一種腫瘤靶向性mri造影劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種腫瘤靶向性MRI造影劑及其制備方法，其特征在于：所述造影劑中包括小分子釓螯合物部分和靶向載體部分，小分子釓螯合物部分和靶向載體部分通過共價鍵偶聯；其中，所述小分子釓螯合物部分為Gd?DO3A；所述靶向載體部分包含EBP分子。本發(fā)明的造影劑弛豫增強能力好，而且可以靶向性結合腫瘤細胞的EGFR，不僅具有很強的靶向造影效果，同時還延長了造影劑在體內的成像時間，從而可以減少造影劑的添加劑量，具有很強的實用性。
【專利說明】
-種腫瘤卽向性MR I造影劑及其制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及醫(yī)學影像學領域，具體是指一種腫瘤祀向性MRI造影劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 基于小分子禮馨合物造影劑的動態(tài)磁共振成像(MRI)技術現已成為惡性腫瘤的重 要臨床檢查手段，在腫瘤發(fā)現、診斷、臨床分期和療效評估及預后判斷上發(fā)揮越來越重要的 作用。并且，隨著科技的發(fā)展，構建具有腫瘤組織特異性的新一代高效、低毒MRI造影劑成為 材料、醫(yī)學等領域的研究熱點。
[0003] 目前，商業(yè)化并應用于臨床的小分子禮馨合物造影劑主要有二乙基Ξ胺五乙 酸（Gd-DTPA，Magnevisr )及其衍生物（Gd-DTPA-BMA，Omiiiscan?和Gd-DTPA-BMEA， OptiMARK?);禮-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二燒-1，4，7，10-四乙酸(Gd-DOTA，Dotarem?) 及禮-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二燒-1，4，7-Ξ乙酸（Gd-D03A)衍生物（Gd-D03A-butrol， Gadovist? 和 Gd-HP-D03A，抗沿掃批ice?)。
[0004] 但是，W上MRI造影劑均為細胞外試劑，在體內呈非特異性分布，其造影增強作用 依賴于腫瘤組織豐富的血供，對腫瘤細胞本身沒有特異選擇性，所WMRI腫瘤成像仍存在特 異性不高(與某些富血供的良性腫瘤鑒別困難)和對部分血供尚不夠豐富的早期癌(如原位 導管癌)敏感性不高等方面的主要問題。且上述造影劑經靜脈注射后，迅速漏到血管外并被 腎臟清除，體內停留時間短，有時為了達到診斷目的，不得不加大劑量，從而增加了出現不 良反應的風險。
[0005] 為了提高MRI腫瘤成像的特異性、敏感性和減少不良反應，需要利用腫瘤細胞比非 腫瘤細胞(如:正常細胞）中有更高表達和/或異常表達的受體作為祀點，借助配體與受體的 結合具有高特異性、高選擇性和高親和力等生物學特性，將配體作為載體與禮馨合物結合 形成化合物。當運些偶聯物進入體內后，識別腫瘤細胞膜上特異性受體并與之結合，到達腫 瘤區(qū)域，從而，提升組織間的圖像對比，對受體過表達腫瘤具有良好的MRI增強效應。
[0006] 利用配體-受體反應祀向輸送禮馨合物，需要該受體在祀細胞(腫瘤細胞）中比其 他細胞有更高的表達，才能通過配體-受體途徑使祀細胞結合高濃度的禮馨合物造影劑，并 與非祀細胞形成明顯差異，W實現禮馨合物祀向腫瘤的定向輸送。比如申請?zhí)枮?201310625257.1的中國專利《一種氧化禮祀向磁共振造影劑》，利用葉酸修飾的聚乙二醇化 的Gd2〇3作為造影劑，但是該造影劑僅能祀向葉酸受體高表達的腫瘤細胞，只能用于腦膠質 瘤的造影的早期診斷。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的是根據上述不足提供一種腫瘤祀向性MRI造影劑及其制備方法，該 MRI造影劑可W識別腫瘤細胞膜上特異性受體并與之結合，到達腫瘤區(qū)域，從而提升組織間 的圖像對比，對受體過表達腫瘤具有良好的MRI增強效應。
[0008] 本發(fā)明的技術方案如下：一種腫瘤祀向性MRI造影劑，其特征在于:所述造影劑中 包括小分子禮馨合物部分和祀向載體部分，小分子禮馨合物部分和祀向載體部分通過共價 鍵偶聯;其中，所述小分子禮馨合物部分為Gd-D03A;所述祀向載體部分包含邸P分子。
[0009] 優(yōu)選的，所述祀向載體部分為R-邸P分子，其中R為二簇酸、聚乙二醇(PEG)、N-( 2- 徑基丙基)-甲基丙締酷胺化PMA)或聚酷胺-胺型(PAMAM)樹形大分子聚合物中的一種。
[0010] 更優(yōu)選的，所述祀向載體部分為辛二酸-EBP分子。
[0011] 優(yōu)選的，所述共價鍵為酷胺鍵或雙硫鍵。
[0012] -種如上述腫瘤祀向性MRI造影劑的制備方法，其步驟包括:將003Α-Ξ叔下基乙 二胺與邸Ρ分子進行酷胺縮合得至化BP-D03A，然后與Gd(0Ac)3反應即得到所述MRI造影劑。
[0013] 優(yōu)選的，所述D03A-S叔下基乙二胺是將Ξ叔下基-D03A經過氯基取代，氨基化，然 后經過還原后得到的。
[0014] 優(yōu)選的，將R與邸P分子縮合后得至化-EBP，然后再將R-EBP與D03A-S叔下基乙二胺 進行酷胺縮合得到D03A-R-EBP，最后將D03A-R-EBP與Gd (OAc) 3反應即得到所述祀向載體部 分為R-EBP分子。
[0015] 現已證實，與非腫瘤細胞相比，表皮生長因子受體（epidermalgrowth factor rec邱tor，EGFR)在肺癌、乳腺癌、結腸癌、肝癌、卵巢癌、膀脫癌、腦膠質瘤W及頭頸部腫瘤 等癌細胞中存在高表達或過表達，并發(fā)現EGFR的異常過表達與腫瘤細胞的惡變、粘附、轉移 W及血管生成等密切相關。多年來，針對EGFR的單克隆抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑已 被臨床廣泛用于腫瘤的治療，因此，EGFR作為陽性表達腫瘤的重要祀標，已經被深入的研究 和臨床應用。
[0016] 表皮生長因子化GF)是EGFR最重要的配體，它與EGFR的結合具有高特異性、高選擇 性和高親和力。Komoria等人報道，EGF中CMYIEALDKYAC序列是與EGFR結合的活性區(qū)域，故稱 該活性膚段為EGFR結合膚化GFR-binding peptide,EBP)。鑒于EGFR在許多惡性腫瘤中都存 在著陽性表達，W及邸P與EGFR結合的特異性，本發(fā)明將邸巧I入到Gd-D03A分子中進行分子 修飾和改造，形成具有針對EGFR分子的腫瘤祀向性禮馨合物。它們作為腫瘤祀向性MRI對比 劑，進入體內后，準確到達腫瘤組織并與細胞EGFR結合，表現出較高的弛豫效能，不僅能明 顯提高MRI腫瘤成像的特異性和敏感性，可為解決目前臨床MRI在早期原位癌和浸潤性癌診 斷評估中出現的問題提供重要信息，而且能為腫瘤的分子分型和分子祀向藥物療效的在體 評估提供重要信息，對于指導和監(jiān)測分子祀向藥物的應用也有極大的應用前景。
【附圖說明】
[0017] 圖巧本發(fā)明的造影劑和城舶對sf造影劑作用于不同EGFR表達水平細胞的富集 濃度直方圖；
[0018] 圖2為預先使用EGFR抑制劑后，本發(fā)明的造影劑和Gadovist'i'造影劑作用于不同 EGFR表達水平細胞的富集濃度直方圖；
[0019] 圖3為本發(fā)明的造影劑和Gadovkt"造影劑作用于不同EGFR表達水平細胞的體外 核磁共振Τι加權成像對比圖；
[0020] 圖4為預先使用EGFR抑制劑后，本發(fā)明的造影劑和Gadovist'K·造影劑作用于不同 EGFR表達水平細胞的體外核磁共振Τι加權成像對比圖；
[0021] 圖5為荷瘤裸鼠注射本發(fā)明的造影劑和Gadovist'K造影劑前后MRI掃描對比圖。
【具體實施方式】
[0022] W下結合附圖通過具體實施例進一步說明本發(fā)明：
[0023] W下未詳細說明的部分均為本領域技術人員知曉的現有技術可W實現。
[0024] 實施例 1 :D03A-tris(t-Bu)-EN(D03A-S 叔下基乙二胺）的合成
[0025] 將4.0g D03A-tris(t-BuKD03A-S叔下基醋)和4.3g K2CO3溶解于40血乙臘中，攬 拌化后加入0.65mL漠乙臘，繼續(xù)攬拌使其反應化，反應完全后，通過G4燒結漏斗過濾反應 物，減壓旋轉蒸發(fā)除去溶劑，硅膠柱層析得一膠狀物。然后，用30mL 7N氨/甲醇溶解上述膠 狀中間產物，加入1.5g雷尼儀(Ra-Ni)催化劑后，將混合物在室溫和50psi此下攬拌化，反 應完全后通過G4燒結漏斗過濾反應物，減壓旋轉蒸發(fā)除去溶劑，硅膠柱層析得D03A-tris (t-Bu)-ENo
[0026] 實施例 2:Gd-D03A-EBP 的合成
[0027] 將〇.88g D03A-tris(t-Bu)-EN、0.8g 邸P和0.33g 1-徑基苯并Ξ氮挫化0化）溶于 5mL DMF中，加0.35mL N-甲基嗎嘟(NMM)，0°C攬拌15min后加入0.23mg N-(3-二甲氨基丙 基)-Ν'-乙基碳二亞胺化DC)，繼續(xù)攬拌使其過夜，反應完全后減壓旋轉蒸發(fā)除去溶劑，HPLC 純化，凍干，得白色粉狀物D03A-EBP。將D03A-tr i S (t-Bu) -SH與EBP在DMS0中，加入雙氧水，0 。(:攬拌化得到雙硫鍵連接的D03A-EBP。
[002引 稱取96mg D03A-EBP，溶于lOmL水中，加過量Gd(0Ac)3,滴加0.01N化0H調節(jié)pH至 5.5~6.0后，50°(：下攬拌反應48}1，用乙二胺四乙酸化0了4)二鐘除去游離的6(13+，制成6(1- D03A-邸P。
[0029] 實施例 3:Gd-D03A-8-Aoc-EBP 的合成
[0030] 取0.5g EBP溶入40mL DMF中，加0.2g B0P試劑和O.lg HOBt，室溫下攬拌，滴加 0.6mL N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)后加0.32g辛二酸，室溫下攬拌1小時，真空減壓去溶劑， 用lOmL乙酸乙醋結晶萃取，HPLC純化得半辛二酸酢-EBP。另將0.28g D03A-tri S (t-Bu)-EN、 0.16g半辛二酸酢-EBP和0.33巧0化溶于5mL DMF中，加0.35mLNMM，0°C攬拌15min后加入 0 . Img抓C，繼續(xù)攬拌使其過夜，反應完全后減壓旋轉蒸發(fā)除去溶劑，冊LC純化，凍干，得 D03A-8-AOC-EBP。稱取96mg D03A-8-AOC-EBP，溶于 10血水中，加過量Gd(OAc)3，滴加0.01N NaOH調節(jié)pH至5.5~6.0后，50 °C下攬拌反應4她，用邸ΤΑ二鐘除去游離的Gd3%制成6(1-003八- S-Aoc-EBP。
[0031] 實施例 4:Gd-D03A-PEG-EBP 的合成
[0032] 取143mg D03A-tris(t-Bu)-EN溶入4血氯仿中，加 340mg簇基-聚乙二醇-馬來酷亞 胺(MAレPEG-C00H)和O.SmLS氣乙酸（TEA)混勻，室溫下反應化，真空干燥去除氯仿和TEA 后，加 PBS和去離子水，透析，加無水乙二酸沉淀，用10血Ξ氣乙酸/二氯甲燒（1:1)發(fā)生脫叔 下基反應，得D03A-PEG-MAL。另取78mg EBP和300m曲03A-陽G-MAL，溶入lOmL 0.1M憐酸鋼 (94.7mM化2HP04，5.3mM化肥P04，抑8.0)中，室溫避光攬拌反應2地，制得D03A-PEG-EBP。 稱取46mg D03A-PEG-EBP，溶解于5mL水中，等完全溶解后，加過量Gd (OAc )3，滴加 0.01N NaOH調節(jié)pH至5.5~6.0后，50 °C下攬拌反應4她，用邸TA二鐘除去游離的Gd3%制成Gd-D03A- 陽G-邸P。
[0033] 實施例5:p-SCN-Bn-D03A(2-[(4-異硫氯基苯基）甲基]-D03A)的合成
[0034] 1.5g D03A-S叔下基醋溶入30mL乙臘中，加 l.Og化肥〇3和0.626g對硝基漠節(jié)，50 °C下攬拌反應2地，過濾，真空減壓去溶劑，反應物用15mL甲醇-Pd/C(90%甲醇、10%Pd/C) 溶解，在室溫和50psi此下攬拌化，交替使用甲醇（3X20mU和二氯甲燒(3X20mU洗涂，反 應物溶入20mL DMF，加1.18g K0H，滴加二硫化碳，在氮氣保護下于45°C反應7.化，抽濾后加 入20mL甲苯在60°C下真空干燥，將所得化合物懸浮于20mL無水二氯乙燒中，滴入4mL溶有 1.48g二(Ξ氯甲基)碳酸醋的二氯乙燒溶液，滴加時間2h。滴完后在45 °C反應15h，用10血Ξ 氣乙酸/二氯甲燒(1:1)發(fā)生脫叔下基反應，經MS檢測，HPLC純化，凍干，得p-SCN-Bn-D03A。
[0035] 實施例 6 :Gd-D03A-HPMA-EBP 的合成
[0036] P-SCN-&1-D03A產物用lOmL DMF溶解，加 0.12gAPMA和lOmgDI陽A，通入氮氣，室溫 下攬拌反應24h，過濾，硅膠柱層析，得D03A-APMA。
[0037] 另取 148mg HPMA、30mg MA-GG-EBP、42mg D03A-APMA和Img偶氮二異下臘，加入2mL 10%丙酬/二甲基亞諷(v/v)，通入氮氣，50°C下反應22h，交替使用過量的丙酬和二乙酸沖 洗，再加甲醇，透析，真空干燥得聚合物D03A-APMA-冊MA-邸P。稱取96mgD03A-APMA-冊MA- 邸P，溶于lOmL水中，加過量Gd(OAc)3，滴加0.01N化0H調節(jié)抑至5.5~6.0后，50°C下攬拌反 應4她，用邸TA二鐘除去游離的Gd3%制成Gd-D03A-HPMA-EBP。
[003 引 實施例 7 :Gd-D03A-PAMAM-EBP 的合成
[0039] 取lOOmg PAMAM溶入20ml PBS(pH 8.0)中，加 121mg
[0040] MAL-PEG3500-NHS，室溫下反應化，經離屯、式超濾器(濾膜cutof f = lOkDa)過濾，溶 入10血lOOmM憐酸鋼（94.7mM Na2HP04,5.3mMNa肥P04，p冊.0)中，加82mg邸P，室溫避光攬 拌反應24h后過濾（濾膜cutoff = 3kDa)，溶入DMF中，再加53mg p-SCN-Bn-D03A和 lOmgDIPEA，通入氮氣，室溫下反應24h后過濾（濾膜cutoff = 3W)a)，再用10ml水溶解，加過 量Gd(OAc)3，滴加0.0IN化OH調節(jié)抑至5.5~6.0后，50°C下攬拌反應4她，用乙二胺四乙酸 化DTA)二鐘除去游離的Gd3%制成目標產物。
[0041 ] 實施例8:造影劑弛豫率η測定
[0042] 用弛豫率ri表征造影劑的弛豫增強能力。本發(fā)明在室溫下，利用核磁共振成像儀， 分別測定上述實施例中 Gd-D03A-邸 P、Gd-D03A-8-Aoc-EBP、Gd-D03A-PEG-EBP、Gd-D03A- HPMA-EBP和Gd-D03A-PAMAM-EBP造影劑的弛豫率ri，并與市售的醫(yī)用小分子MRI造影劑Gd- D03A-butrol(Gad〇vist?，加樂顯)相比較，評估本發(fā)明造影劑的弛豫增強能力。
[0043] 稱取一定量的本發(fā)明造影劑測試樣品（采用高頻電感截合等離子體發(fā)射光譜法 (ICP-AES)ii量樣品中Gd3+含量，按樣品中的Gd3+含量計），W水為溶劑，分別配制成0、0.2、 0.4、0.8、1.2、1.6和2. Ommol/L系列濃度的溶液，采用反轉恢復法測定不同濃度樣品的弛豫 時間Τιω和純水的馳豫時間Τι(ο)，按照公式:;ri=[l/Ti(o) -l/Ti(i)]/cM計算相應樣品的弛豫 率ri，式中CM為溶液中Gd3+的摩爾濃度。
[0044] 檢測結果為，本發(fā)明的 Gd-D03A-邸 P、Gd-D03A-8-Aoc-EBP、Gd-D03A-陽 G-邸P、Gd- D03A-冊MA-EBP和Gd-D03A-PAMAM-EBP造影劑在水溶液中的ri分別是7.28、9.45、13.56、 20.7和23.11.臟〇1-1.3-1，而〇3如^181；、'在水溶液中的^只有3.621?臟〇^1?3-1。表明本 發(fā)明造影劑的弛豫率ri，均高于商業(yè)化的MRI造影劑Gadovi st的弛豫率ri。
[0045] 實施例9:體外細胞富集試驗
[0046] 取對數生長期的EGFR高表達人乳腺癌細胞MDA-MB-453、人肺癌細胞肥C97、人胃癌 細胞SGC-7901、人結腸癌細胞SW480和EGFR低表達人神經膠質瘤細胞U13MG，膜酶消化，收集 細胞，離屯、，培養(yǎng)液重懸細胞，計數。W每瓶IX 1〇7個細胞的數量置入細胞培養(yǎng)瓶中，在37 °C、C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后分Gd-D03A-EBP、Gd-D03A-8-Aoc-EBP、Gd-D03A-PEG-EBP、Gd- D03A-HPMA-EBP、Gd-D03A-PAMAM-EBP實驗組和Gd-D03A-bu化ol (Gadovist'i，加樂顯）對照 組。各組小屯、移去細胞培養(yǎng)液后加扣Μ的造影劑(濃度W各測試物中所含Gd3+計），細胞繼續(xù) 在37 °C、0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)化或12h。移去培養(yǎng)液后用PBS沖洗Ξ次細胞，膜酶消化，離屯、收 集，加200化、謹鹽酸、80°C處理細胞20min，離屯、（12000以111111，10111111)，取上清進行1〔?檢測 Gd3+濃度。實驗數據采用SPSS 13.0for Windows軟件處理，W均數±標準差(x±s)表示。檢 測結果見圖1。
[0047] 如圖 1所示，用 Gd-D03A-EBP、Gd-D03A-8-Aoc-EBP、Gd-D03A-PEG-EBP、Gd-D03A- HPMA-EBP和Gd-D03A-PAMAM-EBP造影劑生物解育細胞化或1化后，在EGFR高表達細胞(10八- 18-453、5胖480、56(：-7901、肥〔97)內6(13+含量高，66尸1?低表達細胞(1]1316)內6(1 3+含量低，高 表達與低表達細胞比較，有顯著性差異(P<〇.〇5)。而用Gd-D03A-bu化〇1(對照）處理的細胞 化或1化后，5株細胞內Gd3+含量無顯著差異(P〉0.05; t檢驗）。
[004引結果表明，細胞富集Gadovist造影劑與EGFR表達無關，而細胞富集腫瘤祀向性造 影劑與EGFR的表達水平密切相關。
[0049] 實施例10:體外細胞富集抑制試驗
[0050] 單克隆抗體C225是EGFR抑制劑，試驗預先應用C225處理細胞W封閉細胞EGFR，再 用造影劑解育細胞，然后檢測細胞Gd3+濃度，判斷EGFR抑制劑封閉受體是否影響細胞與造影 劑的結合。
[0051 ] 具體步驟是取對數生長期的EGFR高表達MDA-MB-453、肥C97、SGC-7901、SW480細胞 和EGFR低表達U13MG細胞，膜酶消化，收集細胞，離屯、，培養(yǎng)液重懸細胞，計數。W每瓶1 X 1〇7 個細胞的數量置入細胞培養(yǎng)瓶中，在37°C、0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后分Gd-D03A-EBP、Gd- D03A-8-Aoc-EBP、Gd-D03A-陽G-邸P、Gd-D03A-HPMA-邸P、Gd-D03A-PAMAM-EBP 實驗組和 Gd- D〇3A-butr〇l (Oackyvist?，加樂顯)對照組。各組小屯、移去細胞培養(yǎng)液后加 Srt的造影劑(濃 度W各巧聯物中所含Gd3+計），細胞繼續(xù)在37°C、C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)化或12h。移去培養(yǎng)液后用 PBS沖洗Ξ次細胞，膜酶消化，離屯、收集，加200yL、1M鹽酸、80°C處理細胞20min，離屯、（12， 000r/min，10min)，取上清進行ICP檢測Gd3+濃度。實驗數據采用SPSS 13.Ofor Windows軟件 處理，W均數±標準差(x±s)表示。檢測結果見圖2。
[0052] 如圖2所示，預先用C225封閉EGFR后，再用腫瘤祀向性禮類衍生物處理細胞化或 12h，與未用抑制劑預處理的細胞相比（圖1)，EGFR高表達的MDA-MB-453、肥C97、SGC-7901、 SW480細胞和EGFR低表達U13MG細胞中，Gd3+濃度均降低，差異非常顯著(P<0.01;t檢驗），說 明EGFR抑制劑明顯抑制了本發(fā)明造影劑與細胞的結合，導致細胞Gd3+濃度下降明顯，也表明 本發(fā)明造影劑與細胞EGFR有關。
[0053] 然而，預先用C225封閉EGFR后，再用非腫瘤祀向性MRI造影劑Gadovist"'處理細胞 化或12h，與未用抑制劑預處理的細胞相比，EGFR高表達的MDA-MB-453、HCC97、SGC-7901、 SW480細胞和EGFR低表達U13MG細胞中，Gd3+濃度無明顯差異(P〉0.05; t檢驗），表明細胞Gd3+ 濃度不受EGFR抑制劑預處理的影響，也說明細胞結合Gackwist?與細胞EGFR無關。
[0054]實施例11:體外細胞磁共振成像試驗
[0055] 取對數生長期的EGFR高表達MDA-MB-453、肥C97、SGC-7901、SW480細胞和EGFR低表 達U13MG細胞，W每支1 X 1〇5個細胞數置入E郵endorf·管內，分Gd-D03A-EBP、Gd-D03A-8- Aoc-EBP、Gd-D03A-PEG-邸 P、Gd-D03A-HPMA-EBP 和 Gd-D03A-PAMAM-EBP 實驗組和 Gd-D03A- butroKGadovist'ii，加樂顯)對照組。各組小屯、移去細胞培養(yǎng)液后力日扣Μ的造影劑(濃度W各 測試物中所含Gd3+計）的新鮮培養(yǎng)液ImL，37°C解育24小時。PBS沖洗Ξ次，除去未與細胞結合 的對比劑，加固定液ImL至Eppendo計管內，然后進行磁共振掃描檢查。檢測不同化pendorf 管內細胞團圖像信號強度。如圖3。
[0056]腫瘤祀向性和非祀向性造影劑的體外Τι加權成像效果通過檢測不同EGFR表達水 平細胞的圖像來表現。從圖3中可W看出，在相同濃度下，6(1-0034斗8口、6(1-0034-8-4〇(3- 邸P、Gd-D03A-PEG-EBP、Gd-D03A-HPMA-EBP 和 Gd-D03A-PAMAM-EBP 造影劑生物作用于 EGFR 高 表達的MDA-MB-453、HCC97、SGC-7901和SW480細胞，成像的亮度高于EGFR低表達的U13MG細 胞，表明本發(fā)明的造影劑具有祀向EGFR作用，能提高EGFR陽性表達腫瘤的成像信號強度。 [0化7]從圖3中也可W看出，盡管相同濃度的Ga過0對別?作用于不同EGFR表達水平的細 胞，EGFR高表達的MDA-MB-453、HCC97、SGC-7901和SW480細胞，成像的亮度與EGFR低表達的 U13MG細胞之間無明顯差異，表明盡adovisf的細胞成像與EGFR無關。
[005引實施例11:體外細胞磁共振成像抑制試驗
[0059] 應用C225預處理細胞，再用對比劑解育細胞，然后進行MR檢查，觀察抑制劑對細胞 對比增強的影響。
[0060] 取對數生長期的EGFR高表達MDA-MB-453、肥C97、SGC-7901、SW480細胞和EGFR低表 達U13MG細胞，W每支1 X 1〇5個細胞數置入E郵endorf·管內，分Gd-D03A-EBP、Gd-D03A-8- Aoc-EBP、Gd-D03A-PEG-邸 P、Gd-D03A-HPMA-EBP 和 Gd-D03A-PAMAM-EBP 實驗組和 Gd-D03A- butroKGadovisi%加樂顯)對照組。各組小屯、移去細胞培養(yǎng)液后力日扣Μ的測試物(濃度W各 測試物中所含Gd3+計）的新鮮培養(yǎng)液ImL，37 °C解育24小時。PBS沖洗Ξ次，除去未與細胞結合 的對比劑，加固定液ImL至Eppendo計管內，然后進行磁共振掃描檢查。檢測不同化pendorf 管內細胞團圖像信號強度(見圖4)。
[0061 ] 預先用C225處理細胞，再用Gadovist解育細胞，與未用C225相比，不同EGFR表達水 平的參試細胞體外Τι加權成像效果無顯著差異（圖3和圖4)，表明Gadovist的成像效果與 EGFR無關。
[0062] 先用 C225 處理細胞，再用 Gd-D03A-EBP、Gd-D03A-8-Aoc-EBP、Gd-D03A-PEG-EBP、 Gd-D03A-HPMA-EBP和Gd-D03 A-PAMAM-EBP造影劑解育細胞，與未用抑制劑C2 2 5相比，EGFR高 表達MDA-MB-453、HCC97、SGC-7901、SW480細胞和EGFR低表達U13MG細胞，成像的亮度減弱 (圖3和圖4)，結果顯示C225明顯抑制了細胞富集本發(fā)明的造影劑，導致體外細胞Τι加權成 像效果明顯下降，表明本發(fā)明的造影劑與細胞的結合與EGFR密切相關。
[0063] 實施例12:體內人乳腺癌移植瘤磁共振成像動物試驗
[0064] 選擇5~6周齡、體重18~2?的SPF級BALB/c裸鼠為實驗動物。取對數生長期人乳 腺癌MDA-MB-453細胞，用不含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調整細胞數為1.5 X ΙΟ7個/mL， 取0.2mL細胞懸液接種至小鼠右側近后肢皮下，2周后選擇腫瘤生長良好且無壞死的動物， 頸椎脫白處死，無菌條件下取出實體瘤，切成直徑約2mm大小的瘤塊，用20號穿刺針移植至 裸鼠右側近后肢皮下。腫瘤移植后2周，選擇腫癌生長良好的小鼠為移植瘤動物模型。乳腺 癌移植瘤小鼠隨機分為 Gd-D03A-邸 P、Gd-D03A-8-Aoc-EBP、Gd-D03A-PEG-EBP、Gd-D03A- HPMA-EBP 和Gd-D03A-PAMAM-EBP 實驗組和 Gd-D03A-bu 化〇1 (GadoviSt?，加樂顯）對照組，每 組10只，雌、雄各半。移植腫瘤后第14天，分別經尾靜脈注射造影劑其中所含Gd3+含量計， 按0.05mmo 1-Gd37kg劑量注射），分別于注射前(0)和注射后（1、2和4小時)進行MRI檢查，結 果見圖5。
[0065] 結果顯示，Gadovist對照組注射對比劑后比與注射前相比，瘤體信號強度升高，差 異顯著，但隨著時間延長(化和4h后），瘤體信號強度明顯減弱，與注射前相比無顯著差異， 說明Gadovist"進入體內后迅速漏到血管外，成像作用時間短。
[0066] 而 Gd-D03A-??？、6(1-0034-8-4〇。斗8?、6(1-0034斗66斗8?、6(1-0034-冊魁斗8?和6(1- D03A-PAMAM-EBP造影劑實驗組裸鼠注射后化、化和地，瘤體信號強度逐漸升高，與注射對比 劑前比較，差異非常顯著。此外，實驗組在注射對比劑后化、地，與Gadovist對照組相比，瘤 體信號強度明顯升高，而對照組裸鼠腫瘤組織信號幾乎無變化，表明本發(fā)明的造影劑進入 體內后，逐漸與細胞EGFR結合集聚Gd-D03A到EGF郎日性表達的腫瘤細胞，致使裸鼠腫瘤組織 中信號隨時間延長而逐漸升高。
[0067] 從W上實施例可W看出，本發(fā)明的造影劑在弛豫增強能力上比現有的造影劑效果 更好，而且可W祀向性結合腫瘤細胞的EGFR，不僅具有很強的祀向造影效果，同時還延長了 造影劑在體內的成像時間，從而可W減少造影劑的添加劑量，具有很強的實用性。
[0068] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用W限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種腫瘤靶向性MRI造影劑，其特征在于:所述造影劑中包括小分子釓螯合物部分和 靶向載體部分，小分子釓螯合物部分和靶向載體部分通過共價鍵偶聯;其中，所述小分子釓 螯合物部分為Gd-D03A;所述靶向載體部分包含EBP分子。2. 根據權利要求1所述腫瘤靶向性MRI造影劑，其特征在于:所述靶向載體部分為R-EBP 分子，其中R為二羧酸、聚乙二醇、N-(2-羥基丙基)-甲基丙烯酰胺或聚酰胺-胺型樹形大分 子聚合物中的一種。3. 根據權利要求2所述腫瘤靶向性MRI造影劑，其特征在于:所述靶向載體部分為辛二 酸-EBP分子。4. 根據權利要求1所述腫瘤靶向性MRI造影劑，其特征在于:所述共價鍵為酰胺鍵或雙 硫鍵。5. -種如權利要求1-4中任一項所述腫瘤靶向性MRI造影劑的制備方法，其步驟包括： 將D03A-三叔丁基乙二胺與EBP分子進行酰胺縮合得到EBP-D03A，然后與Gd(OAc) 3反應即得 到所述MRI造影劑。6. 根據權利要求5所述腫瘤靶向性MRI造影劑的制備方法，其特征在于:所述D03A-三叔 丁基乙二胺是將三叔丁基-D03A經過氰基取代，氨基化，然后經過還原后得到的。7. 根據權利要求5所述腫瘤靶向性MRI造影劑的制備方法，其特征在于:將R與EBP分子 縮合后得到R-EBP，然后再將R-ΕΒΡ與D03A-三叔丁基乙二胺進行酰胺縮合得到D03A-R-EBP， 最后將D03A-R-EBP與Gd (OAc) 3反應即得到所述靶向載體部分為R-ΕΒΡ分子。
【文檔編號】A61K49/14GK105999308SQ201610503933
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月29日
【發(fā)明人】楊帆, 艾時斌
【申請人】華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院