本發(fā)明涉及醫(yī)藥基因工程技術領域，尤其是涉及一種kpna2基因的應用和抑制kpna2基因表達的sirna的應用。

背景技術：

大腸癌作為四方國家發(fā)病率排第三位的惡性腫瘤。每年的發(fā)病人數(shù)約有120萬，其中位診斷年齡為70歲，但流行病學統(tǒng)計其發(fā)病具有年輕化傾向。在一些西方國家大腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)下降趨勢，但是在一些國家尤其是發(fā)展中國家，大腸癌的發(fā)病率仍呈現(xiàn)明顯升高趨勢。隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，國民生活方式和飲食結構的改變，大腸癌的發(fā)病率在我國呈現(xiàn)出逐年增高的趨勢。大腸癌患者的預后與腫瘤分期相關，診斷時所處的分期越早，預后越好。因此，準確的病理分期對治療方案的制定有著非常重要的意義。在臨床實踐中，治療方案的制定和對大腸癌患者預后的判斷依靠國際防癌聯(lián)盟(internationalunionagainstcancer，uicc)制定的tnm分期。其中包括原發(fā)灶的侵及深度(t分期)，淋巴結(n分期)及遠隔臟器(m分期)轉移和腫瘤分化程度。除此之外還包括了一些腫瘤其他的相關因素，包括腫瘤是否穿透腸管侵犯其他組織，檢出的淋巴結數(shù)目，腫瘤細胞的分化，神經(jīng)浸潤，微淋巴管和血管的癌栓等。即使有以上的危險因素作為tnm分期的補充，在臨床實踐中有時候卻不能準確評估患者術前分期，仍然會經(jīng)常出現(xiàn)過度治療甚至治療不足的現(xiàn)象，從而造成治療失敗。目前尚沒有有效的生物標記物來指導大腸癌的臨床分期。因此需要尋找新的生物標記物來提高臨床分期的準確性迫在眉睫。

隨著對抑癌基因和癌基因的定位和功能的研究深入，針對靶基因的治療已經(jīng)逐漸成為可能。因此，核胞漿轉運蛋白作為存在于細胞質和細胞核之間雙向轉運蛋白越來越受到關注。核胞漿轉運蛋白α2(karyopherin-a2，kpna2)作為核胞漿轉運蛋白α家族的七個成員之一，由529個氨基酸組成，大小為58kda。其結構在九十年代中期被確定。kpna2由親水性的輸入蛋白β結合區(qū)域的n末端，無功能的短酸性c-羧基末端和10個重復穿膜結構的中心疏水區(qū)組成，這個區(qū)域與目標蛋白的核定位信號相結合。輸入蛋白β結合區(qū)域已經(jīng)被證明存在自身抑制功能，從而確保kpna2只有與輸入蛋白β結合的時候才會發(fā)生移位從而進行物質的核胞漿轉運。自從dahl發(fā)現(xiàn)kpna2在乳腺癌中的預后價值以來，kpna2在惡性腫瘤中過表達逐漸引起腫瘤學家的關注。已經(jīng)證明kpna2表達增高的腫瘤包括黑色素瘤、卵巢癌、食管癌、肺癌、宮頸癌、前列腺癌、腦癌、肝癌和膀胱癌。同時，有研究發(fā)現(xiàn)kpna2的表達和腫瘤分期之間同樣存在著關聯(lián)，一部分研究證明了隨著腫瘤的進展kpna2的表達也隨之增加。除了對腫瘤相關蛋白有相互作用之外，kpna2還通過其他一些途徑參與腫瘤的形成和發(fā)展過程。雖然這些途徑并不是腫瘤發(fā)生的直接原因，但也可以影響到致癌作用。比如激活異常的分化途徑，病毒誘導的癌基因和調(diào)節(jié)免疫功能。

然而，目前國內(nèi)外尚無關于大腸癌和kpna2基因表達相關性的文獻報道。

因此，探究kpna2基因作為生物標記物與大腸癌之間的相關性日益成為研究的熱點。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種kpna2基因作為大腸癌生物標記物的應用。

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種kpna2基因在制備用于大腸癌篩檢試劑中的應用。

本發(fā)明的第三個目的在于提供一種抑制kpna2基因的表達在抑制大腸癌細胞的增殖和遷移中的應用。

本發(fā)明的第四個目的在于提供一種sirna在抑制大腸癌細胞的增值和遷移中的應用。

本發(fā)明提供了一種kpna2基因作為大腸癌生物標記物的應用。

本發(fā)明還提供了一種kpna2基因在制備用于大腸癌篩檢試劑中的應用，所述大腸癌篩檢試劑用于檢測受檢體中kpna2基因的表達量。

進一步地，所述受檢體為血清，術后癌癥組織的離體樣本或癌旁正常黏膜組織。

進一步地，所述應用為評估大腸癌術前分期。

進一步地，所述應用為判斷大腸癌術后預后。

本發(fā)明還提供了一種抑制kpna2基因的表達在抑制大腸癌細胞的增殖和遷移中的應用。

進一步地，所述大腸癌細胞為hct116，sw480，sw620或lovo。

進一步地，所述抑制kpna2基因的表達的方法為轉染sirna。

進一步地，所述sirna的序列為：

kpna2-sirna-f：5′-gagacuugguuauuaagua-3′(seqidno.1)

kpna2-sirna-r：5′-aucaaucagaaccucuuaauu-3′(seqidno.2)。

另外，本發(fā)明還提供了上述的sirna在抑制大腸癌細胞的增值和遷移中的應用。

本發(fā)明提供的kpna2基因作為大腸癌生物標記物的應用，填補了現(xiàn)有技術的空白，能夠有效指導大腸癌的臨床分期，提高臨床分期的準確性，對治療方案的制定意義重大；也能夠準確地判斷大腸癌患者的預后，進而提高大腸癌患者的五年生存率。本發(fā)明提供的能夠抑制kpna2基因表達的sirna，能夠有效地抑制大腸癌細胞的增值和遷移。同時，本發(fā)明還提供了上述sirna在制備kpna2基因沉默型大腸癌細胞系的應用，該細胞系可用于探究kpna2與大腸癌的相關性及其機理，為深入研究kpna2與大腸癌發(fā)生、發(fā)展的可能機制提供一種可靠的研究基礎，從而給大腸癌的靶向治療提供有效的治療靶點。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1a為本發(fā)明實施例2提供的大腸癌旁正常組織無kpna2表達的免疫組化染色結果圖；

圖1b為本發(fā)明實施例2提供的大腸癌旁正常組織kpna2低表達的免疫組化染色結果圖；

圖1c為本發(fā)明實施例2提供的大腸癌組織kpna2低表達的免疫組化染色結果圖；

圖1d為本發(fā)明實施例2提供的大腸癌組織kpna2高表達的免疫組化染色結果圖；

圖2為本發(fā)明實施例2提供的kpna2表達與患者5年疾病無進展生存期的生存曲線；

圖3為本發(fā)明實施例3提供的大腸癌原發(fā)灶和癌旁正常組織中應用rt-pcr檢測kpna2表達的結果圖；

圖4為本發(fā)明實施例4提供的kpna2在大腸癌患者及健康志愿者血清中的表達的結果圖；

圖5a為本發(fā)明實施例6提供的westernblot檢測kpna2分別在大腸癌細胞系lovo、sw480、hct116和sw620中的相對表達的結果圖；

圖5b為本發(fā)明實施例6提供的westernblot檢測kpna2分別在大腸癌細胞系lovo、sw480、hct116和sw620中的相對表達的灰度值測定的結果圖；

圖6a為本發(fā)明實施例6提供的westernblot檢測大腸癌細胞系接受kpna2-sirna后kpna2分別在大腸癌細胞系lovo、sw480、hct116和sw620中的相對表達的結果圖；

圖6b為本發(fā)明實施例6提供的westernblot檢測大腸癌細胞系接受kpna2-sirna后kpna2分別在大腸癌細胞系lovo、sw480、hct116和sw620中的相對表達的灰度值測定的結果圖；

圖7a為本發(fā)明實施例7提供的mtt檢測四種大腸癌細胞系hct116轉染kpna2-sirna和nc-sirna后細胞增殖的變化的結果圖；

圖7b為本發(fā)明實施例7提供的mtt檢測四種大腸癌細胞系sw620轉染kpna2-sirna和nc-sirna后細胞增殖的變化的結果圖；

圖7c為本發(fā)明實施例7提供的mtt檢測四種大腸癌細胞系lovl轉染kpna2-sirna和nc-sirna后細胞增殖的變化的結果圖；

圖7d為本發(fā)明實施例7提供的mtt檢測四種大腸癌細胞系sw480轉染kpna2-sirna和nc-sirna后細胞增殖的變化的結果圖；

圖8a為本發(fā)明實施例8提供的細胞劃痕實驗0h時細胞遷移變化的結果圖；

圖8b為本發(fā)明實施例8提供的細胞劃痕實驗12h時細胞遷移變化的結果圖；

圖8c為本發(fā)明實施例8提供的細胞劃痕實驗24h時細胞遷移變化的結果圖；

圖8d為本發(fā)明實施例8提供的細胞劃痕實驗12h時細胞遷移變化的灰度值測定結果圖；

圖8e為本發(fā)明實施例8提供的細胞劃痕實驗0h時細胞遷移變化的灰度值測定結果圖；

圖9a為本發(fā)明實施例8提供的細胞遷移實驗的結果圖；

圖9b為本發(fā)明實施例8提供的細胞遷移實驗的灰度值測定結果圖。

具體實施方式

下面將結合附圖對本發(fā)明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

本發(fā)明提供了一種kpna2基因作為大腸癌生物標記物的應用。

在本發(fā)明中，kpna2基因序列為(seqidno.9)：gttcgttgcaacaaattgatgagcaatgcttttttataatgccaactttgtacaaaaaagttggcatgtccaccaacgagaatgctaatacaccagctgcccgtcttcacagattcaagaacaagggaaaagacagtacagaaatgaggcgtcgcagaatagaggtcaatgtggagctgaggaaagctaagaaggatgaccagatgctgaagaggagaaatgtaagctcatttcctgatgatgctacttctccgctgcaggaaaaccgcaacaaccagggcactgtaaattggtctgttgatgacattgtcaaaggcataaatagcagcaatgtggaaaatcagctccaagctactcaagctgccaggaaactactttccagagaaaaacagccccccatagacaacataatccgggctggtttgattccgaaatttgtgtccttcttgggcagaactgattgtagtcccattcagtttgaatctgcttgggcactcactaacattgcttctgggacatcagaacaaaccaaggctgtggtagatggaggtgccatccgagcattcatttctctgttggcatctccccatgctcacatcagtgaacaagatgtctgggctctaggaaacattgcaggtgatggctcagtgttccgagacttggttattaagtacggtgcagttgacccactgttggctctccttgcagttcctgatatgtcatctttagcatgtggctacttacgtaatcttacctggacactttctaatctttgccgcaacaagaatcctgcacccccgatagatgctgttgagcagattcttcctaccttagttcggctcctgcatcatgatgatccagaagtgttagcagatacctgctgggctatttcctaccttactgatggtccaaatgaacgaattggcatggtggtgaaaacaggagttgtgccccaacttgtgaagcttctaggagcttctgaattgccaattgtgactcctgccctaagagccatagggaatattgtcactggtacagatgaacagactcaggttgtgattgatgcaggagcactcgccgtctttcccagcctgctcaccaaccccaaaactaacattcagaaggaagctacgtggacaatgtcaaacatcacagccggccgccaggaccagatacagcaagttgtgaatcatggattagtcccattccttgtcagtgttctctctaaggcagattttaagacacaaaaggaagctgtgtgggccgtgaccaactataccagtggtggaacagttgaacagattgtgtaccttgttcactgtggcataatagaaccgttgatgaacctcttaactgcaaaagataccaagattattctggttatcctggatgccatttcaaatatctttcaggctgctgagaaactaggtgaaactgagaaacttagtataatgattgaagaatgtggaggcttagacaaaattgaagctctacaaaaccatgaaaatgagtctgtgtataaggcttcgttaagcttaattgagaagtatttctctgtagaggaagaggaagatcaaaacgttgtaccagaaactacctctgaaggctacactttccaagttcaggatggggctcctgggacctttaacttttacccaactttcttgtacaaagttggcattataagaaagcattgcttatcaatttgttgcaacgaac

本發(fā)明還提供了一種kpna2基因在制備用于大腸癌篩檢試劑中的應用，大腸癌篩檢試劑用于檢測受檢體中kpna2基因的表達量。

大腸癌檢測試劑包含kpna2基因引物，例如可以為，但不限于如seqidno.3和seqidno.4所示的序列。

在本發(fā)明中，受檢體為血清，術后癌癥組織的離體樣本或癌旁正常黏膜組織。

在一個優(yōu)選的實施方案中，受檢血清為患者術前采的靜脈血離心后收集的血清。

根據(jù)不同的受檢體可采用不同的檢測手段，從而能夠從多角度全面、準確地篩檢大腸癌。

在本發(fā)明中，kpna2基因在制備用于大腸癌篩檢試劑中的應用可為評估大腸癌術前分期。

在本發(fā)明中，kpna2基因在制備用于大腸癌篩檢試劑中的應用可為判斷大腸癌術后預后。

通過對kpna2基因的檢測，可以更加準確地對大腸癌患者進行術前和術后分期，從而對大腸癌患者提供適當?shù)闹委煼椒?。提高大腸癌患者的五年生存率。

本發(fā)明還提供了一種抑制kpna2基因的表達在抑制大腸癌細胞的增殖和遷移中的應用。

在本發(fā)明中，大腸癌細胞為hct116，sw480，sw620或lovo。

在本發(fā)明中，抑制kpna2基因的表達的方法為轉染sirna。

在本發(fā)明中，sirna的序列為：

kpna2-sirna-f：5′-gagacuugguuauuaagua-3′(seqidno.1)

kpna2-sirna-r：5′-aucaaucagaaccucuuaauu-3′(seqidno.2)。

本發(fā)明提供的sirna能夠有效沉默kpna2基因在大腸癌細胞系中的表達，進而有效地抑制大腸癌細胞的增值和遷移。

本發(fā)明還提供了上述的sirna在抑制大腸癌細胞的增值和遷移中的應用。

該細胞系可用于探究kpna2與大腸癌的相關性及其機理，為深入研究kpna2與大腸癌發(fā)生、發(fā)展的可能機制提供一種可靠的研究基礎，從而給大腸癌的靶向治療提供有效的治療靶點。

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結合優(yōu)選實施例對本發(fā)明做進一步的說明。本領域技術人員應當理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發(fā)明的保護范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1患者及標本收集

首先收集2014年1月至2014年6月在哈爾濱醫(yī)科大學附屬二院結直腸外科接受根治手術的30名大腸癌患者(15名男性患者和15名女性患者，覆蓋i期到iv期)。這部分患者術前未接受新輔助放化療。術前收集患者10ml靜脈血，離心后(1000轉/分，離心5分鐘)收集患者血清存放于-80℃冰箱中備用。收集30名患者術后病灶標本及癌旁正常黏膜組織用于實時逆轉錄聚合酶鏈反應(real-timereversetranscriptasepolymerasechainreaction,rt-pcr)。手術切除病灶后立即將獲得的組織放入液氮中然后放入-80℃冰箱中保存，10％的福爾馬林溶液浸泡24小時后石蠟包埋組織。為了探求大腸癌原發(fā)灶中kpna2蛋白的表達與術后臨床病理學相關因素和患者術后生存期之間的關系。本實驗還收集了2007年1月份到2008年12月份在哈爾濱醫(yī)科大學附屬二院接受大腸癌根治術的患者300例(男性175名，女性125名，年齡分布23-83歲)。術前未接受新輔助治療，手術標本切除后放置于10％的福爾馬林溶液中24小時后石蠟包埋。按常規(guī)程序處理組織后進行組織學檢查，并由三名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生獨立診斷。實驗的所有步驟都通過哈爾濱醫(yī)科大學倫理委員會批準。并且簽署了相關書面同意。

實施例2免疫組織化學染色

免疫組織化學染色分析采用親和素過氧化物酶法。實施例1提供的標本組織用石蠟包埋后，將石蠟組織切成4微米的厚的切片，脫蠟，脫水。甲醇浸泡10分鐘后用0.5％過氧化氫終止內(nèi)源性過氧化物酶活性。應用含有10％山羊血清磷酸鹽緩沖液(pbs液)室溫下浸泡1小時消除非特異結合。然后含有鼠抗人kpna2多克隆抗體(1:300；wuhanproteintech,wuhan,china)pbs液中切片4℃過夜。之后室溫下用生物素標記的羊抗鼠免疫球蛋白(igg；1:400；zsgb-bio,beijing,china)孵育1小時。接下來用鏈霉素-過氧化物酶處理。切片在含有0.1％3,3-二氨基聯(lián)苯胺(zsgb-bio,beijing,china)和0.05％過氧化氫室溫下孵育5分鐘。然后由三名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師在不了解切片的病理信息的情況下獨自對病理切片的免疫組化染色進行評估。病理科醫(yī)生分別在低倍鏡(×40)和高倍鏡(×200和×400)對切片的免疫組化結果進行觀察。然后對切片的免疫組化染色強度進行評分。結果判定根據(jù)染色強度和染色范圍進行綜合評定。根據(jù)染色強度評分：0分(不染色)、1分(輕度染色)、2分(中度染色)、3分(強度染色)。染色范圍進行評分：0分(<5％,陰性)、1分(5–25％,散在)、2分(25–50％,局灶)、3分(>50％，彌散)。免疫組化染色的評分由染色強度和范圍的評分相乘得出，分值為0-9分。其中0-4分為弱染色；＞4分為強染色。

根據(jù)本實施例提供的免疫組織化學染色，結果如圖1a、1b、1c和1d所示，kpna2主要表達于大腸癌的細胞核。如圖1b和圖1d所示，其中大部分腸癌組織和少部分癌旁正常組織免疫組化呈現(xiàn)kpna2表達陽性。如表1所示，其中大腸癌kpna2表達率要顯著高于癌旁正常組織的表達(90.8％vs14.6％,p<0.001)。300個大腸癌標本中182個標本存在kpna2強表達。而在300癌旁正常組織中，只有44例切片kpna2免疫組化表達為陽性。

表1免疫組化染色kpna2在腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達

本實施例還分析了kpna2的表達強度與一些重要的臨床病理特征之間的聯(lián)系。這些重要的臨床病理特征包括：患者年齡、性別、腫瘤體積、腫瘤分布、腫瘤分化程度、tnm分期、腫瘤侵及深度、淋巴結轉移、微淋巴管血管浸潤和周圍神經(jīng)浸潤。經(jīng)統(tǒng)計我們發(fā)現(xiàn)，kpna2的表達強度與腫瘤體積(p<0.001)、tnm分期(p<0.001)、淋巴結轉移(p<0.001)高度相關。除此之外，還與腫瘤分化(p＝0.003)、腫瘤浸潤深度(p＝0.010)、微淋巴管血管浸潤(lvi)和周圍神經(jīng)浸潤(pni)相關(p＝0.010)。結果如表2所示，對染色評分≥4分為kpna2高表達，＜4分被認定為低表達，病理的判斷依據(jù)uicc。相比病期較早的大腸癌患者，病期晚的大腸癌患者原發(fā)灶kpna2表達的強度高，并且以上的這些臨床病理特征都與患者的預后有著緊密的聯(lián)系。但kpna2的表達與患者的年齡(p＝0.502)、性別(p＝0.507)和腫瘤部位(p＝0.607)無顯著相關性。這將為大腸癌的術前診斷提供一個有效的生化因子。本實施例中數(shù)據(jù)均用spss軟件21.0版本的軟件包分析(spssinc.,chicago,il,usa)。所有的連續(xù)變量表示為均數(shù)±標準差。χ²試驗用于評價kpna2表達和其他臨床病理因素之間的關系。

表2kpna2的免疫組化染色表達強度與臨床病理特征之間的聯(lián)系

同時，本實施例還根據(jù)kaplan–meier法計算kpna2表達與患者5年疾病無進展生存期的生存曲線，并通過生存曲線分析原發(fā)灶中kpna2的表達與患者總生存期和疾病無進展生存期的關系。生存率的差異應用log-ranktest檢驗評估，cox比例風險模型被用來確定kpna2對生存率有顯著的影響。結果如圖2所示，大腸癌原發(fā)灶中kpna2的表達增高的患者總生存期和疾病無進展生存期較短，其預后較差。

實施例3實時逆轉錄聚合酶鏈反應

按照說明用trizol試劑(invitrogen,carlsbad,ca,usa)提取實施例1提供的30例大腸癌和癌旁正常組織的總rna。按說明采用revertaid^tmhminusfirststrandcdnasynthesiskit(fermentas,burlington,ontario,canada)進行反轉錄。kpna2和甘油醛3-磷酸酯脫氫酶(gapdh)的引物(takarabiotechnology,dalian,china)分別是：

pcr采用sybrgreen染料法。使用abiprism(r)7500實時定量pcr儀，按照說明相應程序進行反應。為了證明擴增產(chǎn)物的特意性，引物都進行溶解曲線分析。pcr循環(huán)條件如下：

采用相對定量法進行結果分析(2-δδctmethod)。每組實驗重復3次，取平均值。

結果如圖3所示，實驗結果證明與癌旁正常組織中kpna2的表達相比26例大腸癌標本中kpna2相對表達增高(26/30,86.7％)。因此rt-pcr的實驗結果同樣證明了在大腸癌標本中kpna2的表達要高于癌旁正常組織(p<0.001)。

因此通過實施例2的免疫組織化學染色和實施例3的rt-pcr兩種實驗方法，證明了大腸癌組織中kpna2的表達要顯著高于癌旁正常組織，因此，kpna2可能是促進大腸癌發(fā)生和進展的重要因子。

實施例4熒光夾心elisa

血清中kpna2的表達通過kpna2elisa試劑盒來測得(shanghaibluegenebiotechco.,ltd,shanghai,china)。待測血清來自由實施例1提供的30名大腸癌患者和10名健康的志愿者。首先將待測血清與kpna2-hrp在包被好的96孔板中37℃的環(huán)境下孵育1小時。一小時后棄掉混合液，用試劑盒中清洗液洗滌5次。然后用hrp酶底物37℃孵育15分鐘。由于酶-底物反應，待測孔中的溶液將變成藍色。最后加入終止液，停止酶與底物之間的反應，這時溶液會變成黃色。顏色的強度通過光譜光度測量儀(thermofisherscientific,waltham,ma,usa)在450nm下測量。由于采用的是kpna2-hrp共軛結合，顏色的強度與kpna2的濃度成反比。根據(jù)標準曲線計算出kpna2血清中的表達，非參數(shù)mann-whitneyu檢驗用于分析elisa結果的變化。。

結果如圖4所示，健康人血清中kpna2表達水平為6.24±0.42ng/ml，而大腸癌患者術前血清中kpna2表達水平為7.84±1.11ng/ml。大腸癌患者血清中kpna2的表達高于健康人血清中表達水平(p<0.001)，因此，kpna2可能是促進大腸癌發(fā)生和進展的重要因子。

實施例5大腸癌細胞培養(yǎng)及sirna轉染

大腸癌細胞系hct116，sw480，sw620，lovo均用含10％滅活新鮮肽牛血清和100u/ml鏈霉素的rpmi1640培養(yǎng)液培養(yǎng)(gibco,usa)。其中hct116和lovo是在37℃，5％co2條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。sw480，sw620是在37℃，無co2條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)。2-3天更換細胞培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)兩周后應用于實驗。

本發(fā)明提供的kpna2-sirna(sikpna2)和nc-sirna(sinc)陰性對照均采購于北京唯尚立德生物科技有限公司，序列如下：

轉染前24小時將細胞按3×10⁵接種于6孔板，轉染前3小時更換培養(yǎng)液。從-80冰箱中取出kpna2-sirna溶液和nc-sirna溶液(1odsirna+150μldepc水)解凍，分別吸取10μlkpna2-sirna溶液和nc-sirna溶液用250μl無血清1640培養(yǎng)基稀釋，充分混勻制成kpna2-sirna和nc-sirna稀釋液。取5μlrna轉染試劑polyfectine(biowittechnologies,guangdong,china)分別加入到kpna2-sirna溶液和nc-sirna溶液中，充分混勻，室溫下靜置15分鐘轉染大腸癌細胞系。將轉染復合物加入到含有細胞和完全培養(yǎng)基的6孔板中，輕柔混勻，培養(yǎng)4-6個小時后更換培養(yǎng)液。轉染后72小時用westernblot檢測每個細胞系kpna2的干擾效率。

實施例6westernblot檢測大腸癌細胞系kpna2蛋白表達

分別收集未進行轉染實驗和轉染完畢的大腸癌細胞加入細胞裂解液充分裂解，低溫高速離心(4℃，12000r/min，30min)細胞提取上清液總蛋白。上清樣本蛋白量為60ug。電泳(12％sds，page凝膠)、轉印(70v，120min)、5％正常小牛血清封閉，一抗4℃孵育過夜，分別與對應的二抗室溫孵育2小時，ecl顯色，結果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀(power/pac200,usa)采集，進行灰度值測定。

如圖5a和5b所示，westernblot檢測kpna2在大腸癌細胞系中的表達。其中l(wèi)ovo的表達率為71％±7％；sw480的表達率為57％±6％；hct116的表達率為76％±9％；sw620的表達率為63％±7％。

將kpna2-sirna分別轉染至大腸癌細胞系lovo，sw480，hct116，sw620后72小時，應用westernblot檢測kpna2在四種細胞系中的表達。如圖6a和6b所示，轉染后四種細胞系kpna2表達均顯著下降。其中l(wèi)ovo細胞系kpna2表達下降至轉染前的33％±7％，sw480細胞系kpna2表達下降至轉染前的47％±10％，hct116細胞系kpna2表達下降至轉染前的21％±9％，sw620細胞系kpna2表達下降至轉染前的38％±11％。四種細胞系中以大腸癌細胞系hct116轉染kpna2-sirna后kpna2蛋白表達下降最為明顯。

實施例7mtt法檢測大腸癌細胞增殖

將單個轉染kpna2-sirna和nc-sirna的四種大腸癌細胞系懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200ul含103個細胞，培養(yǎng)24小時，每孔加入mtt溶液繼續(xù)培養(yǎng)4小時，吸去上清液，加入150uldmso(sigma，usa)，振蕩10分鐘，490hm波長下測定24h、48h、72h和96h各孔光吸收值，以不含細胞的等體積培養(yǎng)液作為對照。繪制細胞生長曲線。

結果如圖7a、7b、7c和7d所示，將kpna2-sirna和nc-sirna分別轉染到四種大腸癌細胞系后，分別在24h、48h、72h和96h應用mtt法觀察大腸癌細胞系增殖情況。與nc對照組對比，轉染si-kpna2后四種大腸癌細胞的增殖能力下降。其中以sw480和hct116細胞增殖所受到的影響最大。

實施例8細胞遷移能力變化

由實施例6的結果可知，四種細胞系中以大腸癌細胞系hct116轉染kpna2-sirna后kpna2蛋白表達下降最為明顯，故本實施例應用大腸癌細胞系hct116進行實驗。

細胞劃痕實驗

用記號筆在6孔板背面用直尺比量著均勻劃橫線，間隔0.5-1cm劃一道。每孔至少穿過5條線。5×10⁵個hct116大腸癌細胞在6孔板中培養(yǎng)，當細胞融合率達到100％時用槍頭在細胞培養(yǎng)層垂直于背后的橫線劃痕。pbs液清洗細胞3次，洗脫劃落的細胞。加入無血清培養(yǎng)液。放置于37攝氏度5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按著培養(yǎng)0，24h時間點取樣顯微鏡(nikoneclipseti-e,nikon,kobe,japan)下拍照。使用imagej軟件處理細胞劃痕實驗的圖片，計算細胞間距離的平均值，并進行灰度值測定。

結果如圖8所示，左側是nc-sirna轉染對照組，而右側是kpna2-sirna轉染實驗組。轉染實驗完成后，分別觀察0h，12h(39±5vs22±4，p＜0.05)和24h(80±4vs55±5，p＜0.05)細胞遷移的變化。通過劃痕實驗可知，接受轉染的劃痕創(chuàng)傷愈合率在12h和24h較對照組下降。轉染kpna2-sirna的大腸癌細胞系hct116遷移能力明顯受到抑制，從而證明了轉染后細胞的遷移能力下降(*p＜0.05)。

細胞遷移實驗

將大腸癌hct116細胞經(jīng)胰酶消化后收集細胞進行細胞計數(shù)。取3×10⁵個hct116大腸癌細胞加入transwell的上層室(24-wellinsert；8mmporesize；corningcostarcorp.,cambridge,ma,usa).在37攝氏度5％co2環(huán)境下孵育細胞24h，使得細胞通過濾過膜遷移到底部。輕輕去除嵌入膜，使得沒有遷移的細胞留在濾過膜上并小心地用棉簽去除，凈化過濾器。過濾器下層的細胞迅速用5％戊二醛固定。固定后用含1％結晶紫溶液的2％乙醇染色。20min后用去離子水去除多余的結晶紫溶液，用棉簽去除多余水分。在顯微鏡下(nikoneclipseti-e,nikon,kobe,japan)計算濾過器下方細胞數(shù)量，并進行灰度值測定。以上實驗重復三次。

結果如圖9所示，轉染kpna2-sirna的hct116大腸癌細胞的遷移能力與對照組比較顯著下降(485±67vs311±51，p＜0.05)。

通過實施例7和實施例8的實驗結果可以得出，沉默kpna2的表達將降低大腸癌細胞的增殖和遷移能力。因此kpna2作為癌基因在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用。也為大腸癌的靶向治療找到了一個新的靶點。

由以上實施例的實驗結果可以得出，大腸癌中kpna2的表達要高于癌旁正常組織；kpna2的異常表達與腫瘤分化、腫瘤體積、tnm分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、微淋巴管和微血管浸潤等具有預測患者預后相關病理因素相關；原發(fā)灶kpna2高表達的患者術后5年總生存期和5年無疾病進展生存期較差；大腸癌患者血清中kpna2的表達高于正常人，因此kpna2對大腸癌具有診斷作用。沉默kpna2的表達將降低大腸癌細胞的增殖和遷移能力；kpna2作為癌基因在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用，也為大腸癌的靶向治療找到了一個新的靶點。

最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明各實施例技術方案的范圍。

sequencelisting

<110>哈爾濱醫(yī)科大學

<120>kpna2基因的應用和抑制kpna2基因表達的sirna的應用

<160>9

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