特異降解同源rna從而導(dǎo)致序列特異性基因沉默的關(guān)鍵性分子是長為21-23堿基的小雙鏈寡核苷酸,也稱作小干擾rna(sirna)。進一步研究發(fā)現(xiàn)短于21bp或者長于25bp的雙鏈rna均不能有效啟動rnai,而且其中只要有一個堿基錯配,基因沉默的效應(yīng)就明顯減退甚至消失,充分體現(xiàn)了sirna作用的特異性。
顯示出強大基因沉默效能的sirna作為近年來生物技術(shù)的重大發(fā)現(xiàn)而備受矚目,正是因為它具有特異性和高效性阻斷同源基因的基因抑制功能,是基因功能研究強有力的工具。sirna具有許多傳統(tǒng)方法無法比擬的優(yōu)勢和特點。目前雖然已有一些抑制特定基因表達的方法,如反義rna、基因敲除(knockout)等,但sirna顯示出了明顯優(yōu)于這些技術(shù)的優(yōu)勢:與反義rna相比,它具有更高的特異性和持續(xù)性;與復(fù)雜耗時的基因敲除相比,sirna是更簡便有效的手段。目前利用sirna作為基因沉默的方法被廣泛用于惡性腫瘤機制的研究,研究的關(guān)鍵點主要集中在如何提高基因沉默效能,包括靶基因位點選擇、導(dǎo)入系統(tǒng)的優(yōu)化和對宿主細胞功能的影響等,并由此推動了以該技術(shù)為基礎(chǔ)的腫瘤特異高效靶向治療策略的研發(fā)進程。
卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一,其病死率居各類婦科腫瘤的首位。卵巢癌治療最大的障礙是腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生,特別是出現(xiàn)多藥耐藥。隨著鉑類/泰素藥物聯(lián)合化療的實施,卵巢癌的初次化療反應(yīng)率可達80%。但大多數(shù)患者在2~3年內(nèi)復(fù)發(fā)。對復(fù)發(fā)后卵巢癌,即使再采用作用機制完全不同的化療藥物,也產(chǎn)生耐藥,從而使腫瘤治療后生存率得不到顯著的提高。晚期卵巢癌的五年生存率始終徘徊在20~30%。高復(fù)發(fā)率和復(fù)發(fā)后的高耐藥率是卵巢癌高死亡率最主要的原因之一,尋找卵巢癌化療耐藥的解決方案是目前腫瘤研究的重要課題。
分子靶向藥物和化療聯(lián)合應(yīng)用是目前提高惡性腫瘤患者生存率最有前景的治療方法。padi2(peptidylargininedeiminase2)是肽基精氨酸脫亞氨酶家族的一員,基因位于染色體1p36.13,padi2能催化蛋白質(zhì)在翻譯后去亞氨基,將精氨酸殘基轉(zhuǎn)換為瓜氨酸。padi2具有不同的底物特異性和組織特異性表達模式,已知的底物包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂堿蛋白、骨骼肌和巨噬細胞中的波形蛋白等。padi2最早被認為在神經(jīng)退行性疾病包括阿爾茨海默氏病和多發(fā)性硬化癥的發(fā)病和發(fā)展中起作用。近年來,陸續(xù)有一些研究在乳腺癌、宮頸鱗狀細胞癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌組織中都檢測到padi2的表達增高,雖然到目前為止padi2在腫瘤發(fā)生中的具體功能及其作用機制尚不清楚,但padi2參與了腫瘤的發(fā)展進程已經(jīng)被逐步認識。我們先期的研究表明在卵巢癌細胞中padi2也有高表達,并且發(fā)現(xiàn)在卵巢癌紫杉醇耐藥細胞株a2780/taxol中有異常升高的現(xiàn)象,但該基因是否與卵巢癌發(fā)病和卵巢癌耐藥有關(guān)還有待進一步研究。因此,采用rnai技術(shù)對卵巢癌耐藥細胞株中padi2基因表達進行干擾,將是對卵巢癌發(fā)病機制的重要補充,是對卵巢癌及其耐藥治療的重要探索和應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供一種特異性抑制padi2基因表達的sirna,用于卵巢癌發(fā)病機制研究。本發(fā)明的另一個目的在于提供該sirna在制備治療卵巢癌和逆轉(zhuǎn)卵巢癌紫杉醇耐藥的藥物中的應(yīng)用。
為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
本發(fā)明設(shè)計、合成3對特異性抑制padi2基因表達的sirna,轉(zhuǎn)染到卵巢癌紫杉醇耐藥細胞株a2780/taxol中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)s1抑制padi2基因表達的干擾效果最明顯。
本發(fā)明提供了一種特異性抑制padi2基因表達的sirna(s1),包括正義鏈和反義鏈,
所述正義鏈:5’-aauguacagaacuaucucgua-3’(seqidno.1);
所述反義鏈:5’-cgagauaguucuguacauuuc-3’(seqidno.2)。
作為優(yōu)選,所述正義鏈和反義鏈的5’和3’端的3個堿基進行2’-甲氧基修飾。本發(fā)明研究證明,2’-甲氧基修飾后的sirna(s1)穩(wěn)定性增加,能提高其在體內(nèi)抵抗核糖酶的水解的能力,降低免疫刺激反應(yīng),延長sirna干擾基因表達下調(diào)的作用時間,使其作用具有高效性、特異性。
本發(fā)明提供了一種包含編碼所述sirna的dna序列的rna干擾試劑盒。所述試劑盒中包含克隆了所述sirna的dna質(zhì)粒載體,應(yīng)用時,該質(zhì)粒載體在真核細胞中轉(zhuǎn)錄表達所述的sirna,進而沉默padi2基因的表達。
本發(fā)明提供了一種含有編碼所述sirna的dna序列的重組載體。作為優(yōu)選,采用的原始載體為慢病毒載體plko.1puro。
本發(fā)明還提供了重組載體的構(gòu)建方法,包括:
(1)合成padi2-s1片段,選擇agei和ecori兩個酶切位點,根據(jù)s1的序列,設(shè)計其shrna序列,序列如下:
正義鏈:
5’-ccgggtaatgtacagaactatctcgtattcaagagatacgagatagttctgtacatttcttttttggtacc-3’(seqidno.7);
反義鏈:
5’-aattggtaccaaaaaagaaatgtacagaactatctcgtatctcttgaatacgagatagttctgtacattac-3’(seqidno.8);
(2)退火得到padi2-s1的dna片段;
(3)用慢病毒載體plko.1puro構(gòu)建plko.1-padi2-sh1重組載體。
本發(fā)明提供的sirna能夠高效特異性抑制卵巢癌細胞padi2基因的表達,減少細胞增殖,增加細胞凋亡,降低細胞遷移和侵襲能力,因此,所述sirna和重組載體作為padi2基因表達抑制劑可以應(yīng)用于腫瘤疾病發(fā)病機制的研究當(dāng)中。
本發(fā)明提供了所述sirna和重組載體在制備padi2基因表達抑制劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了所述sirna和重組載體在制備治療卵巢癌、乳腺癌、宮頸鱗狀細胞癌、結(jié)腸癌、肝癌或肺癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明研究表明,紫杉醇耐藥株a2780/taxol轉(zhuǎn)染所述sirna后,該細胞株對紫杉醇的敏感性明顯提高,逆轉(zhuǎn)指數(shù)為14.39,說明本發(fā)明提供的sirna對紫杉醇耐藥株a2780/taxol的耐藥具有非常顯著的逆轉(zhuǎn)效果,因此,所述sirna對逆轉(zhuǎn)卵巢癌紫杉醇耐藥的治療具有潛在應(yīng)用價值。
本發(fā)明提供了所述的sirna和重組載體在制備逆轉(zhuǎn)卵巢癌紫杉醇耐藥的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明具備的有益效果:
本發(fā)明提供的sirna能夠特異性、高效地抑制padi2基因的mrna和蛋白表達,減少腫瘤細胞增殖,增加細胞凋亡,降低腫瘤細胞遷移和侵襲能力,并能有效逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞對紫杉醇的耐藥。將其應(yīng)用于腫瘤發(fā)病機制研究以及制備腫瘤治療及逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥治療的藥物中,具有重要意義。
附圖說明
圖1為qrt-pcr檢測a2780細胞和a2780/taxol細胞padi2mrna表達。
圖2為westernblotting檢測a2780細胞和a2780/taxol細胞padi2蛋白表達。
圖3為qrt-pcr檢測s1,s2,s3轉(zhuǎn)染48h后a2780/taxol細胞padi2mrna表達。
圖4為westernblotting檢測s1,s2,s3轉(zhuǎn)染72h后a2780/taxol細胞padi2蛋白表達。
圖5為plko.1-padi2-sh1重組質(zhì)粒及插入酶切位點示意圖。
圖6為小發(fā)卡shrna示意圖。u6啟動子指導(dǎo)下游小發(fā)卡shrna的轉(zhuǎn)錄;包括23個s1正義鏈堿基,23個s1反義鏈堿基。
圖7為westernblotting檢測轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1后a2780/taxol細胞padi2蛋白表達。
圖8為相差顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1后a2780/taxol細胞數(shù)量和形態(tài)變化。
圖9為溴標法檢測轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1后a2780/taxol細胞的增殖。
圖10為caspase3活性檢測轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1后a2780/taxol細胞的凋亡。
圖11為細胞劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1后a2780/taxol細胞遷移能力。
圖12為transwell檢測轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1后a2780/taxol細胞遷移能力和侵襲能力。
圖13為轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1后a2780/taxol細胞對紫杉醇耐藥的逆轉(zhuǎn)。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。以下的實施例中采用的方法目的是更好地理解本發(fā)明,但并不限于本發(fā)明。如無特殊說明,實施例中涉及的實驗方法均為常規(guī)方法,所用的實驗材料均為常規(guī)試劑公司購買。
采用spss18.0統(tǒng)計分析軟件,各樣本數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差
卵巢癌細胞株a2780及卵巢癌紫杉醇耐藥細胞株a2780/taxol由浙江省女性生殖健康研究重點實驗室細胞庫保存;
鼠抗人padi2一抗(cat.66386-1-ig)、鼠抗人gapdh一抗(cat.60004-1-ig)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠igg(h+l)二抗(cat.sa00001-1)均購自proteintech公司;
westernblottingluminolreagent檢測試劑盒(cat.sc-2048)購自santacruz公司;
cdna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒primescripttmrtmastermix(cat.rr036a)、熒光定量pcr檢測試劑盒sybrpremixextaq(perfectrealtime,cat.drr041a)購自takara公司;lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒(cat.l3000008)購自invitrogen公司;
真核表達載體選擇rnai載體plko.1puro,源于全球科學(xué)家質(zhì)粒共享非盈利組織addgene;
限制性內(nèi)切酶agei(cat.r0552s)、ecori(cat.r0101s)、kpni(cat.r0142s)購自neb公司;t4連接酶(cat.2011a)、dna片段純化試劑盒(cat.9761)、dna凝膠回收試劑盒(cat.9762)、質(zhì)粒dna小量純化試劑盒(cat.9760)均購自takara公司;
sirna由takara公司合成;pcr引物及克隆用dna由上海生工生物工程公司合成;
預(yù)染蛋白marker(cat.26616)購自fermentas公司;
溴標法細胞增殖檢測試劑盒cellproliferationelisa,brdu(colorimetric,cat.11647229001)購自roche公司;
caspaceassaysystem(colorimetric,cat.g7351)購自promega公司;
細胞遷移、侵襲模型transwellpermeablesupports(cat.3428)購自corning公司;
lab-tekiichamberslidesystem—lab-tek腔室玻片系統(tǒng)購自nunc公司(cat.154526);
bdmatrigeltmbasementmembranematirx基質(zhì)膜(cat.356234)購自bd公司;
sirna陰性對照allstarsnegativecontrolsirna(cat.1027281)購自qiagen公司;
sds-page凝膠配置試劑盒(cat.cw0022m)購自康為世紀公司;
0.45umpvdf膜(cat.ipvh00010)購自millipore公司;
紫杉醇(cat.p106868)購自aladdin公司。
實施例1.卵巢癌細胞株a2780及其紫杉醇耐藥細胞株a2780/taxol中padi2表達差異的研究
一、實時熒光定量rt-pcr(qrt-pcr)檢測padi2基因mrna表達
培養(yǎng)48h后吸棄6孔板中的培養(yǎng)基,用pbs洗滌兩次后用trizol抽提總rna,thermonanodrop2000分光光度儀測定rna濃度,并按sybrpremixextaq(perfectrealtime)試劑盒說明書操作。第一步rna變性。反應(yīng)體系:rna0.5ug,去rna酶depc水補足至6.8ul;反應(yīng)條件:70℃孵育10min后置于冰上。第二步逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系:按照primescriptrtmastermix試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄;反應(yīng)條件:42℃孵育60min,85℃滅活5min后,-20℃保存。
取1ul逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行熒光定量pcr反應(yīng)。pcr引物序列:
5’-gtggaggcggtgtacgtg-3’;
5’-ggaatgctcccttcctcgtc-3’,產(chǎn)物長度:272bp;
反應(yīng)條件:95℃10s,95℃5s,6℃30s,共40個循環(huán)。
采用2-△ct法計算各組樣本中padi2mrna的表達量。
結(jié)果:如圖1所示,a2780/taxol細胞和它的親本細胞a2780相比,padi2mrna表達增高了78.17%(p<0.05),表明在紫杉醇耐藥細胞株中padi2mrna表達顯著增高。
二、westernblotting檢測padi2蛋白表達
培養(yǎng)72h后吸棄6孔板中的培養(yǎng)基,pbs洗滌3次,加入ripa蛋白裂解液(100ul/孔),吹打數(shù)次,冰上孵育5min,使之充分裂解,4℃,12000轉(zhuǎn)離心5分鐘,收集上清,分裝-20℃貯存;每個樣品95℃變性5min后取10ul上樣,8%sds-page電泳,200v,10min;100v,100min;轉(zhuǎn)至pvdf膜:110v,120min;用含5%脫脂奶粉的tbs封閉液封閉60min;一抗孵育:padi2一抗(1:2000)、gapdh一抗(1:5000)室溫下孵育2h;tbs洗膜10min×3次;二抗孵育:辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠igg(h+l)二抗(1:10000)孵育1h;tbst洗膜10min×3次,tbs洗膜10min×1次;ecl顯影后,用imagequantlas4000mini(gehealthcare)對圖象掃描處理。
結(jié)果:如圖2所示,a2780/taxol細胞和它的親本細胞a2780相比,padi2蛋白表達也顯著增高(p<0.05)。
實施例2.padi2sirna設(shè)計合成
在genebank中查獲padi2基因mrna序列(nm_007365.2),用sidirectver2.0軟件(http://sidirect2.rnai.jp/)在線設(shè)計獲得3對sirna序列(如seqidno.1-seqidno.6)所示。設(shè)計過程中選擇同時滿足文獻報道的三種算法(ui-tei×reynolds×amarzguioui)的序列,并選擇sirna作用特異性最高的23nt長度片段,該設(shè)計可避免將來體內(nèi)實驗時發(fā)生干擾素樣免疫反應(yīng),選擇起始密碼子后100nt,避開5’和3’端utr區(qū),gc含量控制在30-70%。共選擇3對23nt長度的sirna作為實驗篩選干擾片段,結(jié)構(gòu)特征表現(xiàn)為正義鏈和反義鏈3’端各有兩個堿基外掛,結(jié)構(gòu)特點如下
隨后用blastn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)在線進行同源性搜索,排除有同源性的序列,盡可能避免非特異性片段對sirna特異性作用效應(yīng)的影響。
最后在化學(xué)合成時對正義鏈和反義鏈的5’和3’端連續(xù)3個嘌呤(嘧啶)堿基進行2’-ome(2’-甲氧基)修飾,增加sirna分子在細胞內(nèi)的化學(xué)穩(wěn)定性,延長sirna干擾基因表達下調(diào)的時間和效應(yīng)。最終的序列和修飾如表1和式(ⅰ)如下:
表1
實施例3.三對padi2sirna在卵巢癌紫杉醇耐藥株a2780/taxol中對padi2基因干擾效果的檢測和篩選
一、實驗分組:
1.a2780/taxol正常組(不轉(zhuǎn)染sirna),以下稱作ar;
2.a2780/taxol陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照sirna),以下稱作ar-n;
3.a2780/taxol實驗組(轉(zhuǎn)染s1),以下稱作ar-s1;
4.a2780/taxol實驗組(轉(zhuǎn)染s2),以下稱作ar-s2;
5.a2780/taxol實驗組(轉(zhuǎn)染s3),以下稱作ar-s3。
二、分組轉(zhuǎn)染
為確保轉(zhuǎn)染效率,降低細胞毒性,我們采用lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑進行sirna轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前一天,胰酶消化細胞并計數(shù),細胞鋪板在六孔板中,使其在轉(zhuǎn)染日密度0.5×106/ml,細胞融合至70-90%。每孔用125μl無血清opti-mem培養(yǎng)基稀釋5ullipofectamine3000試劑并充分混勻;制備sirna預(yù)混液,用125μl無血清opti-mem培養(yǎng)基稀釋sirna至終濃度為50nm,并充分混勻;在已稀釋的lipofectamine3000試劑中加入sirna預(yù)混液(1:1),室溫孵育5min;最后將sirna-脂質(zhì)體復(fù)合物加入細胞中,37℃,5%的co2中繼續(xù)培養(yǎng)。48h后檢測padi2mrna表達,72h后檢測padi2蛋白表達。
三、實時熒光定量rt-pcr(qrt-pcr)檢測padi2基因mrna表達
檢測步驟同前,采用2-△ct法計算各組樣本中padi2mrna的表達量。
結(jié)果:如圖3所示,a2780/taxol細胞分別轉(zhuǎn)染s1、s2、s3后,padi2mrna的表達均有明顯下降,其中s1干擾效果與陰性對照組比較,padi2mrna下調(diào)了79.46%,與s2(40.84%)和s3(54.73%)相比,有顯著差異(p<0.05)。結(jié)果表明,s1對padi2有最好的干擾效果。
四、westernblotting檢測padi2蛋白表達
檢測步驟同前,ecl顯影后,用imagequantlas4000mini(gehealthcare)對圖象掃描處理。
結(jié)果:如圖4所示,與陰性對照相比,s1轉(zhuǎn)染后,a2780/taxol細胞中padi2蛋白表達顯著下降(p﹤0.05),且與s2和s3相比有顯著差異(p﹤0.05)。結(jié)果表明,在紫杉醇耐藥株a2780/taxol中,s1對padi2的蛋白表達具有最好的干擾效果。故經(jīng)過篩選,s1被選擇作為后續(xù)研究的sirna。
實施例4.真核載體plko.1-padi2-sh1的構(gòu)建及對padi2基因表達的干擾效果檢測
一、實驗分組:
1.a2780/taxol正常組(不轉(zhuǎn)染任何載體),以下稱作ar;
2.a2780/taxol陰性對照組(轉(zhuǎn)染plko.1puro空載體),以下稱作ar-n;
3.a2780/taxol實驗組1(轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1),以下稱作ar-sh1;
二、合成padi2-s1片段
選擇agei和ecori兩個酶切位點,根據(jù)s1的序列,設(shè)計其shrna序列并構(gòu)建到真核表達載體plko.1puro中。序列如下:
正義鏈:
5’-ccgggtaatgtacagaactatctcgtattcaagagatacgagatagttctgtacatttcttttttggtacc-3’(seqidno.7);
反義鏈:
5’-aattggtaccaaaaaagaaatgtacagaactatctcgtatctcttgaatacgagatagttctgtacattac-3’(seqidno.8);
三、真核載體plko.1-padi2-sh1的構(gòu)建
用真核表達載體plko.1puro構(gòu)建plko.1-padi2-sh1重組表達載體(圖5和6),具體方法參見美國冷泉港出版社《分子克隆實驗指南》。
將padi2-s1正義鏈和反義鏈經(jīng)退火程序(95℃變性2min;緩慢冷卻退火至25℃),4℃保存。agei和ecori完全酶切載體plko.1puro,37℃過夜;酶切產(chǎn)物用dna凝膠回收試劑盒回收dna。退火產(chǎn)物與載體酶切回收片段進行連接反應(yīng),反應(yīng)體系(10ul):t4連接酶1ul,t4連接酶緩沖液1ul,退火產(chǎn)物與載體酶切回收片段混合物(摩爾比3:1);去離子水補至10ul,16℃連接過夜;取5ul連接產(chǎn)物置于100uljm109感受態(tài)細菌中,冰浴30min,42℃熱休克90s,冰浴5min,加lb培養(yǎng)基1000ul,37℃搖床培養(yǎng)30min,5000rpm離心5min,棄上清,將細菌均勻涂布于lb平板上(含50ug/ml氨芐青霉素),37℃倒置培養(yǎng)過夜;挑選若干獨立菌落接種于含相應(yīng)抗性的lb培養(yǎng)基中,37℃震蕩過夜擴菌;收集細菌,用質(zhì)粒dna純化試劑盒抽提獲得質(zhì)粒dna,kpni酶切鑒定,獲得plko.1-padi2-sh1重組質(zhì)粒。
四、plko.1-padi2-sh1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后觀察干擾效果
將plko.1-padi2-sh1轉(zhuǎn)染入對數(shù)生長期的a2780/taxol細胞中。轉(zhuǎn)染參照lipofectamine3000操作說明書,每孔用125μl無血清opti-mem培養(yǎng)基稀釋5ullipofectamine3000試劑并充分混勻;在125μl無血清opti-mem培養(yǎng)基中加入5ug重組質(zhì)粒dna,加入p3000試劑10ul,充分混勻,制備重組質(zhì)粒預(yù)混液;在已稀釋的lipofectamine3000試劑中加入重組質(zhì)粒預(yù)混液(1:1),室溫孵育5mim;最后將重組質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物250ul加入細胞中,37℃,5%的co2中繼續(xù)培養(yǎng)。72h后檢測padi2蛋白表達。
如圖7所示,轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1重組質(zhì)粒后,與陰性對照(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒)相比,a2780/taxol細胞中padi2蛋白表達顯著下降(p﹤0.05),結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1重組質(zhì)粒能有效干擾padi2的蛋白表達。
實施例5.轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1特異性阻斷padi2表達后對腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響
一、實驗分組:
1.a2780/taxol正常組(不轉(zhuǎn)染任何載體),以下稱作ar;
2.a2780/taxol陰性對照組(轉(zhuǎn)染plko.1puro空載體),以下稱作ar-n;
3.a2780/taxol實驗組(轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1),以下稱作ar-sh1。
二、分組轉(zhuǎn)染
轉(zhuǎn)染步驟同前,轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)細胞,用于檢測細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲。
三、細胞增殖試驗
細胞在96孔板中轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1后繼續(xù)培養(yǎng)72h,每孔加入10ulbrdu標記液至brdu終濃度為10um,37℃孵育2h;吸除brdu標記液,每孔加入200ulfixdenat,20℃孵育30min;吸除fixdenat,每孔加入100ulanti-brdu-pod,20℃孵育90min;每孔200ulwashingsolution洗滌3次;加入100ul/孔底物溶液,20℃孵育20min,檢測波長370nm(參考波長492nm)測吸光度(a),細胞增殖的能力用a實驗組/a對照組表示。
結(jié)果如圖8和圖9所示,在a2780/taxol細胞中,轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1后,相差顯微鏡下觀察可見,實驗組細胞數(shù)量明顯減少,懸浮細胞數(shù)量增加,細胞碎片增多;溴標法測試細胞增殖結(jié)果顯示:與陰性對照相比,實驗組細胞增殖能力下降了61.73%,有顯著性差異(p<0.05)。說明特異性阻斷padi2的表達后,能抑制腫瘤細胞增殖。
四、caspase3活性檢測細胞凋亡
轉(zhuǎn)染72h后收集細胞,裂解液調(diào)整細胞密度為1×108/ml,冰上裂解15min,15000g×20min,收集上清。按照caspaceassaysystem(colorimetric)說明書同時制備陽性和陰性對照樣品,測定并調(diào)整各組蛋白濃度相同。96孔板中每孔加入caspaceassaybuffer32ul,dmso2ul,100nmdtt10ul,去離子水調(diào)整體積為98ul,加入2uldevd-pna底物,37℃孵育4h,檢測波長405nm測吸光度,用δa法計算每組樣品caspase3活性。
結(jié)果如圖10所示,a2780/taxol細胞轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1后,caspase3活性增加了3.23倍,與陰性對照比較,有顯著性差異(p<0.05),說明特異性阻斷padi2的表達后,能促進腫瘤細胞凋亡。
五、細胞劃痕試驗檢測細胞遷移能力
在六孔板背后用直尺均勻劃橫線,約0.5cm劃一道,橫穿過孔,每孔至少有6條橫線。細胞轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1后,繼續(xù)培養(yǎng)24h細胞融合成單層狀態(tài)時,在選定區(qū)域用200ul的槍頭在六孔板中垂直劃痕,pbs洗3次去除劃下的細胞,加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。0h,24h,48h時間點拍照,隨機選取6條水平線,計算細胞間距離均值。
結(jié)果如圖11所示,plko.1-padi2-sh1轉(zhuǎn)染細胞24h和48h后,a2780/taxol細胞間距離顯著大于陰性對照組,細胞劃痕后愈合能力顯著下降,說明特異性阻斷padi2的表達后,能抑制腫瘤細胞的遷移。
六、transwell試驗檢測細胞遷移能力
細胞轉(zhuǎn)染48h后,用胰酶消化收集,用無血清培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細胞密度為5×105/ml,上室加2ml細胞懸液,下室加10%fbs完全培養(yǎng)基2ml,繼續(xù)培養(yǎng)24h,取出小室,pbs洗3次,用棉簽小心去除上室上層表面的細胞,倒置晾干,95%乙醇固定25min,蘇木素染色,顯微鏡下觀察、計數(shù)、拍照。每個小室計數(shù)10個視野,取平均值統(tǒng)計并分析細胞遷移能力的改變。
細胞遷移實驗結(jié)果如圖12a所示,轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1后,a2780/taxol實驗組與陰性對照組穿透小室的細胞數(shù)量分別是74±19與293±33,兩者有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05);該結(jié)果表明,特異性阻斷padi2的表達后,能抑制腫瘤細胞的遷移。
七、transwell試驗檢測細胞侵襲能力
將-20℃保存的基質(zhì)膠先在4℃復(fù)溫液化,取基質(zhì)膠與opti-mem以1:6冰上混勻稀釋,包被小室底部膜的上室面,37℃固化30min,吸除小室內(nèi)析出的液體?;|(zhì)膠包被后其余步驟同上,每個小室計數(shù)10個視野,取平均值統(tǒng)計并分析細胞侵襲能力的改變。
細胞侵襲實驗結(jié)果如圖12b所示,a2780/taxol實驗組與陰性對照組穿透小室的細胞數(shù)量分別是54±13與192±31,兩者有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05);該結(jié)果表明,特異性阻斷padi2的表達后,能抑制腫瘤細胞浸潤。
實施例6.plko.1-padi2-sh1特異性阻斷padi2表達后對卵巢癌耐藥的逆轉(zhuǎn)作用
一、實驗分組:
1.a2780正常組(不轉(zhuǎn)染任何載體),以下稱作a;
2.a2780/taxol正常組(不轉(zhuǎn)染任何載體),以下稱作ar;
3.a2780/taxol陰性對照組(轉(zhuǎn)染plko.1puro空載體),以下稱作ar-n;
4.a2780/taxol實驗組(轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1),以下稱作ar-sh1。
二、分組轉(zhuǎn)染
轉(zhuǎn)染步驟同前,轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)細胞24h。
三、轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1后細胞對紫杉醇敏感性的檢測
各組取對數(shù)生長期細胞,胰酶消化后細胞重懸,細胞計數(shù)并調(diào)整細胞懸液的密度為1×105/ml,接種到96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24h。次日,各組中加入紫杉醇,濃度梯度分別設(shè)200ug/ml,100ug/ml,50ug/ml,25ug/ml,12.5ug/ml,6.25ug/ml,3.125ug/ml,0ug/ml,作用24h后,用溴標法在波長370nm(參考波長492nm)測吸光度(a),計算紫杉醇對每組細胞的抑制率,抑制率=a實驗組/a陰性對照組。每個濃度設(shè)3個復(fù)孔,取平均值。
抑制率為50%時的藥物濃度為半數(shù)抑制濃度(ic50);
耐藥株a2780/taxol的ic50與其親本細胞株a2780的ic50的比值為耐藥倍數(shù)(resistantfolder,rf);
耐藥株a2780/taxol的ic50與其轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1(逆轉(zhuǎn)劑)后的ic50的比值為耐藥逆轉(zhuǎn)指數(shù)(reversalindex,ri)。
結(jié)果如表2、表3、圖13所示,a2780/taxol對紫杉醇的ic50(41.89±5.11ug/ml)顯著高于親本a2780對紫杉醇的ic50(1.48±0.33ug/ml),耐藥倍數(shù)高達28.31,提示a2780/taxol對紫杉醇的敏感性顯著低于親本細胞a2780,高度耐藥。而當(dāng)a2780/taxol轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1之后,對紫杉醇的敏感性明顯提高(3.05±0.89ug/ml),轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1對a2780/taxol紫杉醇耐藥的逆轉(zhuǎn)效果非常明顯,逆轉(zhuǎn)指數(shù)為14.39。
表2.a2780及a2780/taxol對紫杉醇的藥物敏感性
表3.轉(zhuǎn)染plko.1-padi2-sh1后a2780/taxol對紫杉醇藥物敏感性的逆轉(zhuǎn)
sequencelisting
<110>浙江大學(xué)
<120>特異性抑制padi2基因表達的sirna及其重組載體和應(yīng)用
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