本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種用于豬cd163基因編輯的靶向sgrna、修飾載體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豬藍(lán)耳病(豬繁殖與呼吸綜合癥，prrs)是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的第一大病毒性傳染病，每年給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來數(shù)十億美元的損失。豬藍(lán)耳病是由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(prrsv)引起的，主要侵害妊娠母豬、仔豬和種公豬，引起妊娠母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)和死胎，仔豬呼吸困難甚至死亡。國外的研究表明，豬cd163基因的第七外顯子編碼的蛋白質(zhì)區(qū)域是藍(lán)耳病病毒受體結(jié)合藍(lán)耳病病毒的區(qū)域，完全刪除了第七外顯子的cd163基因，其表達(dá)的cd163蛋白恰巧缺失了結(jié)合prrsv的結(jié)構(gòu)域，而其他的生理功能卻不受影響，由此可見，對(duì)cd163基因進(jìn)行編輯是生產(chǎn)能夠抵抗藍(lán)耳病病毒感染的豬的重要候選手段。crispr/cas9系統(tǒng)是近年來被廣泛應(yīng)用的一種基因編輯技術(shù)，可以精確的對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)刪除、插入或置換等改造。crispr/cas9系統(tǒng)主要由兩個(gè)重要的元件構(gòu)成——導(dǎo)向rna(sgrna)和cas9核酸內(nèi)切酶(cas9nuclease)。很多研究表明，與cas9核酸內(nèi)切酶相比，使用突變了一個(gè)活性域的cas9切口酶(cas9nickase)和兩條sgrna對(duì)目的基因進(jìn)行編輯可以極大地降低crispr/cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，這一系統(tǒng)被稱之為crispr/cas9n系統(tǒng)。雖然，目前越來越多的基因作為家畜疾病的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)被應(yīng)用，但在針對(duì)豬藍(lán)耳病中的關(guān)鍵基因及其編輯修飾的方法尚未在我國得到應(yīng)用。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種用于豬cd163基因編輯的靶向sgrna；本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種豬cd163基因修飾載體；本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種豬cd163基因修飾載體的制備方法；本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供一種豬cd163基因修飾載體在制備抗藍(lán)耳病豬中的應(yīng)用；本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供一種抗藍(lán)耳病豬的制備方法；本發(fā)明的第六個(gè)目的在于提供一種抗藍(lán)耳病的豬；以緩解現(xiàn)有技術(shù)中存在的針對(duì)豬藍(lán)耳病中的關(guān)鍵基因及其編輯修飾的方法尚未得到應(yīng)用的技術(shù)問題。本發(fā)明提供的一種用于豬cd163基因編輯的靶向sgrna，包括sgrna-c161和sgrna-c185；所述sgrna-c161的正義鏈和反義鏈分別為：c161-fwd：5’-aaagtgagctccccccagga-3’(seqidno.1)；c161-rev：5’-tcctggggggagctcacttt-3’(seqidno.2)；所述sgrna-c185的正義鏈和反義鏈分別為：c185-fwd：5’-gagaaggaagtggacagatc-3’(seqidno.3)；c185-rev：5’-gatctgtccacttccttctc-3’(seqidno.4)。本發(fā)明還提供了一種豬cd163基因修飾載體，包括上述的兩條sgrna、cas9切口酶及熒光標(biāo)記蛋白。進(jìn)一步地，所述豬cd163基因修飾為針對(duì)豬cd163基因的第七外顯子進(jìn)行的基因編輯。本發(fā)明還提供了一種上述的豬cd163基因修飾載體的制備方法，包括以下步驟：步驟(a)：將所述sgrna-c161的正義鏈和反義鏈進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，形成c161雙鏈dna分子；步驟(b)：將所述sgrna-c185的正義鏈和反義鏈進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，形成c185雙鏈dna分子；步驟(c)：將所述c161雙鏈dna分子連接到表達(dá)載體上，構(gòu)建表達(dá)sgrna-c161的載體；步驟(d)：將所述c185雙鏈dna分子連接到表達(dá)載體上，構(gòu)建表達(dá)sgrna-c185的載體；步驟(e)：以所述表達(dá)sgrna-c161的載體為模板，pcr擴(kuò)增含有u6啟動(dòng)子的所述sgrna-c161序列，并連接到克隆載體上，再經(jīng)過酶切后獲得u6-sgrna-c161序列；步驟(f)：將所述u6-sgrna-c161序列連接到所述表達(dá)sgrna-c185的載體上，構(gòu)建完成表達(dá)所述sgrna-c161和sgrna-c185的載體。進(jìn)一步地，在步驟(c)和步驟(d)中，所述表達(dá)載體為帶有cas9切口酶、熒光標(biāo)記蛋白及u6啟動(dòng)子的經(jīng)過bbsⅰ酶切的px461載體。進(jìn)一步地，在步驟(e)中，所述克隆載體為pmd18-t載體。本發(fā)明還提供了上述的豬cd163基因修飾載體在制備抗藍(lán)耳病豬中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種抗藍(lán)耳病豬的制備方法，應(yīng)用上述的豬cd163基因修飾載體。進(jìn)一步地，將所述豬cd163基因修飾載體轉(zhuǎn)入豬的體細(xì)胞中，獲得cd163基因編輯陽性細(xì)胞克隆，以所述陽性細(xì)胞為供體細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞克隆和胚胎移植，獲得所述抗藍(lán)耳病豬。另外，本發(fā)明還提供了一種抗藍(lán)耳病的豬，應(yīng)用上述的抗藍(lán)耳病豬的制備方法制備得到。本發(fā)明提供的用于豬cd163基因編輯的靶向sgrna和包括上述兩條sgrna、cas9切口酶及熒光標(biāo)記蛋白的豬cd163基因修飾載體，特異性強(qiáng)，能夠非常高效地通過crispr/cas9n系統(tǒng)在細(xì)胞水平上對(duì)豬cd163基因進(jìn)行編輯。本發(fā)明提供的抗藍(lán)耳病豬的制備方法，應(yīng)用了本發(fā)明提供的豬cd163基因修飾載體，針對(duì)豬藍(lán)耳病中的關(guān)鍵基因cd163進(jìn)行基因編輯，從而破壞藍(lán)耳病病毒受體，并且，除了對(duì)目的基因cd163進(jìn)行編輯外不會(huì)引入其他任何外源基因，也不會(huì)對(duì)基因組上非cd163基因的區(qū)域進(jìn)行非特異的編輯，遺傳背景干凈清晰，極大的減少了后期轉(zhuǎn)基因安全評(píng)估的工作。本發(fā)明提供的抗藍(lán)耳病的豬，應(yīng)用了本發(fā)明提供的抗藍(lán)耳病豬的制備方法制備得到，在能夠保證正常存活的同時(shí)，抵抗藍(lán)耳病病毒的感染，極大的減少了養(yǎng)豬業(yè)因藍(lán)耳病造成的經(jīng)濟(jì)損失。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的豬cd163基因修飾載體的制備方法的流程圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明提供了一種用于豬cd163基因編輯的靶向sgrna，包括sgrna-c161和sgrna-c185；所述sgrna-c161的正義鏈和反義鏈分別為：c161-fwd：5’-aaagtgagctccccccagga-3’(seqidno.1)；c161-rev：5’-tcctggggggagctcacttt-3’(seqidno.2)；所述sgrna-c185的正義鏈和反義鏈分別為：c185-fwd：5’-gagaaggaagtggacagatc-3’(seqidno.3)；c185-rev：5’-gatctgtccacttccttctc-3’(seqidno.4)。在本發(fā)明中，用于豬cd163基因編輯的靶向sgrna能夠起到特異性識(shí)別豬cd163基因的作用。本發(fā)明還提供了一種豬cd163基因修飾載體，包括上述的兩條sgrna、cas9切口酶及熒光標(biāo)記蛋白，特異性強(qiáng)，能夠非常高效地通過crispr/cas9n系統(tǒng)在細(xì)胞水平上對(duì)豬cd163基因進(jìn)行編輯。要生產(chǎn)抗病的豬是需要特異性的對(duì)靶基因進(jìn)行編輯，絕對(duì)不能對(duì)基因組的其他區(qū)域進(jìn)行編輯，相比于脫靶效應(yīng)高，在非靶點(diǎn)序列的區(qū)域也能進(jìn)行基因編輯的cas9系統(tǒng)，本發(fā)明選擇crispr/cas9n系統(tǒng)而非傳統(tǒng)的crispr/cas9系統(tǒng)，利用本發(fā)明提供的豬cd163基因修飾載體對(duì)cd163基因進(jìn)行編輯，旨在在對(duì)cd163基因進(jìn)行特異的基因編輯，效率高特異性強(qiáng)的同時(shí)，徹底杜絕由于脫靶效應(yīng)對(duì)基因組上其他序列進(jìn)行基因編輯的可能。其中，熒光標(biāo)記蛋白為gfp。在本發(fā)明中，豬cd163基因修飾為針對(duì)豬cd163基因的第七外顯子進(jìn)行的基因編輯，從而破壞藍(lán)耳病病毒受體，降低豬感染藍(lán)耳病病毒的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明還提供了上述豬cd163基因修飾載體的制備方法，包括以下步驟：步驟(a)：將sgrna-c161的正義鏈和反義鏈進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，形成c161雙鏈dna分子；步驟(b)：將sgrna-c185的正義鏈和反義鏈進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，形成c185雙鏈dna分子；步驟(c)：將c161雙鏈dna分子連接到表達(dá)載體上，構(gòu)建表達(dá)sgrna-c161的載體；步驟(d)：將c185雙鏈dna分子連接到表達(dá)載體上，構(gòu)建表達(dá)sgrna-c185的載體；步驟(e)：以表達(dá)sgrna-c161的載體為模板，pcr擴(kuò)增含有u6啟動(dòng)子的sgrna-c161序列，并連接到克隆載體上，再經(jīng)過酶切后獲得u6-sgrna-c161序列；步驟(f)：將u6-sgrna-c161序列連接到表達(dá)sgrna-c185的載體上，構(gòu)建完成表達(dá)sgrna-c161和sgrna-c185的載體。其中，在步驟(c)和步驟(d)中，表達(dá)載體為帶有cas9切口酶、熒光標(biāo)記蛋白及u6啟動(dòng)子的經(jīng)過bbsⅰ酶切的px461載體；表達(dá)sgrna-c161的載體為px461-c161，表達(dá)sgrna-c185的載體為px461-c185。在步驟(e)中，克隆載體為pmd18-t載體，酶切為kpnⅰ酶切。將連接有sgrna-c161序列的pmd18-t載體進(jìn)行kpnⅰ酶切后，獲得兩端含有kpnⅰ酶切位點(diǎn)的u6-sgrna-c161序列。在步驟(f)中，表達(dá)sgrna-c185的載體為經(jīng)過kpnⅰ酶切的px461-c185，表達(dá)sgrna-c161和sgrna-c185的載體為px461-c185+c161。將兩端含有kpnⅰ酶切位點(diǎn)的u6-sgrna-c161序列連接到kpnⅰ酶切后的px461-c185上，構(gòu)建完成同時(shí)表達(dá)sgrna-c161和sgrna-c185以及cas9切口酶和gfp的載體px461-c185+c161。本發(fā)明還提供了上述的豬cd163基因修飾載體在制備抗藍(lán)耳病豬中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種抗藍(lán)耳病豬的制備方法，應(yīng)用上述的豬cd163基因修飾載體。在本發(fā)明中，將豬cd163基因修飾載體轉(zhuǎn)入豬的體細(xì)胞，獲得cd163基因編輯陽性細(xì)胞克隆，以陽性細(xì)胞為供體細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞克隆和胚胎移植，獲得抗藍(lán)耳病豬。其中，將豬cd163基因修飾載體轉(zhuǎn)入豬的體細(xì)胞的方法例如可以為，但不限于電穿孔法、顯微注射法、磷酸鈣共沉淀法或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，豬的體細(xì)胞為豬成纖維細(xì)胞，在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，豬的體細(xì)胞為豬胎兒成纖維細(xì)胞。將cd163基因編輯后的豬的體細(xì)胞作為供體細(xì)胞，卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞，通過體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得克隆胚胎；將克隆胚胎移入供體豬子宮內(nèi)妊娠獲得cd163基因編輯的抗藍(lán)耳病的豬。本發(fā)明提供的抗藍(lán)耳病豬的制備方法，應(yīng)用了本發(fā)明提供的豬cd163基因修飾載體，針對(duì)豬藍(lán)耳病中的關(guān)鍵基因cd163進(jìn)行基因編輯，從而破壞藍(lán)耳病病毒受體，并且，除了對(duì)目的基因cd163進(jìn)行編輯外不會(huì)引入其他任何外源基因，也不會(huì)對(duì)基因組上非cd163基因的區(qū)域進(jìn)行非特異的編輯，遺傳背景干凈清晰，極大的減少了后期轉(zhuǎn)基因安全評(píng)估的工作。另外，本發(fā)明還提供了一種抗藍(lán)耳病的豬，應(yīng)用上述的抗藍(lán)耳病豬的制備方法制備得到。本發(fā)明提供的抗藍(lán)耳病的豬，應(yīng)用了本發(fā)明提供的抗藍(lán)耳病豬的制備方法制備得到，在能夠保證正常存活的同時(shí)，抵抗藍(lán)耳病病毒的感染，極大的減少了養(yǎng)豬業(yè)因藍(lán)耳病造成的經(jīng)濟(jì)損失。為了有助于更清楚的理解本發(fā)明的內(nèi)容，現(xiàn)結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)介紹如下。如未明確指出，以下實(shí)施例中采用的px461載體購自addgene，貨號(hào)48140；pmd18-t載體購自takara公司；宿主菌大腸桿菌dh5α購自takara公司；引物合成由上海生工完成；序列測(cè)定由上海睿迪公司完成；質(zhì)粒小提試劑盒購自takara公司；lataq酶購自takara公司；t4dna連接酶購自takara公司；kpnⅰ內(nèi)切酶購自takara公司；bbsⅰ內(nèi)切酶購自neb公司；細(xì)胞培養(yǎng)基dmem、pbs、胎牛血清、胰酶和成纖維生長因子(bfgf)購自lifetechnologies；脂質(zhì)體lipofectamine2000購自invitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)板及培養(yǎng)皿購自thermoscientific。實(shí)施例1sgrna的設(shè)計(jì)和載體的構(gòu)建根據(jù)豬cd163基因的第七外顯子、第八外顯子及部分上下游內(nèi)含子序列(如seqidno.5所示)和mrna序列(ncbinm_213976.1，如seqidno.6所示)，在cd163基因的第七外顯子上設(shè)計(jì)兩條sgrna，為sgrna-c161和sgrna-c185，分別在其兩端加上粘性接頭序列。在每條sgrna序列f鏈的5’端加上接頭序列cacc，其反向互補(bǔ)序列r鏈的5’端添加接頭序列aaac，如果sgrna序列的5’端第一個(gè)堿基不是g，那么應(yīng)先在sgrna序列f鏈的5’端添加一個(gè)g，再加上接頭序列cacc，相應(yīng)地，其反向互補(bǔ)序列r鏈的3’端再增加一個(gè)c，以便能夠與經(jīng)bbsⅰ酶切的px461載體的粘性末端互補(bǔ)。用于構(gòu)建豬cd163基因修飾載體的sgrna-c161的正義鏈和反義鏈分別為：c161-fwd：5’-caccgaaagtgagctccccccagga-3’(seqidno.7)；c161-rev：5’-aaactcctggggggagctcactttc-3’(seqidno.8)；sgrna-c185的正義鏈和反義鏈分別為：c185-fwd：5’-caccgagaaggaagtggacagatc-3’(seqidno.9)；c185-rev：5’-aaacgatctgtccacttccttctc-3’(seqidno.10)。兩條sgrna的正義鏈和反義鏈分別在上海生工合成。將sgrna-c161和sgrna-c185的正義鏈和反義鏈用水溶解為濃度為200μm的溶液，退火體系如下：200μm正義鏈5μl200μm反義鏈5μl10×退火緩沖液2μldnase/rnase-free的水8μl總體積20μl注：10×退火緩沖液的組成包括100mmtris-hcl(ph8.0)，10mmedta(ph8.0)和1mnacl。在94℃變性5min后，取出樣品室溫放置10min使sgrna的正義鏈和反義鏈進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，形成c161雙鏈dna分子和c185雙鏈dna分子，-20℃保存。如圖1所示，px461載體用限制性內(nèi)切酶bbsⅰ進(jìn)行酶切回收后，與c161雙鏈dna分子和c185雙鏈dna分子連接，連接體系如下：16℃放置2小時(shí)，然后利用常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞并涂板。待菌落長成后，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的菌液抽提質(zhì)粒，測(cè)序鑒定sgrna-c161和sgrna-c185是否連入載體px461上。構(gòu)建完成同時(shí)表達(dá)sgrna-c161、cas9切口酶以及gfp的載體px461-c161和同時(shí)表達(dá)sgrna-c185、cas9切口酶以及gfp的載體px461-c185。以px461-c161為模板，sgrna-fwd和sgrna-rev分別為上下游引物，pcr擴(kuò)增含有u6啟動(dòng)子的sgrna-c161序列。其中，pcr引物序列為：sgrna-fwd：5’-gagggcctatttcccatgattcc-3’(seqidno.11)；sgrna-rev：5’-ggggtacctctagagccatttg-3’(seqidno.12)。pcr的反應(yīng)體系為：試劑體積(μl)px461-c161模板(1ng/μl)1上游引物sgrna-fwd(10μm)1下游引物sgrna-rev(10μm)1dntpmix(2.5mmeach)410×lataqbuffer5takaralataq(5u/μl)0.25ddh2o37.75pcr循環(huán)條件如下：pcr反應(yīng)完成后，將含有u6啟動(dòng)子的sgrna-c161序列連接到pmd18-t載體上，然后利用常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞并涂板。待菌落長成后，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的菌液抽提質(zhì)粒，再經(jīng)過kpnⅰ酶切后獲得兩端含有kpnⅰ酶切位點(diǎn)的u6-sgrna-c161序列。將兩端含有kpnⅰ酶切位點(diǎn)的u6-sgrna-c161序列連接到kpnⅰ酶切后的px461-c185上，構(gòu)建完成同時(shí)表達(dá)sgrna-c161和sgrna-c185以及cas9切口酶和gfp的載體px461-c185+c161。實(shí)施例2豬的體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及cd163基因編輯細(xì)胞克隆點(diǎn)的篩選細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：接種豬胎兒成纖維細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)中，在含有15％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)至50-70％匯合度時(shí)，按照說明書要求，用lipofectamine2000脂質(zhì)體將實(shí)施例1提供的載體px461-c185+c161轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的流式分選及單克隆培養(yǎng)：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，用0.1％的胰酶消化后，流式細(xì)胞儀分選表達(dá)gfp的陽性細(xì)胞，按照50-100個(gè)細(xì)胞/100mm培養(yǎng)皿的密度接種細(xì)胞，在含有15％胎牛血清及2.5ng/ml成纖維細(xì)胞生長因子(bfgf)的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)9至12天，至長出明顯的單細(xì)胞克隆點(diǎn)。單細(xì)胞克隆點(diǎn)cd163基因編輯情況的鑒定：將生長狀態(tài)良好的單細(xì)胞克隆點(diǎn)細(xì)胞用0.1％的胰酶消化后轉(zhuǎn)接到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長滿需要傳代時(shí)，取1/10的細(xì)胞裂解后為模板做細(xì)胞pcr，剩余細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)至長滿然后凍存到液氮中保存。用來鑒定細(xì)胞克隆點(diǎn)cd163基因編輯情況的引物為：引物名稱引物序列(5’-3’)seqidno.cd163-39ftccctgctctggtcgtgttg13cd163-527rcttccatgtcccagtgagagtt14dex7-fbttggtgagggccaattgtgtat15dex7-rbggatagaaagggcaactccaca16dex7-fsaccttgatgattgcgctctt17dex7-rstgtcccagtgagagttgcag18由于用來進(jìn)行鑒定的細(xì)胞數(shù)比較少，所以細(xì)胞裂解物先用cd163-39f和cd163-527r引物進(jìn)行pcr，沒有擴(kuò)增出特異性條帶的細(xì)胞裂解物再分別用dex7-fb/rb和dex7-fs/rs兩對(duì)引物做巢式pcr。其中，pcr的反應(yīng)體系為：試劑體積(μl)細(xì)胞裂解物或第一次pcr產(chǎn)物(1:100稀釋)5上游引物(10μm)1下游引物(10μm)1dntpmix(2.5mmeach)410×lataqbuffer5takaralataq(5u/μl)0.25ddh2o33.75pcr的循環(huán)條件為：隨機(jī)挑取20個(gè)細(xì)胞克隆點(diǎn)的pcr產(chǎn)物，膠回收后連接到pmd18-t載體上，測(cè)序分析后發(fā)現(xiàn)有18個(gè)細(xì)胞克隆點(diǎn)發(fā)生了cd163基因的編輯，為陽性細(xì)胞。其中有一個(gè)克隆點(diǎn)的細(xì)胞完全刪除了cd163基因的第七外顯子，基因編輯效率高達(dá)90％。因此，本發(fā)明提供的同時(shí)表達(dá)兩條sgrna和cas9切口酶的豬cd163基因修飾載體，可以非常高效地對(duì)靶基因cd163進(jìn)行基因編輯。發(fā)生了基因編輯的細(xì)胞克隆點(diǎn)cd163基因型結(jié)果如下表所示。最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。sequencelisting<110>浙江大學(xué)<120>用于豬cd163基因編輯的靶向sgrna、修飾載體及其制備方法和應(yīng)用<160>18<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1aaagtgagctccccccagga20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2tcctggggggagctcacttt20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gagaaggaagtggacagatc20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4gatctgtccacttccttctc20<210>5<211>1800<212>dna<213>susscrofa（豬）<400>5ctacaaggtgcggccttaaaaggaaaaaaaaaaaaattaaatcaaggactcaagagtctt60tcattatttgtgttgtggaagctatatttgttttaaagtcttagttgtgtttagaaagca120agatgttcttcaactcaaatttgggagggaacttgtttcatacatttttaatggataagt180ggcaaaattttcatgctgaggtgatctatagtgttgtaatgcagaatatagtcagatctt240gaacattttaggaagttggtgagggccaattgtgtatctgtgccatgctgataagaatgt300caagggatcacaagaattcgtgttatttgacagcagtcatctttaaaaggcatttgagaa360agtccaatttcaaatgcatttcctttctttaaaagataaattgaagaaaataagtcttta420tttcccaagtaaattgaattgcctctcagtctgttaaaagaaactcttaccttgatgatt480gcgctcttaacctggcaaagattgtctttaaaatctgagctccatgtcttctgctttatt540tctggtgtgcctttgactccagattacagtaaatggaggactgagtatagggctaaaaag600tagagagaatggatgcatattatctgtggtctccaatgtgatgaatgaagtaggcaaata660ctcaaaggaaagagaaagcatgctccaagaattatgggttccagaaggcaaagtcccaga720attgtctccagggaaggacagggaggtctagaatcggctaagcccactgtaggcagaaaa780accaagaggcatgaatggcttccctttctcacttttcactctctggcttactcctatcat840gaaggaaaatattggaatcatattctccctcaccgaaatgctatttttcagcccacagga900aacccaggctggttggaggggacattccctgctctggtcgtgttgaagtacaacatggag960acacgtggggcaccgtctgtgattctgacttctctctggaggcggccagcgtgctgtgca1020gggaactacagtgcggcactgtggtttccctcctggggggagctcactttggagaaggaa1080gtggacagatctgggctgaagaattccagtgtgaggggcacgagtcccacctttcactct1140gcccagtagcaccccgccctgacgggacatgtagccacagcagggacgtcggcgtagtct1200gctcaagtgagacccagggaatgtgttcactttgttcccatgccatgaagagggtagggt1260taggtagtcacagacatctttttaaagccctgtctccttccaggatacacacaaatccgc1320ttggtgaatggcaagaccccatgtgaaggaagagtggagctcaacattcttgggtcctgg1380gggtccctctgcaactctcactgggacatggaagatgcccatgttttatgccagcagctt1440aaatgtggagttgccctttctatcccgggaggagcaccttttgggaaaggaagtgagcag1500gtctggaggcacatgtttcactgcactgggactgagaagcacatgggagattgttccgtc1560actgctctgggcgcatcactctgttcttcagggcaagtggcctctgtaatctgctcaggt1620aagagaataagggcagccagtgatgagccactcatgacggtgccttaagagtgggtgtac1680ctaggagttcccattgtggctcagtggtaacaaactcgactggtatccatgagggtatgg1740gtttgatccctggccttgctcaatgggttaaggatccagcattgctgtgagctgtggtat1800<210>6<211>3400<212>rna<213>susscrofa（豬）<400>6atggtgctacttgaagactctggatctgcagactttagaagatgttctgcccatttaagt60tccttcacttttgctgtagtcgctgttctcagtgcctgcttggtcactagttctcttgga120ggaaaagacaaggagctgaggctaacgggtggtgaaaacaagtgctctggaagagtggag180gtgaaagtgcaggaggagtggggaactgtgtgtaataatggctgggacatggatgtggtc240tctgttgtttgtaggcagctgggatgtccaactgctatcaaagccactggatgggctaat300tttagtgcaggttctggacgcatttggatggatcatgtttcttgtcgagggaatgagtca360gctctctgggactgcaaacatgatggatggggaaagcataactgtactcaccaacaggat420gctggagtaacctgctcagatggatctgatttagagatgaggctggtgaatggaggaaac480cggtgcttaggaagaatagaagtcaaatttcaagagcggtggggaacagtgtgtgatgat540aacttcaacataaatcatgcttctgtggtttgtaaacaacttgaatgtggaagtgctgtc600agtttctctggttcagctaattttggagaaggttctggaccaatctggtttgatgatctt660gtatgcaatggaaatgagtcagctctctggaactgcaaacatgaaggatggggaaagcac720aattgcgatcatgctgaggatgctggagtgatttgcttaaatggagcagacctgaaactg780agagtggtagatggactcactgaatgttcaggaagattggaagtgaaattccaaggagaa840tggggaacaatctgtgatgatggctgggatagtgatgatgccgctgtggcatgtaagcaa900ctgggatgtccaactgctgtcactgccattggtcgagttaacgccagtgagggaactgga960cacatttggcttgacagtgtttcttgccatggacacgagtctgctctctggcagtgtaga1020caccatgaatggggaaagcattattgcaatcataatgaagatgctggtgtgacatgttct1080gatggatcagatctggaactgagacttaaaggtggaggcagccactgtgctgggacagtg1140gaggtggaaattcagaaactggtaggaaaagtgtgtgatagaagctggggactgaaagaa1200gctgatgtggtttgcaggcagctgggatgtggatctgcactcaaaacatcatatcaagtt1260tattccaaaaccaaggcaacaaacacatggctgtttgtaagcagctgtaatggaaatgaa1320acttctctttgggactgcaagaattggcagtggggtggacttagttgtgatcactatgac1380gaagccaaaattacctgctcagcccacaggaaacccaggctggttggaggggacattccc1440tgctctggtcgtgttgaagtacaacatggagacacgtggggcaccgtctgtgattctgac1500ttctctctggaggcggccagcgtgctgtgcagggaactacagtgcggcactgtggtttcc1560ctcctggggggagctcactttggagaaggaagtggacagatctgggctgaagaattccag1620tgtgaggggcacgagtcccacctttcactctgcccagtagcaccccgccctgacgggaca1680tgtagccacagcagggacgtcggcgtagtctgctcaagatacacacaaatccgcttggtg1740aatggcaagaccccatgtgaaggaagagtggagctcaacattcttgggtcctgggggtcc1800ctctgcaactctcactgggacatggaagatgcccatgttttatgccagcagcttaaatgt1860ggagttgccctttctatcccgggaggagcaccttttgggaaaggaagtgagcaggtctgg1920aggcacatgtttcactgcactgggactgagaagcacatgggagattgttccgtcactgct1980ctgggcgcatcactctgttcttcagggcaagtggcctctgtaatctgctcagggaaccag2040agtcagacactatccccgtgcaattcatcatcctcggacccatcaagctctattatttca2100gaagaaagtggtgttgcctgcatagggagtggtcaacttcgcctggtcgatggaggtggt2160cgttgtgctgggagagtagaggtctatcctggggcatcctggggcaccatctgtgatgac2220agctgggacctgaatgatgcccatgtggtgtgcaaacagctgagctgtggatgggccatt2280aatgccactggttctgctcattttggggaaggaacagggcccatttggctggatgagata2340aactgtaatggaaaagaatctcatatttggcaatgccactcacatggttgggggcggcac2400aattgcaggcataaggaggatgcaggagtcatctgctcagagttcatgtctctgagactg2460atcagtgaaaacagcagagagacctgtgcagggcgcctggaagttttttacaacggagct2520tggggcagcgttggcaggaatagcatgtctccagccacagtgggggtggtatgcaggcag2580ctgggctgtgcagacagaggggacatcagccctgcatcttcagacaagacagtgtccagg2640cacatgtgggtggacaatgttcagtgtcctaaaggacctgacacactatggcagtgcccc2700tcatctccatggaagaagagactggccagcccctcagaggagacatggatcacatgtgcc2760aacaaaataagacttcaagaaggaaacactaattgttctggacgtgtggagatctggtac2820ggaggttcctggggcactgtgtgtgacgactcctgggaccttgaagatgctcaggtggtg2880tgccgacagctgggctgtggctcagctttggaggcaggaaaagagcccgcatttggccag2940gggactgggcccatatggctcaatgaagtgaagtgcaaggggaatgaaccctccttgtgg3000gattgtcctgccagatcctggggccacagtgactgtggacacaaggaggatgctgctgtg3060acgtgctcagaaattgcaaagagccgagaatccctacatgccacaggtcgctcatctttt3120gttgcacttgcaatctttggggtcattctgttggcctgtctcatcgcattcctcatttgg3180actcagaagcgaagacagaggcagcggctctcagttttctcaggaggagagaattctgtc3240catcaaattcaataccgggagatgaattcttgcctgaaagcagatgaaacggatatgcta3300aatccctcaggagaccactctgaagtacaatgaaaaggaaaatgggaattataacctggt3360gagttcagcctttaagataccttgatgaagacctggacta3400<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列<400>7caccgaaagtgagctccccccagga25<210>8<211>25<212>dna<213>人工序列<400>8aaactcctggggggagctcactttc25<210>9<211>24<212>dna<213>人工序列<400>9caccgagaaggaagtggacagatc24<210>10<211>24<212>dna<213>人工序列<400>10aaacgatctgtccacttccttctc24<210>11<211>23<212>dna<213>人工序列<400>11gagggcctatttcccatgattcc23<210>12<211>22<212>dna<213>人工序列<400>12ggggtacctctagagccatttg22<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列<400>13tccctgctctggtcgtgttg20<210>14<211>22<212>dna<213>人工序列<400>14cttccatgtcccagtgagagtt22<210>15<211>22<212>dna<213>人工序列<400>15ttggtgagggccaattgtgtat22<210>16<211>22<212>dna<213>人工序列<400>16ggatagaaagggcaactccaca22<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列<400>17accttgatgattgcgctctt20<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列<400>18tgtcccagtgagagttgcag20當(dāng)前第1頁12