本發(fā)明涉及一種生物轉(zhuǎn)化用固定化蝸牛酶及其制備方法，屬于固定化酶技術領域。
背景技術：
蝸牛酶是從蝸牛的嗦囊和消化道中制備的混合酶，它含有纖維素酶，果膠酶，淀粉酶，蛋白酶等20多種酶。蝸牛酶是很有價值的一種酶。它可以用于酵母細胞壁的破碎，因此廣泛用于細胞生物學和基因工程學的研究；它可做飼料添加劑，從而提高飼料的消化率；也可用作果汁澄清，橘子脫囊衣，果醬制作等。
蝸牛酶內(nèi)含常見9種酶：從蝸牛消化腺中發(fā)現(xiàn)有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、阿爾法淀粉酶、甘露糖酶、蔗糖酶、半乳聚糖酶、蛋白水解酶、氨基酸轉(zhuǎn)移酶等多種具有生物活性的混合酶。蝸牛酶能降解幾丁質(zhì)內(nèi)切酶分解的幾丁質(zhì)產(chǎn)物成單糖，從而使幾丁質(zhì)內(nèi)切酶的活性得以通過顯色反應來測定。
蝸牛酶是一種可以高效控制降解幾丁質(zhì)的一種生物催化劑，反應條件溫和、專一性強、催化效率高、副反應少等，在醫(yī)藥、化工、食品、輕工和環(huán)境保護等行業(yè)應用十分廣泛。但是游離蝸牛酶在使用中對環(huán)境要求十分苛刻，容易失活，穩(wěn)定性差，難以重復利用，同時昂貴的價格也限制了其在酶催化領域的應用。
因此在實際應用中通常將蝸牛酶作固定化處理。固定化酶由于其高穩(wěn)定性、可重用性、易分離等性質(zhì)被廣泛地應用于化學、生物、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領域。
蝸牛酶固定化方法主要包括物理吸附法、共價結(jié)合法、包埋法和交聯(lián)法。制備固定化蝸牛酶過程中所采用的固定化技術、載體、介質(zhì)條件和所催化反應類別會在一定程度上導致酶失活、變性，從而使酶的催化性能或保留活性降低，其中載體所帶來的分配效應、空間障礙效應和擴散限制效應是影響固定化酶催化效率的主要因素，因此，探尋可行、有效的固定化載體來增強固定化蝸牛酶的催化性能一直是固定化蝸牛酶研究的熱點。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術問題：針對固定化蝸牛酶過程中所采用的固定化技術和催化反應類別易導致酶失活、變性，從而使蝸牛酶的催化性能或保留活性降低的問題，本發(fā)明提供了一種生物轉(zhuǎn)化用固定化蝸牛酶及其制備方法。
為解決技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是：
一種生物轉(zhuǎn)化用固定化蝸牛酶，由磁性fe3o4納米粒子、隔離層、固定層組成，所述磁性fe3o4納米粒子表面包裹隔離層，再經(jīng)固定層修飾隔離層表面并交聯(lián)固化活性蝸牛酶。
所述磁性fe3o4納米粒子為10～12重量份六水合氯化鐵，4.0～4.8重量份四水合氯化亞鐵，25～50重量份質(zhì)量分數(shù)為20%氨水，混合加熱至80～90℃反應1～2h制得。
所述隔離層為葡萄糖經(jīng)水熱反應在磁性fe3o4納米粒子表面形成的碳包覆層。
所述固定層由2～3重量份殼聚糖，10～12重量份正硅酸乙酯，0.1～0.3重量份活性蝸牛酶，0.05～0.08重量份京尼平組成。
所述活性蝸牛酶為蝸牛嗉囊中消化道液的提取物。
一種生物轉(zhuǎn)化用固定化蝸牛酶的制備方法，具體步驟為：
s1.提取活性蝸牛酶；
s2.制備磁性fe3o4納米粒子；
s3.將磁性fe3o4納米粒子加入質(zhì)量分數(shù)為5%葡萄糖溶液中，在200～220℃下反應5～6h后過濾洗滌并配制成分散液；
s4.將分散液與殼聚糖、正硅酸乙酯混合攪拌1～2h后，再加入活性蝸牛酶與京尼平，在30～40℃下以300～400r/min攪拌20～30min，冷卻至室溫后過濾風干得生物轉(zhuǎn)化用固定化蝸牛酶。
本發(fā)明的有益技術效果是：
本發(fā)明通過六水合氯化鐵和四水合氯化亞鐵為原料，制得磁性fe3o4納米粒子作為內(nèi)核，并用葡萄糖為碳源，在磁性fe3o4納米粒子表面包覆無定型碳層，再用殼聚糖和正硅酸乙酯水解的納米二氧化硅修飾碳層表面，形成有利于大尺寸分子和基團的進入的多孔結(jié)構(gòu)，可以增加酶固定化材料的比表面積、提高酶的穩(wěn)定性和活性，吸附蝸牛酶的同時通過京尼平在酶分子間形成共價鍵將蝸牛嗉囊中消化道液提取的活性蝸牛酶交聯(lián)固定。本發(fā)明制備的生物轉(zhuǎn)化用固定化蝸牛酶的活性熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性好，酶活性高，可重復使用，具有廣闊的應用前景。
具體實施方式
取50～100只重量達30～40g的蝸牛，并將蝸牛置于飼養(yǎng)盒中，每天用質(zhì)量分數(shù)為0.01～0.02%的氯化鐵溶液清洗1～3次，饑餓處理3～5天后，敲碎并剝?nèi)ノ伵ぃ〕鑫伵＼涹w并順其消化道剪開蝸牛軟體，剝離消化道后取出嗉囊，在5～8℃下，將嗉囊加入研缽中研磨破碎10～15min，得蝸牛消化道液，量取15～20ml質(zhì)量分數(shù)為2%檸檬酸溶液，加入20～25ml質(zhì)量分數(shù)為3%磷酸氫二鈉溶液中，以300～400r/min攪拌混合均勻后加入蝸牛消化道液，并以300w超聲波超聲提取1～2h，得提取液，將提取液裝入離心機中，以8000～10000r/min離心分離10～20min，取上清液，將上清液裝入冷凍干燥箱中，在﹣30～﹣10℃下冷凍干燥10～12h，得活性蝸牛酶，稱取10～12g六水合氯化鐵，4.0～4.8g四水合氯化亞鐵，加入300～500ml去離子水中，在氮氣氛圍下，以300～400r/min攪拌至固體完全溶解后，再以1ml/min滴加30～40ml質(zhì)量分數(shù)為20%氨水，繼續(xù)攪拌30～40min后加熱至80～90℃反應1～2h，冷卻至室溫后用磁鐵分離得黑色固體，用去離子水和無水乙醇洗滌黑色固體3～5次，得磁性fe3o4納米粒子，稱取1～3g磁性fe3o4納米粒子，加入80～100ml質(zhì)量分數(shù)為5%葡萄糖溶液中，以300w超聲波超聲分散10～15min后，轉(zhuǎn)入水熱反應釜中，在200～220℃下反應5～6h，冷卻至室溫后過濾，得碳包覆fe3o4納米粒子，用去離子水洗滌3～5次后加入80～100ml去離子水中，以300w超聲波超聲分散10～12min，得碳包覆fe3o4納米分散液，稱取2～3g殼聚糖，加入到75～100ml質(zhì)量分數(shù)為1%醋酸溶液中，以300～400r/min攪拌至殼聚糖完全溶解，再加入10～12g正硅酸乙酯，10～20ml碳包覆fe3o4納米分散液，繼續(xù)攪拌1～2h，得反應液，稱取0.1～0.3g活性蝸牛酶，0.05～0.08g京尼平，加入30～50ml去離子水中混合均勻后加入反應液中，在30～40℃下以300～400r/min攪拌20～30min，冷卻至室溫后過濾，將濾餅自然風干得生物轉(zhuǎn)化用固定化蝸牛酶。
實例1
取50只重量達30g的蝸牛，并將蝸牛置于飼養(yǎng)盒中，每天用質(zhì)量分數(shù)為0.01%的氯化鐵溶液清洗1次，饑餓處理3天后，敲碎并剝?nèi)ノ伵?，取出蝸牛軟體并順其消化道剪開蝸牛軟體，剝離消化道后取出嗉囊，在5℃下，將嗉囊加入研缽中研磨破碎10min，得蝸牛消化道液，量取15ml質(zhì)量分數(shù)為2%檸檬酸溶液，加入20ml質(zhì)量分數(shù)為3%磷酸氫二鈉溶液中，以300r/min攪拌混合均勻后加入蝸牛消化道液，并以300w超聲波超聲提取1h，得提取液，將提取液裝入離心機中，以8000r/min離心分離10min，取上清液，將上清液裝入冷凍干燥箱中，在﹣30℃下冷凍干燥10h，得活性蝸牛酶，稱取10g六水合氯化鐵，4.0g四水合氯化亞鐵，加入300ml去離子水中，在氮氣氛圍下，以300r/min攪拌至固體完全溶解后，再以1ml/min滴加30ml質(zhì)量分數(shù)為20%氨水，繼續(xù)攪拌30min后加熱至80℃反應1h，冷卻至室溫后用磁鐵分離得黑色固體，用去離子水和無水乙醇洗滌黑色固體3次，得磁性fe3o4納米粒子，稱取1g磁性fe3o4納米粒子，加入80ml質(zhì)量分數(shù)為5%葡萄糖溶液中，以300w超聲波超聲分散10min后，轉(zhuǎn)入水熱反應釜中，在200℃下反應5h，冷卻至室溫后過濾，得碳包覆fe3o4納米粒子，用去離子水洗滌3次后加入80ml去離子水中，以300w超聲波超聲分散10min，得碳包覆fe3o4納米分散液，稱取2g殼聚糖，加入到75ml質(zhì)量分數(shù)為1%醋酸溶液中，以300r/min攪拌至殼聚糖完全溶解，再加入10g正硅酸乙酯，10ml碳包覆fe3o4納米分散液，繼續(xù)攪拌1h，得反應液，稱取0.1g活性蝸牛酶，0.05g京尼平，加入30ml去離子水中混合均勻后加入反應液中，在30℃下以300r/min攪拌20min，冷卻至室溫后過濾，將濾餅自然風干得生物轉(zhuǎn)化用固定化蝸牛酶。
實例2
取75只重量達35g的蝸牛，并將蝸牛置于飼養(yǎng)盒中，每天用質(zhì)量分數(shù)為0.01%的氯化鐵溶液清洗2次，饑餓處理4天后，敲碎并剝?nèi)ノ伵ぃ〕鑫伵＼涹w并順其消化道剪開蝸牛軟體，剝離消化道后取出嗉囊，在7℃下，將嗉囊加入研缽中研磨破碎13min，得蝸牛消化道液，量取18ml質(zhì)量分數(shù)為2%檸檬酸溶液，加入23ml質(zhì)量分數(shù)為3%磷酸氫二鈉溶液中，以350r/min攪拌混合均勻后加入蝸牛消化道液，并以300w超聲波超聲提取1h，得提取液，將提取液裝入離心機中，以9000r/min離心分離15min，取上清液，將上清液裝入冷凍干燥箱中，在﹣20℃下冷凍干燥11h，得活性蝸牛酶，稱取11g六水合氯化鐵，4.4g四水合氯化亞鐵，加入400ml去離子水中，在氮氣氛圍下，以350r/min攪拌至固體完全溶解后，再以1ml/min滴加35ml質(zhì)量分數(shù)為20%氨水，繼續(xù)攪拌35min后加熱至85℃反應1h，冷卻至室溫后用磁鐵分離得黑色固體，用去離子水和無水乙醇洗滌黑色固體4次，得磁性fe3o4納米粒子，稱取2g磁性fe3o4納米粒子，加入90ml質(zhì)量分數(shù)為5%葡萄糖溶液中，以300w超聲波超聲分散13min后，轉(zhuǎn)入水熱反應釜中，在210℃下反應5h，冷卻至室溫后過濾，得碳包覆fe3o4納米粒子，用去離子水洗滌4次后加入90ml去離子水中，以300w超聲波超聲分散11min，得碳包覆fe3o4納米分散液，稱取2g殼聚糖，加入到87ml質(zhì)量分數(shù)為1%醋酸溶液中，以350r/min攪拌至殼聚糖完全溶解，再加入11g正硅酸乙酯，15ml碳包覆fe3o4納米分散液，繼續(xù)攪拌1h，得反應液，稱取0.2g活性蝸牛酶，0.07g京尼平，加入40ml去離子水中混合均勻后加入反應液中，在35℃下以350r/min攪拌25min，冷卻至室溫后過濾，將濾餅自然風干得生物轉(zhuǎn)化用固定化蝸牛酶。
實例3
取100只重量達40g的蝸牛，并將蝸牛置于飼養(yǎng)盒中，每天用質(zhì)量分數(shù)為0.02%的氯化鐵溶液清洗3次，饑餓處理5天后，敲碎并剝?nèi)ノ伵?，取出蝸牛軟體并順其消化道剪開蝸牛軟體，剝離消化道后取出嗉囊，在8℃下，將嗉囊加入研缽中研磨破碎15min，得蝸牛消化道液，量取20ml質(zhì)量分數(shù)為2%檸檬酸溶液，加入25ml質(zhì)量分數(shù)為3%磷酸氫二鈉溶液中，以400r/min攪拌混合均勻后加入蝸牛消化道液，并以300w超聲波超聲提取2h，得提取液，將提取液裝入離心機中，以10000r/min離心分離20min，取上清液，將上清液裝入冷凍干燥箱中，在﹣10℃下冷凍干燥12h，得活性蝸牛酶，稱取12g六水合氯化鐵，4.8g四水合氯化亞鐵，加入500ml去離子水中，在氮氣氛圍下，以400r/min攪拌至固體完全溶解后，再以1ml/min滴加40ml質(zhì)量分數(shù)為20%氨水，繼續(xù)攪拌40min后加熱至90℃反應2h，冷卻至室溫后用磁鐵分離得黑色固體，用去離子水和無水乙醇洗滌黑色固體5次，得磁性fe3o4納米粒子，稱取3g磁性fe3o4納米粒子，加入100ml質(zhì)量分數(shù)為5%葡萄糖溶液中，以300w超聲波超聲分散15min后，轉(zhuǎn)入水熱反應釜中，在220℃下反應6h，冷卻至室溫后過濾，得碳包覆fe3o4納米粒子，用去離子水洗滌5次后加入100ml去離子水中，以300w超聲波超聲分散12min，得碳包覆fe3o4納米分散液，稱取3g殼聚糖，加入到100ml質(zhì)量分數(shù)為1%醋酸溶液中，以400r/min攪拌至殼聚糖完全溶解，再加入12g正硅酸乙酯，20ml碳包覆fe3o4納米分散液，繼續(xù)攪拌2h，得反應液，稱取0.3g活性蝸牛酶，0.08g京尼平，加入50ml去離子水中混合均勻后加入反應液中，在40℃下以400r/min攪拌30min，冷卻至室溫后過濾，將濾餅自然風干得生物轉(zhuǎn)化用固定化蝸牛酶。
按質(zhì)量比3：1，分別采用實例1～3制得的生物轉(zhuǎn)化用固定化蝸牛酶和微球固定化蝸牛酶（對比例）對質(zhì)量濃度為0.5mg/ml的淫羊藿苷進行生物轉(zhuǎn)化，并對轉(zhuǎn)化效果進行測定，其測定結(jié)果如下表1：
表1
綜上所述，本發(fā)明制得的生物轉(zhuǎn)化用固定化蝸牛酶操作穩(wěn)定性較好，同時酶活性較好，具有較好的催化性能。