本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種精氨酸脫亞胺酶包涵體的復性方法。

背景技術：

精氨酸是一種可以在哺乳動物體內自然產生的非必需氨基酸，它參與組織細胞蛋白質、尿素、肌酸、肌酐、一氧化氮(no)、谷氨酰胺、嘧啶等的合成。正常的細胞可以依賴精氨酰琥珀酸合成酶利用瓜氨酸合成精氨酸。然而在某些腫瘤細胞，如肝癌細胞、黑色素瘤細胞中，精氨酰琥珀酸合成酶通路缺失，無法自身合成精氨酸，只能依賴外源的精氨酸存活，而當外源精氨酸缺乏時，腫瘤細胞就會被“餓死”，增殖受到抑制。這一特點給治療精氨酸依賴的腫瘤提供了新思路，即通過降低血清中精氨酸的水平、阻斷外源精氨酸供給，造成腫瘤細胞營養(yǎng)缺乏，實現(xiàn)特異性的抑制腫瘤細胞增殖。

目前，通過精氨酸脫亞胺酶(argininedeiminase，adi)破壞血液循環(huán)中精氨酸的研究較為深入。adi存在于多種微生物中，包括產氣莢膜索狀芽孢桿菌、惡臭假單胞菌、人型支原體、精氨酸支原體等，能夠將精氨酸降解為瓜氨酸和氨。體內外的實驗均表明，adi對精氨酰琥珀酸合成酶缺陷的腫瘤細胞有顯著的抑制作用。charles發(fā)現(xiàn)adi對30余種黑色素瘤細胞和肝癌細胞的ic50均在0.3ug/ml以下(charlesmarkensor,frederickw.holtsberg,johns.bomalaski和mikea.clark.pegylatedargininedeiminase(adi-sspeg20,000mw)inhibitshumanmelanomasandhepatocellularcarcinomasinvitroandinvivo.cancerresearch,2002,62:5443-5450)。在動物水平，adi-sspeg(聚乙醇修飾的精氨酸脫亞胺酶)顯著抑制了腫瘤的生長，延長荷瘤小鼠的生存時間(longzhang,menghanliu,serwanjajamil,ruizhihan,guochaoxuandyeni.pegylationandpharmacologicalcharacterizationofapotentialantitumordrug,anengineeredargininedeiminaseoriginatedfrompseudomonasplecoglossicida.cancerletters,2015,357:346-354)。由美國polaris公司開發(fā)的adi-peg20藥物正在進行肝癌、前列腺癌、黑色素瘤等的ii/iii期臨床試驗，并展示了良好的效果。因此，adi在腫瘤治療領域具有巨大的應用價值和意義。

在不同種屬來源的adi之中，支原體adi活性最高，是藥物開發(fā)的重要候選分子。天然的adi含量低、分離困難，無法實現(xiàn)大規(guī)模生產。因此，當前多采用基因工程的辦法，使用大腸桿菌表達系統(tǒng)進行制備。大腸桿菌表達系統(tǒng)具有技術成熟、目的蛋白表達量高、操作簡單等特點。但是，使用大腸桿菌表達的adi為包涵體，需通過包涵體的變復性才能獲得有活性的可溶蛋白。目前，文獻及專利公布的復性方法多為稀釋復性。

中國專利申請cn105018454公開了一種精氨酸脫亞胺酶的重組制備方法，并具體公開了所述包涵體的復性方法，其中復性使用尿素為變性劑，并且需要將變性液經100倍稀釋后復性72h。

中國專利申請cn1518595公開了一種經聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶，其中公開的所述包涵體的復性方法中，所述稀釋比例為100倍，時長48h；中國專利申請cn101812438公開了一種部分賴氨酸突變的精氨酸脫亞氨酶突變體及其制備與應用，并且進一步公開了改進了所述包涵體的復性方法，其中要經過120倍稀釋，復性時長48h；中國專利申請cn104130996中的復性比例為100倍，時長90h；中國專利申請cn101792752中的復性比例為10倍，時長24h。

由此可知，現(xiàn)有技術中，處理adi的變復性中，需要將變性液經大量的稀釋獲得復性液，而復性液體積過大一方面對生產設備和車間場地要求更高；另一方面需增加濃縮等步驟，增加了工藝的復雜性，再一方面，長時間復性可能引起蛋白聚集、蛋白酶的降解和氧化等修飾，給后續(xù)的純化造成影響。因此，現(xiàn)有技術中稀釋復性方法中存在的復性液體積過大和復性時間過長是當前adi大規(guī)模生產工藝中面臨的瓶頸問題。

技術實現(xiàn)要素：

因此，基于現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種精氨酸脫亞胺酶包涵體的復性方法，本發(fā)明的方法操作簡便、快捷，為精氨酸脫亞胺酶的大規(guī)模工業(yè)生產提供了基礎。

一方面，本發(fā)明提供了一種精氨酸脫亞胺酶包涵體的復性方法，所述方法包括以下步驟：

1)破碎菌體，離心并收集沉淀獲得包涵體；

2)將步驟1)得到的沉淀使用磷酸緩沖液(pb)重懸，高壓復性，離心并收集上清液；

其中，所述高壓復性的條件為：

將包涵體加壓至150mpa-250mpa，并維持該壓力10-20h；或

將包涵體加壓至150mpa-250mpa，維持1-5h后減壓至60-120mpa，并維持10-20h；

3)純化步驟2)得到的上清液，獲得有活性的精氨酸脫亞胺酶。

優(yōu)選地，在步驟1)中，在破碎菌體前，首先按3-7g/100ml的比例使用ph7-8.5、15-25mm的磷酸緩沖液將所述菌體重懸混勻；更優(yōu)選地，所述菌體與所述磷酸緩沖液的比例為5g/100ml；優(yōu)選地，所述磷酸緩沖液的ph為7.5、濃度為20mm；優(yōu)選地，所述磷酸緩沖液為磷酸鈉緩沖液或磷酸鉀緩沖液；

優(yōu)選地，在步驟1)中，所述菌體使用高壓勻漿機破碎；更優(yōu)選地，所述壓力為500-1200bar，更優(yōu)選地為900bar；優(yōu)選地，所述破碎的次數(shù)為1～5次，更優(yōu)選地為3次；

優(yōu)選地，在步驟1)中，所述離心的條件為5000-10000rpm，20-40min；更優(yōu)選地為7000rpm，30min；

優(yōu)選地，在步驟2)中，所述磷酸緩沖液的濃度為5-20mm，更優(yōu)選地為10mm的；進一步優(yōu)選地，所述磷酸緩沖液為磷酸鈉緩沖液或磷酸鉀緩沖液；

優(yōu)選地，在步驟2)中，所述沉淀與磷酸緩沖液的比例為5-20g/100ml；更優(yōu)選地為10g/100ml；

優(yōu)選地，在步驟2)中，所述高壓復性的條件為：

將包涵體加壓至200mpa，并維持該壓力16h；或

將包涵體加壓至200mpa，維持2h后減壓至90mpa，并維持16h；

優(yōu)選地，在步驟2)中，所述加壓/減壓的速度為20-60mpa/min；更優(yōu)選地為50mpa/min；

優(yōu)選地，在步驟2)中，所述離心的條件為5000-20000rpm，5-20min；更優(yōu)選地為10000rpm，10min；

優(yōu)選地，在步驟3)中，所述純化的步驟包括：

將步驟2)得到的上清液調ph至8.5，用qbestaroseff瓊脂糖凝膠陰離子層析柱進行純化；

優(yōu)選地，所述純化中，平衡緩沖液為10mm磷酸緩沖液，ph8.5，洗脫緩沖液為包含1mnacl的10mm磷酸緩沖液，ph8.5。

優(yōu)選地，所述方法還包括測定酶活的步驟。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的精氨酸脫亞胺酶包涵體的復性方法具有下列優(yōu)點：

1)本發(fā)明的提供的方法可以避免鹽酸胍、尿素等變性劑的使用，極大地降低了復性的成本；

2)本發(fā)明提供的方法中使用的緩沖液成份簡單，可直接進行純化；

3)本發(fā)明提供的方法的周期為18-20h，遠少于傳統(tǒng)的稀釋復性、透析復性等，節(jié)省了時間；同時，降低了長時間復性造成目的蛋白降解、聚集等風險。

4)本發(fā)明提供的方法中復性體積在復性前后沒有變化，整個過程體積不會增加，樣品沒有被稀釋，有利于后續(xù)的工業(yè)操作。

附圖說明

以下，結合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中：

圖1為使用本發(fā)明的方法復性后的產物中可溶蛋白的sds-page檢測。其中，泳道1為蛋白分子量marker，其分子量從大到小依次是97.4kda、66.2kda、43kda、31kda、20.1kda、14.4kda；泳道2為制備的精氨酸脫亞氨酶包涵體；泳道3為精氨酸脫亞氨酶包涵體經200mpa加壓16h后的上清；泳道4為精氨酸脫亞氨酶包涵體經200mpa加壓2h、90mpa加壓16h后的上清；泳道5為制備的精氨酸脫亞氨酶包涵體稀釋復性后經的上清。

圖2為高壓復性后的精氨酸脫亞氨酶用qbestaroseff純化的色譜圖及sds-page電泳檢測純化獲得的目的蛋白；樣品經0-100％的qbestaroseff洗脫緩沖液線性洗脫，獲得單一的洗脫峰，sds-page電泳檢測洗脫峰為純化的精氨酸脫亞氨酶。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

除非特別說明，本發(fā)明方法中使用的化學試劑均可以市售獲得。

實施例1包涵體的制備

將帶有精氨酸脫亞胺酶基因的大腸桿菌表達菌株(購自江蘇康禾生物制藥有限公司)接種到含有3llb培養(yǎng)基的5l發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，當菌液od600達到20時，加入誘導劑iptg至終濃度0.5mm，誘導6～8小時，誘導結束后離心收集菌體。取一定質量的濕菌，按5g/100ml的比例用洗滌液(20mmpb，ph7.5)重懸混勻，用高壓勻漿機(ats公司的ah1500高壓勻質機)900bar壓力高壓破碎3次。將破碎后的勻漿液7000rpm離心30min，收集沉淀獲得包涵體。

實施例2包涵體的高壓復性

稱取實施例1獲得的精氨酸脫亞胺酶的包涵體，用10mm磷酸鹽緩沖液(pb)按10g/100ml的比例重懸為渾濁液。

將重懸液加入至氣動增壓系統(tǒng)，氣動增壓系統(tǒng)使用美國sc公司的氣動增壓泵，以水為介質，最大輸出壓力448mpa。按照50mpa/min的速度將重懸液增壓至200mpa。維持該壓力16h后迅速泄壓。取出重懸液，用10000rpm離心10min，收集上清進行活性測定和sds-page檢測，sds-page電泳如圖1中的泳道3所示。

實施例3包涵體的高壓復性

稱取實施例1獲得的精氨酸脫亞胺酶的包涵體，用10mm磷酸鹽緩沖液按10g/100ml的比例重懸為渾濁液。

將重懸液加入至氣動增壓系統(tǒng)，按照50mpa/min的速度增壓至200mpa。維持200mpa2h后按50mpa/min的速度減壓至90mpa。維持90mpa壓力16h后迅速泄壓。取出重懸液，用10000rpm離心10min，收集上清進行活性測定和sds-page檢測，sds-page電泳如圖1中的泳道4所示。

實施例4精氨酸脫亞胺酶的純化

經實施例2和實施例3將高壓復性后的樣品分別過濾，調ph至8.5，用qbestaroseff柱(博格隆生物技術有限公司，ai0021)進行純化。其中，qbestaroseff平衡緩沖液為10mmpb，ph8.5，qbestaroseff洗脫緩沖液為10mmpb，1mnacl，ph8.5。上樣結束，qbestaroseff平衡緩沖液沖洗2-3個柱體積后，做0％-100％的線性，收集洗脫峰。

實施例5包涵體的稀釋復性

稱取精氨酸脫亞胺酶的包涵體，按1g/15ml的比例用變性液(10mmpb，6m鹽酸胍，ph7.0)溶解1h，按1：100的比例滴加復性液(10mmpb，ph7.0)，溶液于4℃靜置48h。將復性液用10000rpm離心10min，收集上清sds-page電泳檢測，結果如圖1中的泳道5所示。

實施例6sds-page電泳檢測及酶活的測定

sds-page電泳檢測高壓復性液。

分別測定得到的復性液及洗脫液的酶活，步驟如下：

取800ul0.1mol/l磷酸鈉緩沖液，100ul0.1mol/ll-精氨酸和100ul測試樣品至試管中，混勻。避光條件下，將該反應體系置于37℃反應5min。加入0.5ml終止試劑(硫酸:磷酸:水體積比為1:3:1)終止反應。取1ml反應混合液，加入0.1ml的3％二乙酰一肟，充分混勻，避光條件下，95℃加熱15min，冷卻至室溫。吸取200ul到96孔酶標板中，490nm讀取吸光值。同時，取不同濃度的瓜氨酸標準液1ml與二乙酰一肟反應顯色，根據490nm讀取吸光值繪制標準曲線。

根據標準曲線計算蛋白比活為：蛋白比活(iu/mg)＝瓜氨酸物質的量/蛋白量/反應時間。酶活定義為37℃條件下，每分鐘轉化精氨酸生成1um瓜氨酸所需的酶量為1個酶活性單位。結果分別如表1和圖1所示，

其中圖1為使用本發(fā)明的方法復性后的產物中可溶蛋白的sds-page檢測。其中，泳道1為蛋白分子量marker，其分子量從大到小依次是97.4kda、66.2kda、43kda、31kda、20.1kda、14.4kda；泳道2為制備的精氨酸脫亞氨酶包涵體；泳道3為精氨酸脫亞氨酶包涵體經200mpa加壓16h后的上清；泳道4為精氨酸脫亞氨酶包涵體經200mpa加壓2h、90mpa加壓16h后的上清；泳道5為制備的精氨酸脫亞氨酶包涵體用10mm磷酸鹽緩沖液稀釋復性后的上清。從圖中可以得知，按照傳統(tǒng)的稀釋復性方法，大量的目的蛋白以沉淀的形式析出，上清中僅存在少量的可溶蛋白。經高壓復性后的上清液中，可溶目的蛋白的濃度和含量明顯高于稀釋復性方法，獲得的溶液有利于后續(xù)的純化等操作。

表1

從結果中可以得知，使用實施例2的方法，經200mpa加壓16h，包涵體的上清和純化后的比活分別為：6.1iu/mg和15.3iu/mg；使用實施例3的方法，經200mpa加壓2h、90mpa加壓16h，包涵體的上清和純化后的比活分別為：5.5iu/mg和14.6iu/mg，而采用本來領域常規(guī)方法稀釋復性后的比活<2.0iu/mg。結果表明，由于稀釋復性效率低、獲得的可溶蛋白含量低，無法在復性后的上清夜中檢測出目的蛋白的活性。而高壓復性效率高，可溶的目的蛋白濃度大，在不經過純化的條件下即可檢測到酶活，上清液經純化去除雜蛋白后比活得到進一步提高。

實施例7使用本發(fā)明的方法復性包涵體

將帶有精氨酸脫亞胺酶基因的大腸桿菌表達菌株(購自江蘇康禾生物制藥有限公司)接種到含有3llb培養(yǎng)基的5l發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，當菌液od600達到20時，加入誘導劑iptg至終濃度0.5mm，誘導6～8小時，誘導結束后離心收集菌體。取一定質量的濕菌，按7g/100ml的比例用洗滌液(15mmpb，ph7.5)重懸混勻，用高壓勻漿機(ats公司的ah1500高壓勻質機)500bar壓力高壓破碎3次。將破碎后的勻漿液10000rpm離心40min，收集沉淀獲得包涵體。

稱取獲得的精氨酸脫亞胺酶的包涵體，用5mm磷酸鹽緩沖液按20g/100ml的比例重懸為渾濁液。

將重懸液加入至氣動增壓系統(tǒng)，氣動增壓系統(tǒng)使用美國sc公司的氣動增壓泵，以水為介質，最大輸出壓力448mpa。按照20mpa/min的速度將重懸液增壓至150mpa。維持該壓力20h后迅速泄壓。取出重懸液，用5000rpm離心20min，收集上清。

將高壓復性后的樣品分別過濾，調ph至8.5，用qbestaroseff柱(博格隆生物技術有限公司，ai0021)進行純化。其中，qbestaroseff平衡緩沖液為10mmpb，ph8.5，qbestaroseff洗脫緩沖液為10mmpb，1mnacl，ph8.5。上樣結束，qbestaroseff平衡緩沖液沖洗2-3個柱體積后，做0％-100％的線性，收集洗脫峰，即得。

實施例8使用本發(fā)明的方法復性包涵體

將帶有精氨酸脫亞胺酶基因的大腸桿菌表達菌株(購自江蘇康禾生物制藥有限公司)接種到含有3llb培養(yǎng)基的5l發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，當菌液od600達到20時，加入誘導劑iptg至終濃度0.5mm，誘導6～8小時，誘導結束后離心收集菌體。取一定質量的濕菌，按3g/100ml的比例用洗滌液(25mmpb，ph7.5)重懸混勻，用高壓勻漿機(ats公司的ah1500高壓勻質機)1200bar壓力高壓破碎1次。將破碎后的勻漿液5000rpm離心20min，收集沉淀獲得包涵體。

稱取獲得的精氨酸脫亞胺酶的包涵體，用20mm磷酸鹽緩沖液按5g/100ml的比例重懸為渾濁液。

將重懸液加入至氣動增壓系統(tǒng)，按照60mpa/min的速度增壓至250mpa。維持250mpa5h后按50mpa/min的速度減壓至60mpa。維持60mpa壓力20h后迅速泄壓。取出重懸液，用20000rpm離心5min，收集上清。

將高壓復性后的樣品分別過濾，調ph至8.5，用qbestaroseff柱(博格隆生物技術有限公司，ai0021)進行純化。其中，qbestaroseff平衡緩沖液為10mmpb，ph8.5，qbestaroseff洗脫緩沖液為10mmpb，1mnacl，ph8.5。上樣結束，qbestaroseff平衡緩沖液沖洗2-3個柱體積后，做0％-100％的線性，收集洗脫峰，即得。

實施例9使用本發(fā)明的方法復性包涵體

將帶有精氨酸脫亞胺酶基因的大腸桿菌表達菌株(購自江蘇康禾生物制藥有限公司)接種到含有3llb培養(yǎng)基的5l發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，當菌液od600達到20時，加入誘導劑iptg至終濃度0.5mm，誘導6～8小時，誘導結束后離心收集菌體。取一定質量的濕菌，按7g/100ml的比例用洗滌液(15mmpb，ph7.5)重懸混勻，用高壓勻漿機(ats公司的ah1500高壓勻質機)500bar壓力高壓破碎3次。將破碎后的勻漿液10000rpm離心40min，收集沉淀獲得包涵體。

稱取獲得的精氨酸脫亞胺酶的包涵體，用20mm磷酸鹽緩沖液按5g/100ml的比例重懸為渾濁液。

將重懸液加入至氣動增壓系統(tǒng)，按照20mpa/min的速度增壓至150mpa。維持150mpa1h后按20mpa/min的速度減壓至120mpa。維持120mpa壓力10h后迅速泄壓。取出重懸液，用20000rpm離心5min，收集上清。

將高壓復性后的樣品分別過濾，調ph至8.5，用qbestaroseff柱(博格隆生物技術有限公司，ai0021)進行純化。其中，qbestaroseff平衡緩沖液為10mmpb，ph8.5，qbestaroseff洗脫緩沖液為10mmpb，1mnacl，ph8.5。上樣結束，qbestaroseff平衡緩沖液沖洗2-3個柱體積后，做0％-100％的線性，收集洗脫峰，即得。

以上對本發(fā)明具體實施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領域技術人員可以根據本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應屬于本發(fā)明所附權利要求的范圍。