本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種特異性抑制ca7基因表達(dá)的sirna及其重組載體和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

rna干擾(rnainterference，rnai)，又叫基因沉默，是動(dòng)植物中廣泛存在的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。2001年tuschl和他同事發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染人工合成的21-23nt的雙鏈sirna分子可以模擬rnai作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)短于21bp或者長(zhǎng)于25bp的雙鏈rna(dsrna)均不能有效啟動(dòng)rnai，而且其中間序列只要有一個(gè)堿基的錯(cuò)配，基因沉默的效應(yīng)就明顯減退甚至消失，充分體現(xiàn)了其作用的特異性。

正因?yàn)閞nai作用具有很高的特異性和高效性，為基因的功能研究提供了強(qiáng)有力的研究工具，利用小分子干擾rna(sirna)作為基因沉默的方法被廣泛用于惡性腫瘤機(jī)制的研究，大力推動(dòng)了以該技術(shù)為基礎(chǔ)的腫瘤特異高效治療策略的研發(fā)進(jìn)程。

卵巢癌是女性第二大常見(jiàn)惡性腫瘤，是女性惡性腫瘤致死的主要原因，在早期很少有癥狀表現(xiàn)，60％以上的婦女在明確診斷時(shí)已是iii期或iv期，已發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移，預(yù)后很差。標(biāo)準(zhǔn)的治療手段為卵巢腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)加后續(xù)化療，但大多數(shù)患者還是會(huì)因?yàn)榛熌退帯⒛[瘤復(fù)發(fā)最終死亡，五年生存率極低(30％左右)。如何改善卵巢癌的治療效果、尋找卵巢癌化療耐藥的解決方案，是婦科腫瘤學(xué)家面臨的最嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

分子靶向藥物和化療聯(lián)合應(yīng)用是目前提高惡性腫瘤患者生存率最有前景的治療方法。ca7(carbonicanhydrase7)基因是碳酸酐酶家族成員之一，染色體定位在16q22.1，是金屬酶的一種，能把二氧化碳可逆的轉(zhuǎn)化為碳酸氫鈉和質(zhì)子，參與了多個(gè)生理和病理的分子機(jī)制，如：糖異生、脂肪合成、尿素生成和腫瘤的發(fā)生。我們先期的研究結(jié)果顯示ca7在卵巢癌中是高表達(dá)的。但是該基因是否與卵巢癌發(fā)病有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

因此，采用rnai技術(shù)對(duì)ca7基因進(jìn)行特異性的表達(dá)干擾，對(duì)卵巢癌發(fā)病機(jī)制的研究是個(gè)重要補(bǔ)充，是對(duì)卵巢癌靶向治療及其耐藥治療的重要探索和應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種特異性抑制ca7基因表達(dá)的sirna，用于卵巢癌發(fā)病機(jī)制研究。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該sirna在制備治療卵巢癌和紫杉醇耐藥的卵巢癌藥物中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明設(shè)計(jì)、合成3對(duì)特異性抑制ca7基因表達(dá)的sirna，分別轉(zhuǎn)染到卵巢癌細(xì)胞株a2780及其紫杉醇耐藥株a2780/taxol中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)s1抑制ca7基因表達(dá)的干擾效果最明顯。

本發(fā)明提供了一種特異性抑制ca7基因表達(dá)的sirna(s1)，包括正義鏈和反義鏈，

所述正義鏈：5’-ugauuggcgaucucccugggc-3’(seqidno.1)；

所述反義鏈：5’-ccagggagaucgccaaucacc-3’(seqidno.2)。

作為優(yōu)選，所述正義鏈和反義鏈的5’和3’端的3個(gè)堿基進(jìn)行2’-甲氧基修飾。本發(fā)明研究證明，2’-甲氧基修飾后的sirna(s1)穩(wěn)定性增加，提高其在體內(nèi)抵抗核糖酶的水解的能力，降低免疫刺激反應(yīng)，延長(zhǎng)sirna干擾基因表達(dá)下調(diào)的作用時(shí)間，使其作用具有高效性、特異性。

本發(fā)明提供了一種包含編碼所述sirna的dna序列的rna干擾試劑盒。所述試劑盒中包含克隆了所述sirna的dna質(zhì)粒載體，應(yīng)用時(shí)，該質(zhì)粒載體在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄表達(dá)所需的sirna，從而達(dá)到沉默ca7基因的表達(dá)。

本發(fā)明提供了一種含有編碼所述sirna的dna序列的重組載體。作為優(yōu)選，采用的原始載體為慢病毒載體plko.1puro。

本發(fā)明還提供了重組載體的構(gòu)建方法，包括：

(1)合成ca7-s1片段，選擇agei和ecori兩個(gè)酶切位點(diǎn)，根據(jù)s1的序列，設(shè)計(jì)其shrna序列，序列如下：

正義鏈：

5’-ccggggtgattggcgatctccctgggcttcaagagagcccagggagatcgccaatcaccttttttggtacc-3’(seqidno.7)；

反義鏈：

5’-aattggtaccaaaaaaggtgattggcgatctccctgggctctcttgaagcccagggagatcgccaatcacc-3’(seqidno.8)；

(2)退火得到ca7-s1的dna片段；

(3)用慢病毒載體plko.1puro構(gòu)建plko.1-ca7-s1重組載體。

本發(fā)明提供的sirna能夠高效特異性抑制卵巢癌細(xì)胞ca7基因的表達(dá)，減少細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞遷移和侵襲能力，因此，所述sirna和重組載體作為ca7基因表達(dá)抑制劑可以應(yīng)用于腫瘤疾病發(fā)病機(jī)制的研究當(dāng)中。

本發(fā)明提供了所述sirna和重組載體在制備ca7基因表達(dá)抑制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了所述sirna和重組載體在制備治療卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或結(jié)直腸癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明研究表明，紫杉醇耐藥株a2780/taxol轉(zhuǎn)染所述sirna后，該細(xì)胞株對(duì)紫杉醇的敏感性明顯提高，逆轉(zhuǎn)指數(shù)為15.17，說(shuō)明本發(fā)明提供的sirna對(duì)紫杉醇耐藥株a2780/taxol耐藥的逆轉(zhuǎn)效果非常明顯，因此，所述sirna對(duì)逆轉(zhuǎn)卵巢癌紫杉醇耐藥的治療具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明提供了所述的sirna和重組載體在制備逆轉(zhuǎn)卵巢癌紫杉醇耐藥的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明具備的有益效果：

本發(fā)明提供的sirna能夠特異性、高效地抑制ca7基因的mrna和蛋白表達(dá)，減少細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞遷移和侵襲能力，并能有效逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥。將其應(yīng)用于腫瘤發(fā)病機(jī)制研究以及制備腫瘤治療及逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥治療的藥物中，具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1為qrt-pcr檢測(cè)s1，s2，s3轉(zhuǎn)染48h后a2780細(xì)胞ca7mrna表達(dá)。

圖2為qrt-pcr檢測(cè)s1，s2，s3轉(zhuǎn)染48h后a2780/taxol細(xì)胞ca7mrna表達(dá)。

圖3為westernblotting檢測(cè)s1，s2，s3轉(zhuǎn)染72h后a2780細(xì)胞ca7蛋白表達(dá)。

圖4為westernblotting檢測(cè)s1，s2，s3轉(zhuǎn)染72h后a2780/taxol細(xì)胞ca7蛋白表達(dá)。

圖5為plko.1-ca7-s1重組質(zhì)粒及插入酶切位點(diǎn)示意圖。

圖6為小發(fā)卡shrna示意圖。u6啟動(dòng)子指導(dǎo)下游小發(fā)卡shrna的轉(zhuǎn)錄；包括23個(gè)s1正義鏈堿基，23個(gè)s1反義鏈堿基。

圖7為westernblotting檢測(cè)plko.1-ca7-s1轉(zhuǎn)染后a2780細(xì)胞ca7蛋白表達(dá)。

圖8為westernblotting檢測(cè)plko.1-ca7-s1轉(zhuǎn)染后a2780/taxol細(xì)胞ca7蛋白表達(dá)。

圖9為相差顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1后a2780和a2780/taxol細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)變化。

圖10為溴標(biāo)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1后a2780和a2780/taxol細(xì)胞增殖。

圖11為caspase3活性檢測(cè)轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1后a2780和a2780/taxol細(xì)胞凋亡。

圖12為細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1后a2780細(xì)胞遷移能力。

圖13為細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1后a2780/taxol細(xì)胞遷移能力。

圖14為transwell檢測(cè)轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1后a2780和a2780/taxol細(xì)胞遷移能力。

圖15為transwell檢測(cè)轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1后a2780和a2780/taxol細(xì)胞侵襲能力。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。以下的實(shí)施例中采用的方法目的是更好地理解本發(fā)明，但并不限于本發(fā)明。如無(wú)特殊說(shuō)明，實(shí)施例中涉及的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，所用的實(shí)驗(yàn)材料均為常規(guī)試劑公司購(gòu)買(mǎi)。

采用spss16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，各樣本數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間的差異用t檢驗(yàn)(independent-samplettest)，多組之間的檢驗(yàn)用單因素方差分析(one-wayanova)，p＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

卵巢癌細(xì)胞株a2780及卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株a2780/taxol由浙江省女性生殖健康研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)保存；

兔抗人ca7一抗(cat.13670-1-ap)、鼠抗人gapdh一抗(cat.60004-1-ig)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠igg(h+l)二抗(cat.sa00001-1)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔igg(h+l)二抗(cat.sa00001-2)均購(gòu)自proteintech公司；

westernblottingluminolreagent檢測(cè)試劑盒(cat.sc-2048)購(gòu)自santacruz公司；

cdna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒primescript^tmrtmastermix(cat.rr036a)、熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒sybrpremixextaq(perfectrealtime,cat.drr041a)購(gòu)自takara公司；lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒(cat.l3000008)購(gòu)自invitrogen公司；

真核表達(dá)載體選擇常規(guī)rnai載體plko.1puro，源于全球科學(xué)家質(zhì)粒共享非盈利組織addgene；

限制性內(nèi)切酶agei(cat.r0552s)、ecori(cat.r0101s)、kpni(cat.r0142s)購(gòu)自neb公司；t4連接酶(cat.2011a)、dna片段純化試劑盒(cat.9761)、dna凝膠回收試劑盒(cat.9762)、質(zhì)粒dna小量純化試劑盒(cat.9760)均購(gòu)自takara公司；

sirna由takara公司合成；pcr引物及克隆用dna由上海生工生物工程公司合成；

預(yù)染蛋白marker(cat.26616)購(gòu)自fermentas公司；

溴標(biāo)法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒cellproliferationelisa,brdu(colorimetric,cat.11647229001)購(gòu)自roche公司；

caspaceassaysystem(colorimetric，cat.g7351)購(gòu)自promega公司；

細(xì)胞遷移、侵襲模型transwellpermeablesupports(cat.3428)購(gòu)自corning公司；

lab-tekiichamberslidesystem—lab-tek腔室玻片系統(tǒng)購(gòu)自nunc公司(cat.154526)；

bdmatrigel^tmbasementmembranematirx基質(zhì)膜(cat.356234)購(gòu)自bd公司；

sirna陰性對(duì)照allstarsnegativecontrolsirna(cat.1027281)購(gòu)自qiagen公司；

sds-page凝膠配置試劑盒(cat.cw0022m)購(gòu)自康為世紀(jì)公司；

0.45umpvdf膜(cat.ipvh00010)購(gòu)自millipore公司；

紫杉醇(cat.p106868)購(gòu)自aladdin公司。

實(shí)施例1.ca7sirna設(shè)計(jì)合成

在genebank中查獲ca7基因mrna序列(nm_005182.2)，用sidirectver2.0軟件(http://sidirect2.rnai.jp/)在線設(shè)計(jì)獲得3對(duì)sirna序列(如seqidno.1-seqidno.6)所示。設(shè)計(jì)過(guò)程中選擇同時(shí)滿足文獻(xiàn)報(bào)道的三種算法(ui-tei×reynolds×amarzguioui)的序列，并選擇sirna作用特異性最高的23nt長(zhǎng)度片段，該設(shè)計(jì)可避免將來(lái)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)生干擾素樣免疫反應(yīng)，選擇起始密碼子后100nt，避開(kāi)5’和3’端utr區(qū)，gc含量控制在30-70％。共選擇3對(duì)23nt長(zhǎng)度的sirna作為實(shí)驗(yàn)篩選干擾片段，結(jié)構(gòu)特征表現(xiàn)為正義鏈和反義鏈3’端各有兩個(gè)堿基外掛，結(jié)構(gòu)特點(diǎn)如下

隨后用blastn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)在線進(jìn)行同源性搜索，排除有同源性的序列，盡可能避免非特異性片段對(duì)sirna特異性作用效應(yīng)的影響。

最后在化學(xué)合成時(shí)對(duì)正義鏈和反義鏈的5’和3’端連續(xù)3個(gè)嘌呤(嘧啶)堿基進(jìn)行2’-ome(2’-甲氧基)修飾，增加sirna分子在細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)穩(wěn)定性，延長(zhǎng)sirna干擾基因表達(dá)下調(diào)的時(shí)間和效應(yīng)。最終的序列和修飾如表1和式(ⅰ)如下：

表1

實(shí)施例2.三對(duì)ca7sirna在卵巢癌細(xì)胞株a2780及其紫杉醇耐藥株a2780/taxol中對(duì)ca7基因干擾效果的檢測(cè)和篩選

一、實(shí)驗(yàn)分組：

1.a2780正常組(不轉(zhuǎn)染sirna)。以下稱作a；

2.a2780陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照sirna)，以下稱作a-n；

3.a2780實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染s1)，以下稱作a-s1；

4.a2780實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染s2)，以下稱作a-s2；

5.a2780實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染s3)，以下稱作a-s3；

6.a2780/taxol正常組(不轉(zhuǎn)染sirna)，以下稱作ar；

7.a2780/taxol陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照sirna)，以下稱作ar-n；

8.a2780/taxol實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染s1)，以下稱作ar-s1；

9.a2780/taxol實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染s2)，以下稱作ar-s2；

10.a2780/taxol實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染s3)，以下稱作ar-s3。

二、分組轉(zhuǎn)染

為確保轉(zhuǎn)染效率，降低細(xì)胞毒性，我們采用lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行sirna轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞鋪板在六孔板中，使其在轉(zhuǎn)染日密度0.5×10⁶/ml，細(xì)胞融合至70-90％。每孔用125μl無(wú)血清opti-mem培養(yǎng)基稀釋5ullipofectamine3000試劑并充分混勻；制備sirna預(yù)混液，用125μl無(wú)血清opti-mem培養(yǎng)基稀釋sirna至終濃度為50nm，并充分混勻；在已稀釋的lipofectamine3000試劑中加入sirna預(yù)混液(1:1)，室溫孵育5min；最后將sirna-脂質(zhì)體復(fù)合物加入細(xì)胞中，37℃，5％的co2中繼續(xù)培養(yǎng)。48h后檢測(cè)ca7mrna表達(dá)，72h后檢測(cè)ca7蛋白表達(dá)。

三、實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr(qrt-pcr)檢測(cè)ca7基因mrna表達(dá)

培養(yǎng)48h后吸棄6孔板中的培養(yǎng)基，用pbs洗滌兩次后用trizol抽提總rna，thermonanodrop2000分光光度儀測(cè)定rna濃度，并按sybrpremixextaq(perfectrealtime)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。第一步rna變性。反應(yīng)體系：rna0.5ug，去rna酶depc水補(bǔ)足至6.8ul；反應(yīng)條件：70℃孵育10min后置于冰上。第二步逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系：按照primescriptrtmastermix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；反應(yīng)條件：42℃孵育60min，85℃滅活5min后，-20℃保存。

取1ul逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)。pcr引物序列：

5’-ggagcccatctgcatctctg-3’；

5’-caaactggctgaaggagggt-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度：275bp；

反應(yīng)條件：95℃10s，95℃5s，6℃30s，共40個(gè)循環(huán)。

采用2-△ct法計(jì)算各組樣本中ca7mrna的表達(dá)量。

結(jié)果：如圖1所示，a2780細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染s1、s2、s3后，ca7mrna的表達(dá)均有明顯下降，其中a-s1干擾效果最好，與陰性對(duì)照組比較，ca7mrna下調(diào)了88％(p＜0.05)。同樣如圖2所示，在a2780/taxol細(xì)胞中，ar-s1干擾效果最好，與陰性對(duì)照組比較，ca7mrna下調(diào)了84.9％(p＜0.05)。結(jié)果表明，在a2780和紫杉醇耐藥株a2780/taxol中，s1對(duì)ca7的mrna表達(dá)有最好的干擾效果。

四、westernblotting檢測(cè)ca7蛋白表達(dá)

培養(yǎng)72h后吸棄6孔板中的培養(yǎng)基，pbs洗滌3次，加入ripa蛋白裂解液(100ul/孔)，吹打數(shù)次，冰上孵育5min，使之充分裂解，4℃，12000轉(zhuǎn)離心5分鐘，收集上清，分裝-20℃貯存；每個(gè)樣品95℃變性5min后取10ul上樣，8％sds-page電泳，200v，10min；100v，100min；轉(zhuǎn)至pvdf膜：110v，120min；用含5％脫脂奶粉的tbs封閉液封閉60min；一抗孵育：ca7一抗(1：2000)、gapdh一抗(1：5000)室溫下孵育2h；tbs洗膜10min×3次；二抗孵育：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠igg(h+l)二抗(1：10000)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔igg(h+l)二抗(1：10000)孵育1h；tbst洗膜10min×3次，tbs洗膜10min×1次；ecl顯影后，用imagequantlas4000mini(gehealthcare)對(duì)圖象掃描處理。

結(jié)果：如圖3、圖4所示，與陰性對(duì)照相比，s1轉(zhuǎn)染后，a2780細(xì)胞和a2780/taxol細(xì)胞中ca7蛋白表達(dá)顯著下降(p﹤0.05)，且與s2和s3相比有顯著差異(p﹤0.05)。結(jié)果表明，在a2780和紫杉醇耐藥株a2780/taxol中，s1對(duì)ca7的蛋白表達(dá)具有最好的干擾效果。故經(jīng)過(guò)篩選，s1被選擇作為后續(xù)研究的sirna。

實(shí)施例3.真核載體plko.1-ca7-s1的構(gòu)建及對(duì)ca7基因表達(dá)的干擾效果檢測(cè)

一、實(shí)驗(yàn)分組：

1.a2780正常組(不轉(zhuǎn)染任何載體)，以下稱作a；

2.a2780陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染plko.1puro空載體)，以下稱作a-n；

3.a2780實(shí)驗(yàn)組1(轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1)，以下稱作a-s1；

4.a2780/taxol正常組(不轉(zhuǎn)染任何載體)，以下稱作ar；

5.a2780/taxol陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染plko.1puro空載體)，以下稱作ar-n；

6.a2780/taxol實(shí)驗(yàn)組1(轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1)，以下稱作ar-s1；

二、合成ca7-s1片段

選擇agei和ecori兩個(gè)酶切位點(diǎn)，根據(jù)s1的序列，設(shè)計(jì)其shrna序列并構(gòu)建到真核表達(dá)載體plko.1puro中。序列如下：

正義鏈：

5’-ccggggtgattggcgatctccctgggcttcaagagagcccagggagatcgccaatcaccttttttggtacc-3’(seqidno.7)；

反義鏈：

5’-aattggtaccaaaaaaggtgattggcgatctccctgggctctcttgaagcccagggagatcgccaatcacc-3’(seqidno.8)；

三、真核載體plko.1-ca7-s1的構(gòu)建

用真核表達(dá)載體plko.1puro構(gòu)建plko.1-ca7-s1重組表達(dá)載體(圖5和6)，具體方法參見(jiàn)美國(guó)冷泉港出版社《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。

將ca7-s1正義鏈和反義鏈經(jīng)退火程序(95℃變性2min；緩慢冷卻退火至25℃)，4℃保存。agei和ecori完全酶切載體plko.1puro，37℃過(guò)夜；酶切產(chǎn)物用dna凝膠回收試劑盒回收dna。退火產(chǎn)物與載體酶切回收片段進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系(10ul)：t4連接酶1ul，t4連接酶緩沖液1ul，退火產(chǎn)物與載體酶切回收片段混合物(摩爾比3:1)；去離子水補(bǔ)至10ul，16℃連接過(guò)夜；取5ul連接產(chǎn)物置于100uljm109感受態(tài)細(xì)菌中，冰浴30min，42℃熱休克90s，冰浴5min，加lb培養(yǎng)基1000ul，37℃搖床培養(yǎng)30min，5000rpm離心5min，棄上清，將細(xì)菌均勻涂布于lb平板上(含50ug/ml氨芐青霉素)，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜；挑選若干獨(dú)立菌落接種于含相應(yīng)抗性的lb培養(yǎng)基中，37℃震蕩過(guò)夜擴(kuò)菌；收集細(xì)菌，用質(zhì)粒dna純化試劑盒抽提獲得質(zhì)粒dna，kpni酶切鑒定，獲得plko.1-ca7-s1重組質(zhì)粒。

四、plko.1-ca7-s1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后觀察干擾效果

將plko.1-ca7-s1轉(zhuǎn)染入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的a2780及a2780/taxol細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染參照l(shuí)ipofectamine3000操作說(shuō)明書(shū)，每孔用125μl無(wú)血清opti-mem培養(yǎng)基稀釋5ullipofectamine3000試劑并充分混勻；在125μl無(wú)血清opti-mem培養(yǎng)基中加入5ug重組質(zhì)粒dna，加入p3000試劑10ul，充分混勻，制備重組質(zhì)粒預(yù)混液；在已稀釋的lipofectamine3000試劑中加入重組質(zhì)粒預(yù)混液(1:1)，室溫孵育5mim；最后將重組質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物250ul加入細(xì)胞中，37℃，5％的co2中繼續(xù)培養(yǎng)。72h后檢測(cè)ca7蛋白表達(dá)。

如圖7和圖8所示，轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1重組質(zhì)粒后，與陰性對(duì)照(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒)相比，a2780細(xì)胞和a2780/taxol細(xì)胞中ca7蛋白表達(dá)均顯著下降(p﹤0.05)，結(jié)果表明，在a2780和紫杉醇耐藥株a2780/taxol中，轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1重組質(zhì)粒能有效干擾ca7的蛋白表達(dá)。

實(shí)施例4.plko.1-ca7-s1特異性阻斷ca7表達(dá)后對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

一、實(shí)驗(yàn)分組：

1.a2780正常組(不轉(zhuǎn)染任何載體)，以下稱作a；

2.a2780陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染plko.1puro空載體)，以下稱作a-n；

3.a2780實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1)，以下稱作a-s1；

4.a2780/taxol正常組(不轉(zhuǎn)染任何載體)，以下稱作ar；

5.a2780/taxol陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染plko.1puro空載體)，以下稱作ar-n；

6.a2780/taxol實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1)，以下稱作ar-s1。

二、分組轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染步驟同前，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，用于檢測(cè)細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲。

三、細(xì)胞增殖試驗(yàn)

細(xì)胞在96孔板中轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1后繼續(xù)培養(yǎng)72h，每孔加入10ulbrdu標(biāo)記液至brdu終濃度為10um，37℃孵育2h；吸除brdu標(biāo)記液，每孔加入200ulfixdenat，20℃孵育30min；吸除fixdenat，每孔加入100ulanti-brdu-pod，20℃孵育90min；每孔200ulwashingsolution洗滌3次；加入100ul/孔底物溶液，20℃孵育20min，檢測(cè)波長(zhǎng)370nm(參考波長(zhǎng)492nm)測(cè)吸光度(a)，細(xì)胞增殖的能力用a實(shí)驗(yàn)組/a對(duì)照組表示。

結(jié)果如圖9和圖10所示，在a2780和a2780/taxol細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1后，相差顯微鏡下觀察可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，懸浮細(xì)胞數(shù)量增加，可見(jiàn)較多細(xì)胞碎片；溴標(biāo)法測(cè)試細(xì)胞增殖結(jié)果也顯示：與陰性對(duì)照相比，a2780和a2780/taxol實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力分別下降了65.80％和60.98％，有顯著性差異(p＜0.05)。說(shuō)明特異性阻斷ca7的表達(dá)后，能抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

四、caspase3活性檢測(cè)細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染72h后收集細(xì)胞，裂解液調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁸/ml，冰上裂解15min，15000g×20min，收集上清。按照caspaceassaysystem(colorimetric)說(shuō)明書(shū)同時(shí)制備陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣品，測(cè)定并調(diào)整各組蛋白濃度相同。96孔板中每孔加入caspaceassaybuffer32ul，dmso2ul，100nmdtt10ul，去離子水調(diào)整體積為98ul，加入2uldevd-pna底物，37℃孵育4h，檢測(cè)波長(zhǎng)405nm測(cè)吸光度，用δa法計(jì)算每組樣品caspase3活性。

結(jié)果如圖11所示，a2780和a2780/taxol細(xì)胞轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1后，caspase3活性分別增加了3.14倍和3.58倍，與陰性對(duì)照比較，均有顯著性差異(p＜0.05)說(shuō)明特異性阻斷ca7的表達(dá)后，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

五、細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

在六孔板背后用直尺均勻劃?rùn)M線，約0.5cm劃一道，橫穿過(guò)孔，每孔至少有6條橫線。細(xì)胞轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1后，繼續(xù)培養(yǎng)24h細(xì)胞融合成單層狀態(tài)時(shí)，在選定區(qū)域用200ul的槍頭在六孔板中垂直劃痕，pbs洗3次去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。0h，24h，48h時(shí)間點(diǎn)拍照，隨機(jī)選取6條水平線，計(jì)算細(xì)胞間距離均值。

結(jié)果如圖12和圖13所示，plko.1-ca7-s1轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h和48h后，a2780和a2780/taxol細(xì)胞間距離顯著大于陰性對(duì)照組，細(xì)胞劃痕后愈合能力顯著下降，說(shuō)明特異性阻斷ca7的表達(dá)后，能抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。

六、transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，用胰酶消化收集，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10⁵/ml，上室加2ml細(xì)胞懸液，下室加10％fbs完全培養(yǎng)基2ml，繼續(xù)培養(yǎng)24h，取出小室，pbs洗3次，用棉簽小心去除上室上層表面的細(xì)胞，倒置晾干，95％乙醇固定25min，蘇木素染色，顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)、拍照。每個(gè)小室計(jì)數(shù)10個(gè)視野，取平均值統(tǒng)計(jì)并分析細(xì)胞遷移能力的改變。

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖14所示，轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1后，a2780實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組穿透小室的細(xì)胞數(shù)量分別是76±8與257±19，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)；a2780/taxol實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組穿透小室的細(xì)胞數(shù)量分別是57±11與288±24，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)；該結(jié)果表明，特異性阻斷ca7的表達(dá)后，能抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。

七、transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

將-20℃保存的基質(zhì)膠先在4℃復(fù)溫液化，取基質(zhì)膠與opti-mem以1:6冰上混勻稀釋，包被小室底部膜的上室面，37℃固化30min，吸除小室內(nèi)析出的液體。基質(zhì)膠包被后其余步驟同上，每個(gè)小室計(jì)數(shù)10個(gè)視野，取平均值統(tǒng)計(jì)并分析細(xì)胞侵襲能力的改變。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖15所示，a2780實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組穿透小室的細(xì)胞數(shù)量分別是46±9與153±15，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)；a2780/taxol實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組穿透小室的細(xì)胞數(shù)量分別是41±7與187±23，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)；該結(jié)果表明，特異性阻斷ca7的表達(dá)后，能抑制腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。

實(shí)施例5.plko.1-ca7-s1特異性阻斷ca7表達(dá)后對(duì)卵巢癌耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

一、實(shí)驗(yàn)分組：

1.a2780正常組(不轉(zhuǎn)染任何載體)；

2.a2780/taxol正常組(不轉(zhuǎn)染任何載體)；

3.a2780/taxol陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染plko.1puro空載體)；

4.a2780/taxol實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1)。

二、分組轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染步驟同前，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24h。

三、轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1后細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性的檢測(cè)

各組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后細(xì)胞重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞懸液的密度為1×10⁵/ml，接種到96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24h。次日，各組中加入紫杉醇，濃度梯度分別設(shè)200ug/ml，100ug/ml，50ug/ml，25ug/ml，12.5ug/ml，6.25ug/ml，3.125ug/ml，0ug/ml，作用24h后，用溴標(biāo)法在波長(zhǎng)370nm(參考波長(zhǎng)492nm)測(cè)吸光度(a)，計(jì)算紫杉醇對(duì)每組細(xì)胞的抑制率，抑制率＝a實(shí)驗(yàn)組/a陰性對(duì)照組。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均值。

抑制率為50％時(shí)的藥物濃度為半數(shù)抑制濃度(ic50)；

耐藥株a2780/taxol的ic50與其親本細(xì)胞株a2780的ic50的比值為耐藥倍數(shù)(resistantfolder,rf)；

耐藥株a2780/taxol的ic50與其轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1(逆轉(zhuǎn)劑)后的ic50的比值為耐藥逆轉(zhuǎn)指數(shù)(reversalindex,ri)。

結(jié)果如表2和表3所示，a2780/taxol對(duì)紫杉醇的ic50(44.23±4.31ug/ml)顯著高于親本a2780對(duì)紫杉醇的ic50(1.403±0.31ug/ml)，耐藥倍數(shù)高達(dá)31.53，提示a2780/taxol對(duì)紫杉醇的敏感性顯著低于親本細(xì)胞a2780，高度耐藥。而當(dāng)a2780/taxol轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1之后，對(duì)紫杉醇的敏感性明顯提高(2.78±0.59ug/ml)，plko.1-ca7-s1對(duì)a2780/taxol紫杉醇耐藥的逆轉(zhuǎn)效果非常明顯，逆轉(zhuǎn)指數(shù)為15.17。

表2.a2780及a2780/taxol對(duì)紫杉醇的藥物敏感性

表3.轉(zhuǎn)染plko.1-ca7-s1后a2780/taxol對(duì)紫杉醇藥物敏感性的逆轉(zhuǎn)

sequencelisting

<110>浙江大學(xué)

<120>特異性抑制ca7基因表達(dá)的sirna及其重組載體和應(yīng)用

<130>

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>1

ugauuggcgaucucccugggc21

<210>2

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>2

ccagggagaucgccaaucacc21

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<211>21

<212>rna

<213>人工序列

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ucauaggaaagcuccaguggu21

<210>4

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<212>rna

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cacuggagcuuuccuaugagg21

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cuguccagguagacuucaaug21

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<213>人工序列

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ccggggtgattggcgatctccctgggcttcaagagagcccagggagatcgccaatcacct60

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<211>71

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

aattggtaccaaaaaaggtgattggcgatctccctgggctctcttgaagcccagggagat60

cgccaatcacc71