一種抑制FABP4基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種抑制FABP4基因表達(dá)的SiRNA及 其在制備減肥、降脂或降糖的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]RNA干擾（RNAinterference，RNAi)是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA誘 發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，是生物體在進(jìn)化過(guò)程中抵御外界病毒等感染和維 持基因組穩(wěn)定性的一種保護(hù)型機(jī)制。當(dāng)病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機(jī) 整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細(xì)胞對(duì)這 些dsRNA迅疾產(chǎn)生反應(yīng)，其胞質(zhì)中RNaselll核酶家族的Dicer將dsRNA切割成多個(gè)具有特 定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA(即siRNA)。siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義和 反義鏈，而反義siRNA再與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結(jié)合形成RNA誘 導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC)。RISC與外源性基因表達(dá)mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，RISC具 有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點(diǎn)即是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。 被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對(duì)這些mRNA的降解反應(yīng)。siRNA不僅 能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA依賴的RNA聚合 酶作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級(jí)siRNA，從 而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解。RNAi技術(shù)具有高度的特異性，與傳 統(tǒng)的反義RNA技術(shù)相比，RNAi技術(shù)的沉默效率更高、效果更好，而慢性病毒載體介導(dǎo)的RNAi 技術(shù)則可以提供長(zhǎng)期的基因表達(dá)抑制，RNAi作為一種嶄新的技術(shù)手段，為基因功能、基因表 達(dá)調(diào)控、基因治療等方面的研宄提供了一個(gè)全新的方法及其理論基礎(chǔ)。
[0003] 使用RNAi治療疾病的思路是根據(jù)病原體的致病基因序列以及生物體內(nèi)與疾病發(fā) 生相關(guān)的基因序列，設(shè)計(jì)和制備與這些基因序列具有同源性的小干擾RNA(siRNA)，然后通 過(guò)某種方式將siRNA轉(zhuǎn)移到動(dòng)物體內(nèi)使有關(guān)疾病基因發(fā)生沉默，從而達(dá)到治療目的。直接 轉(zhuǎn)染合成的siRNA能特異性抑制動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)同源基因的表達(dá)，但是細(xì)胞內(nèi)siRNA很容易降 解，因此這種方法不能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的RNA干擾。而慢病毒載體在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)感染效率高，免 疫原型低，既能干擾分裂期的細(xì)胞又能感染非分裂期的細(xì)胞。由于病毒載體的這些特性， 慢病毒介導(dǎo)RNA干擾能在各類動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)siRNA，抑制相關(guān)基因表達(dá)，因此 該方法具有高效、穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、適用范圍廣的特點(diǎn)。在siRNA設(shè)計(jì)的過(guò)程中，不同位點(diǎn)的 siRNA對(duì)基因的抑制作用不同，siRNA的抑制效率與基因的設(shè)計(jì)位點(diǎn)密切相關(guān)。因此，尋找 最合適的siRNA對(duì)于RNA干擾的應(yīng)用至關(guān)重要。
[0004] 脂肪酸結(jié)合蛋白（Fattyacidbindingproteins，F(xiàn)ABPs)是一系列脂質(zhì)伴侶蛋 白，其蛋白中央空腔可以結(jié)合長(zhǎng)鏈脂肪酸及其它一些疏水性配體。脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合 蛋白（FABP4)是細(xì)胞內(nèi)FABPs家族成員之一。早期研宄發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4的基本功能包括以非共 價(jià)方式和可逆性結(jié)合飽和及不飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸，促進(jìn)脂肪酸的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)；FABP4能夠可 逆性結(jié)合飽和及不飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸，促進(jìn)脂肪酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)；脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中FABP4 的表達(dá)及活性顯著增強(qiáng)，是脂肪細(xì)胞分化的標(biāo)志物之一。此外，F(xiàn)ABP4在其他生物學(xué)過(guò)程 中尤其是代謝綜合征的許多方面具有重要作用。FABP4基因敲除小鼠可以抑制由高脂肪飲 食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展，在巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)FABP4高表達(dá)會(huì)促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，表明 FABP4在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中也具有重要作用。
[0005] 中國(guó)專利文獻(xiàn)201010127886. 8,公開了一組能有效下調(diào)PRDM1 0表達(dá)的 siRNA分子及其應(yīng)用，所述的siRNA能有效下調(diào)淋巴瘤細(xì)胞中PRDM10。中國(guó)專利文獻(xiàn) 201410541314. 2公開了一種抑制S100A8基因表達(dá)的siRNA，所述的siRNS能降低S100A8基 因的表達(dá)。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN201410474752. 1公開了一種抑制奶牛EEF1D基因表達(dá)的siRNA， 該siRNA能有效降低奶牛EEF1D基因的表達(dá)量。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN201110107036. 6公開了 一種抑制caspase-3基因表達(dá)的siRNA，將所述的siRNA進(jìn)入到神經(jīng)細(xì)胞時(shí)，可以顯著提高 神經(jīng)細(xì)胞的活力，明顯減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因caspase-3基因的表達(dá)。但是關(guān)于能有 效抑制FABP4基因表達(dá)的siRNA，目前還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種能有效抑制FABP4基因表達(dá)的 siRNA〇
[0007] 本發(fā)明的再一的目的是，提供一種DNA分子。
[0008] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種重組慢病毒表達(dá)載體。
[0009] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是，提供一種慢病毒。
[0010] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是，提供上述SiRNA、DNA分子、重組慢病毒表達(dá)載體、慢病毒 的用途。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0012] 一種抑制FABP4基因表達(dá)的SiRNA，其特征在于，所述的SiRNA序列為：
[0013]正義鏈：5' -CGACCACAAUAAAGAGAAA-3'
[0014]反義鏈：5 ' -UUUCUCUUUAUUGUGGUCG-3 '。
[0015] 所述的抑制FABP4基因表達(dá)的siRNA序列3'端垂懸有dTdT。
[0016] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0017] -種DNA分子，其特征在于，所述DNA分子序列為：
[0018]正義鏈：5 '-GATCCGCGACCACAATAAAGAGAAATTCAAGAGATTTCTCTTTATTGTGGTCGCTTTTT TG-3,
[0019]反義鏈：5 '-AATTCAAAAAAGCGACCACAATAAAGAGAAATCTCTTGAATTTCTCTTTATTGTGGTCG CG-3'。
[0020] 為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0021] 包含如上所述DNA分子的重組慢病毒表達(dá)載體。
[0022] 所述重組慢病毒表達(dá)載體是將權(quán)利要求3所述的DNA分子插入載體質(zhì)粒的BamHI 和EcoRI位點(diǎn)間得到。
[0023] 所述的載體質(zhì)粒為L(zhǎng)V3穿梭質(zhì)粒。
[0024] 為實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0025] -種慢病毒，由如上所述的重組慢病毒表達(dá)載體和病毒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝 細(xì)胞得到。
[0026]所述病毒包裝系統(tǒng)含有pGag/Pol，pRev和pVSV-G。
[0027]所述病毒包裝細(xì)胞為293T細(xì)胞。
[0028] 為實(shí)現(xiàn)上述第五個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0029] 如上所述的siRNA、DNA分子、重組表達(dá)載體、慢病毒在制備減肥藥物中的應(yīng)用。
[0030] 如上所述的siRNA、DNA分子、重組表達(dá)載體、慢病毒在制備抑制糖化血紅蛋白和/ 或總膽固醇水平的藥物中的應(yīng)用。
[0031] 一種抑制小鼠FABP4基因表達(dá)的方法，是將本發(fā)明提供的siRNA、DNA分子（即實(shí) 施例的shDNA模板序列）、慢病毒轉(zhuǎn)染表達(dá)FABP4基因的細(xì)胞。所述的細(xì)胞為3T3-L1前脂 肪細(xì)胞。
[0032] 本發(fā)明所提供的siRNA還用于制備與FABP4基因相關(guān)的疾病的治療藥物，即通過(guò) 本發(fā)明提供的siRNA、DNA分子（即實(shí)施例的shDNA模板序列）、慢病毒的使用達(dá)到降低受 體的FABP4基因表達(dá)后，對(duì)相關(guān)疾病的治療有一定/顯著效果的產(chǎn)品、方法或用途都在本發(fā) 明的保護(hù)范圍以內(nèi)。
[0033] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0034] 本發(fā)明針對(duì)FABP4基因，設(shè)計(jì)了三對(duì)siRNA序列，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)篩選出一條可 以有效下調(diào)目的基因表達(dá)的siRNA。根據(jù)所篩選的siRNA-368序列，構(gòu)建了相應(yīng)的慢病毒表 達(dá)載體，通過(guò)高脂肥胖小鼠轉(zhuǎn)染及抑制小鼠內(nèi)臟脂肪組織FABP4基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)本發(fā) 明所篩選的siRNA、構(gòu)建的慢病毒能有效抑制小鼠FABP4基因表達(dá)，降低高脂肥胖小鼠的體 重、糖化血紅蛋白、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇的水平。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 附圖1為siRNA轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞的熒光顯微攝片。
[0036] 附圖2為siRNA慢病毒載體測(cè)序結(jié)果