本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及重組表達載體、工程菌、制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

濕性老年性黃斑變性(AMD)和糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)缺乏理想的治療措施，臨床上使用的抗-VEGF治療涉及到定期眼內(nèi)注射抗-VEGF單抗(如Lucentis),不僅具有一定的傷害性，而且價格昂貴且只針對確診病例，此外，盡管發(fā)生率很低，但每次注射均會帶來眼內(nèi)感染、視網(wǎng)膜出血和剝離的嚴重風(fēng)險，而且這個治療沒有終點。2013年全球糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)患者9300萬，其中增殖性DR(PDR)患者1700萬，糖尿病性黃斑水腫患者2100萬，威脅視力的DR患者2800萬。糖尿病發(fā)病5年后糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生率為25％，10年后增至60％，15年后可高達75％--80％。如此可見，加快研制新型治療眼底血管病變制劑，不僅具有社會效益，而且將會產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益。目前對AMD和DR還缺乏特異性的有效治療方法，臨床上主要采用對癥治療或輔助性治療方法來控制或延緩疾病的發(fā)展，常用的治療方法如下：降糖藥物、抗炎藥物、局部使用TNF-α拮抗劑、菲諾貝特、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)拮抗劑、RAS系統(tǒng)抑制劑、非酶糖基化抑制劑、綜合療法和激光治療。

白細胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)是人體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子之一，具有抗腫瘤，抑制新生血管生成等作用，具有很大的臨床應(yīng)用價值，GSK公司已經(jīng)開展抗腫瘤的II期臨床試驗。由于IL-18是存在人體內(nèi)微量細胞因子(pg級)所以IL-18的來源只能依靠基因重組技術(shù)解決。但目前IL-18制備方法在一定程度上存在工藝復(fù)雜、純度低(90％)、復(fù)性率低和產(chǎn)量低等一些問題，不僅使其成本增高，而且產(chǎn)業(yè)化難。

由于IL-18潛在的應(yīng)用價值，相關(guān)的制備研究較多。1996年(J Immunol.156,4274-4279)報道了“在大腸桿菌和哺乳動物細胞中表達人IL-18及變異體”，IL-18以包涵體的形式表達，其純化方法一次采用疏水層析(pheny-sepharose), 陰離子交換層析(DEAE-Sepharose)，凝膠層析(Superdex75),反向疏水層析(C4)等方法，經(jīng)純化后的IL-18 SDS-PAGE檢測純度達到90％。2006年(中國免疫學(xué)雜志，22,141-144)報道“重組人IL-18在大腸桿菌中的表達及抗腫瘤作用”，人IL-18以IL-18以包涵體的形式表達，表達產(chǎn)物經(jīng)冰浴后離心，包涵體沉淀經(jīng)充分洗滌后用8mol/L尿素溶解，經(jīng)復(fù)性，透析和G50凝膠層析，純化后的IL-18 SDS-PAGE檢測純度達到90％左右。2010年中國專利(10169340A)公開了“人白細胞介素18的制備方法；采用重組畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)上清液分級超濾濃縮，50％以上飽和度的(NH4)2SO4沉淀后一次采用疏水層析(pheny-sepharose),陰離子交換層析(Q-Sepharose HP)純化，經(jīng)純化后的IL-18 SDS-PAGE檢測純度達到97％。這些制備方法在一定程度上存在工藝復(fù)雜、純度低、復(fù)性率低和產(chǎn)量低等一些問題，使其成本增高。

現(xiàn)有的以大腸桿菌為宿主來源的IL-18制備方法有2個主要缺點：①工藝復(fù)雜，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，而且復(fù)雜的工藝不僅增加了成本、而且工藝周期長，回收率低等；②蛋白純度低(90％)，不能滿足作為生物制品的要求。上述以畢赤酵母為宿主來源的IL-18制備方法的主要缺點是工藝復(fù)雜，表達產(chǎn)率低，使規(guī)?；a(chǎn)困難。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供一種重組表達載體、工程菌、制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了高效表達人IL-18的基因工程菌，建立了簡捷有效的純化IL-18技術(shù)工藝，解決了大量制備IL-18問題，能夠滿足未來臨床需要。建立了穩(wěn)定簡捷的包涵體復(fù)性、IL-18純化的工藝路線，蛋白純度可達97％以上；建立了鑒定IL-18活性方法。

本發(fā)明主要解決了IL-18純化工藝復(fù)雜，回收低和純度低等問題。本工藝特點簡捷、快速、回收率高和純度高(97％)。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種重組載體，含有IL-18基因片段；所述IL-18基因片段的序列如SEQ ID No.1所示。

在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明提供的重組載體采用的所述質(zhì)粒載體為pBV220。

本發(fā)明還提供了一種工程菌，整合有所述的重組載體。

在本發(fā)明的一些實施方案中，工程菌的宿主菌為大腸桿菌DH5α菌株。

本發(fā)明還提供了利用所述的重組載體制備IL-18的方法，包括如下步驟：

步驟1：構(gòu)建獲得工程菌；所述工程菌整合有所述的重組載體；

步驟2：取所述工程菌，經(jīng)活化、發(fā)酵、誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得包涵體；

步驟3：取所述包涵體，經(jīng)洗滌、溶解、復(fù)性后，經(jīng)純化、活性測定，獲得IL-18。

在本發(fā)明的一些實施方案中，利用所述的重組載體制備IL-18的方法步驟3中所述純化具體為經(jīng)羥基磷灰石層析柱層析，收集目的峰蛋白，再經(jīng)Sephacryl S-200-HR凝膠層析柱層析，收集100min～120min間出現(xiàn)的蛋白峰。

在本發(fā)明的一些實施方案中，利用所述的重組載體制備IL-18的方法步驟3中所述羥基磷灰石層析柱層析上樣液的流速為10-20ml/min；用平衡液充分流洗雜蛋白到基線后，分別用含0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L和1.0mol/L NaCl的平衡液洗脫，收集洗脫峰，經(jīng)SDS蛋白電泳鑒定，目的蛋白存在于0.1mol/L NaCl洗脫峰中；

在本發(fā)明的一些實施方案中，利用所述的重組載體制備IL-18的方法步驟3中Sephacryl S-200-HR凝膠層析柱層析上樣液的流速為2-5ml/min。

在本發(fā)明的一些實施方案中，利用所述的重組載體制備IL-18的方法步驟1中所述重組載體的構(gòu)建方法為含IL-18的基因用EcoRⅠ，BamHⅠ雙酶切，與用EcoRⅠ，BamHⅠ雙酶切的載體pBV220連接，構(gòu)建含IL-18基因的重組載體pBV220-IL-18。

在本發(fā)明的一些實施方案中，利用所述的重組載體制備IL-18的方法中所述工程菌的構(gòu)建方法為取所述重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建獲得工程菌株DH5α-pBV220IL-18。

在本發(fā)明的一些實施方案中，利用所述的重組載體制備IL-18的方法步驟2中的所述活化具體為：取所述工程菌接種到含Amp的營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～16h；挑取單個菌落接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)12～16h。

在本發(fā)明的一些實施方案中，利用所述的重組載體制備IL-18的方法步驟2中所述發(fā)酵具體為：取所述活化獲得的菌液按1～10％(v/v)的比例接種到 含Amp的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，28～32℃搖床培養(yǎng)12～16h；將菌液按5～10％(v/v)的比例接種到發(fā)酵罐內(nèi)，28～32℃條件下培養(yǎng)至菌液濃度達到OD600為2.0-3.0。

在本發(fā)明的一些實施方案中，利用所述的重組載體制備IL-18的方法步驟2中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)具體為：取所述發(fā)酵獲得的菌液于42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3-6h，同時持續(xù)補加填料液，所述填料液與所述發(fā)酵獲得的菌液體積比為5％～10％；氨水自動調(diào)節(jié)pH7.0；

所述填料液以1000ml為單位按下列比例配制：

蛋白胨 100g

酵母提取物 100g

葡萄糖 200g(700ml水溶解單獨高壓，8磅)。

在本發(fā)明的一些實施方案中，利用所述的重組載體制備IL-18的方法中所述獲得包涵體具體為：取所述誘導(dǎo)培養(yǎng)后的培養(yǎng)液離心收集菌體，用TE緩沖液懸浮，冰浴條件下，高壓勻漿破碎菌體，反復(fù)4次。離心破碎后的菌體，收集沉淀，即為包涵體。

在本發(fā)明的一些實施方案中，利用所述的重組載體制備IL-18的方法步驟3中所述溶解具體為：按照2-10％(v/v)的比例加入包涵體溶解液，4℃條件下，磁力攪拌溶解5-10h；4℃，9000rpm，離心10min，收集上清液；

所述包涵體溶解液以1000ml為單位按下列比例配制：

8mol尿素 480g

10mM DTT 1.65g

用20mmolPB緩沖液(pH7.0-8.0)定容到 100。

在本發(fā)明的一些實施方案中，利用所述的重組載體制備IL-18的方法步驟3中所述復(fù)性具體為：按照10-20％的比例緩慢加入包涵體復(fù)性液，使蛋白濃度降到0.2％，4℃復(fù)性12-20h；

所述包涵體復(fù)性液以1000ml為單位按下列比例配制：

20mmol PB緩沖液(pH7.0-8.0) 1000ml

DTT(20mM) 3.1g。

在本發(fā)明的一些實施方案中，利用所述的重組載體制備IL-18的方法步驟3所述活性測定具體為：

人白血病細胞KG1細胞傳代培養(yǎng)：用含10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基，5％CO₂，37℃培養(yǎng)U937細胞；當細胞密度達到2×10⁶個細胞/ml時傳代；傳代細胞密度為4×10⁵細胞/ml；

將hrIL-18用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基配制成50nmol備用；取96孔細胞培養(yǎng)板，于前5列每孔加100μl 20％FCS 1640培養(yǎng)基配制的細胞密度為2×10⁶細胞/ml，A、B、C、D排加ConA，終濃度為0.5mg/L；E、F、G、H孔不加ConA；于第1-5列每孔內(nèi)分別加入100μl 10倍稀釋的hrIL-18，混勻，第一列終濃度為25nmol；(每個稀釋度4孔)；混均后，將細胞培養(yǎng)板置37℃，5％CO₂孵箱培養(yǎng)24h；

用ELISA法測IFN-γ效價收集培養(yǎng)上清，獲得IL-18活性。

本發(fā)明還提供了所述方法制得的IL-18在制備治療眼底血管病變的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種重組表達載體、工程菌、制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了高效表達人IL-18的基因工程菌，建立了簡捷有效的純化IL-18技術(shù)工藝，解決了大量制備IL-18問題，能夠滿足未來臨床需要。建立了穩(wěn)定簡捷的包涵體復(fù)性、IL-18純化的工藝路線，蛋白純度可達97％以上；建立了鑒定IL-18活性方法。

本發(fā)明主要解決了IL-18純化工藝復(fù)雜，回收低和純度低等問題。本工藝特點簡捷、快速、回收率高和純度高(97％)。

本發(fā)明還提供了IL-18活性檢測方法。白細胞介素-18的活性鑒定通常采用PBMC細胞：即用IL-18刺激PBMC，根據(jù)產(chǎn)生INFγ的多少判定IL-18的活性；第二種方法是用IL-18刺激NK細胞增殖數(shù)量判定IL-18的活性，兩種方法都相對繁瑣，我們采用KG-1細胞(一種白血病細胞株)替代PBMC細胞，因KG-1細胞是傳代細胞，簡化了實驗程序。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示本發(fā)明提供的純化方法流程圖；

圖2示pBV220-IL-18原核表達載體構(gòu)建方案；

圖3示為表達載體的PCR，圖中標示分別為：

M：分子量標準，從大到小依次為10000、7000、4000、2000、1000、500、250bp；

1為載體pBV220對照，2為表達載體pBV220-IL-18PCR結(jié)果；

圖4示羥基磷灰石層析柱純化后結(jié)果；圖中標示分別為：

M：分子量標準，從大到小依次為97.2、66.7、44.3、29.8kD；

1：0.1M NaCl洗脫峰；2：0.2M NaCl洗脫峰；3：0.5M NaCl洗脫峰；

圖5示Sephacryl S-200-HR凝膠層析柱純化結(jié)果，圖中標示分別為：

M：分子量標準，從大到小依次為97.2、66.7、44.3、29.8，20.0,14.0kD；

1-5：去除的雜蛋白6：純化后樣品8：純化前樣品；

圖6示hrIL-18誘導(dǎo)KG1細胞產(chǎn)生INFγ；

圖7示實施例6中對照組1的結(jié)果；

圖8示實施例6中對照組2的結(jié)果。

具體實施方式

本發(fā)明公開了一種重組表達載體、工程菌、制備方法及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明的技術(shù)方案是(圖1)：構(gòu)建表達載體pBV220-IL-18，該表達載體是將通過PCR獲得的含的基因用EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ雙酶切，然后與用EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ雙酶切的載體pBV220連接；構(gòu)建工程菌株DH5α-pBV220-IL-18；在溫度誘導(dǎo)下，工程菌株DH5α-pBV220-IL-18高密度發(fā)酵，高效表達IL-18蛋白；表達的hrIL-18溶解、復(fù)性及純化。

技術(shù)方案的具體步驟是：取-70℃保存的工程菌株接種到含Amp的營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)；挑取單個菌落接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)；將菌液按比例接種到含Amp的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，28-32℃搖床培養(yǎng)；將菌液按比例接種到發(fā)酵罐內(nèi)，28-32℃條件下培養(yǎng)；待菌液濃度達 到OD₆₀₀約為2.0-3.0后，升溫到42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3-6h，同時小量持續(xù)補加填料液，氨水自動調(diào)節(jié)pH7.0，離心收集菌體；菌體用TE緩沖液懸浮，冰浴條件下，高壓勻漿破碎菌體，離心收集沉淀，即為包涵體；稱取適量包涵體，加入包涵體洗滌液洗滌后，加入包涵體溶解液，4℃條件下，磁力攪拌溶解5-10h以上；離心收集上清液；按照比例緩慢加入復(fù)性液，室溫磁力攪拌溶解4h；4℃復(fù)性12-20h以上；通過用平衡液平衡的羥基磷灰石層析柱，收集目的峰；再將目的峰超濾濃縮后再上用平衡液平衡好的凝膠層析柱，收集目的峰，即為目的蛋白，將該純化蛋白分裝成水針制劑或凍干制劑。

各液體配方范圍及準備如下：

LB液體培養(yǎng)基：以1000ml為單位按下列比例配制，溶解后高壓滅菌。

胰蛋白胨 10g

酵母提取物 5g

NaCl 10g

發(fā)酵培養(yǎng)基：以1000ml為單位按下列比例配制，溶解后高壓滅菌。

20mmol PB緩沖液(pH7.0-8.0)以1000ml為單位按下列比例配制：

磷酸二氫鈉.2H₂O 3.12g

磷酸氫二鈉.12H₂O 7.16g

EDTA 0.37g。

包涵體溶解液以1000ml為單位按下列比例配制：

8mol尿素) 480g

10mM DTT 1.65g

用20mmol PB緩沖液(pH7.0-8.0)定容到 100

復(fù)性液以1000ml為單位按下列比例配制：

20mmol PB緩沖液(pH7.0-8.0) 1000ml

DTT(20mM) 3.1g。

洗脫液1

20mmol PB緩沖液(pH7.2) 1000ml

0.1mol NaCL 5.8g。

洗脫液2

20mmol PB緩沖液(pH7.2) 1000ml

0.2mol NaCL 11.6g。

洗脫液3

20mmol PB緩沖液(pH7.2) 1000ml

0.5mol NaCL 29.0g

補料液是以1000ml為單位按下列比例配制：

蛋白胨 100g

酵母提取物 100g

葡萄糖 200g(700ml水溶解單獨高壓，8磅)。

本發(fā)明提供一種重組表達載體、工程菌、制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了高效表達人IL-18的基因工程菌，建立了簡捷有效的純化IL-18技術(shù)工藝，解決了大量制備IL-18問題，能夠滿足未來臨床需要。建立了穩(wěn)定簡捷的包涵體復(fù)性、IL-18純化的工藝路線，蛋白純度可達97％以上；建立了鑒定IL-18活性方法。

本發(fā)明主要解決了IL-18純化工藝復(fù)雜，回收低和純度低等問題。本工藝特點簡捷、快速、回收率高和純度高(97％)。

本發(fā)明還提供了IL-18活性檢測方法。白細胞介素-18的活性鑒定通常采用PBMC細胞：即用IL-18刺激PBMC，根據(jù)產(chǎn)生INFγ的多少判定IL-18的活性；第二種方法是用IL-18刺激NK細胞增殖數(shù)量判定IL-18的活性，兩種方法都相對繁瑣，我們采用KG-1細胞(一種白血病細胞株)替代PBMC細胞，因KG-1細胞是傳代細胞，簡化了實驗程序。

重組表達載體、工程菌、制備方法及其應(yīng)用中所需原料及試劑均可由市場購得。

下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：

實施例1 構(gòu)建IL-18的原核表達載體pBV220-IL-18

通過RT-PCR獲得的含IL-18的基因用EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ雙酶切，然后與用EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ雙酶切的載體pBV220連接；構(gòu)建含IL-18基因的原核表達載體pBV220-IL-18,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建工程菌株DH5α-pBV220IL-18；(詳見圖2、3)。

實施例2 hrIL-18的發(fā)酵及高效表達

工程菌的活化、發(fā)酵、誘導(dǎo)及包涵體的回收：取-70℃保存的工程菌株接種到含Amp的營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12h以上；挑取單個菌落接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)12h以上；將菌液按1-10％比例接種到含Amp的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，28-32℃搖床培養(yǎng)12h以上；將菌液按5-10％比例接種到發(fā)酵罐內(nèi)，28-32℃條件下培養(yǎng)；待菌液濃度達到OD₆₀₀約為2.0-3.0后，升溫到42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3-6h，同時小量持續(xù)補加填料液，氨水自動調(diào)節(jié)pH7.0。培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體，菌體用TE緩沖液懸浮，冰浴條件下，高壓勻漿破碎菌體，反復(fù)4次。離心破碎后的菌體，收集沉淀，即為包涵體。

發(fā)酵體積：15-25L；獲得包涵體：150-300g；超濾濃縮10-20倍。

實施例3 hrIL-18的復(fù)性及純化

3.1包涵體的洗滌、溶解和復(fù)性：稱取適量實施例2制得的包涵體，加入包涵體洗滌液洗滌2次后，按照2-10％的比例加入包涵體溶解液，4℃條件下，磁力攪拌溶解5-10h以上；4℃，9000rpm，離心10min，收集上清液；按照10-20％的比例緩慢加入復(fù)性液，使蛋白濃度降到0.2％，4℃復(fù)性12-20h以上；立即純化。

3.2 hrIL-18的純化：用平衡液平衡羥基磷灰石層析柱，將上述稀釋后的復(fù)性液全部上樣，平衡羥基磷灰石層析柱所用的平衡液為20mmol PB緩沖液(pH7.0-8.0)，流速為10-20ml/min；用平衡液充分流洗雜蛋白到基線后，先后用含0.1、0.2、0.5和1.0M NaCl的平衡液洗脫，收集洗脫峰，經(jīng)SDS蛋白電 泳鑒定，目的蛋白存在于0.1NaCl洗脫峰中(圖4)；將上述0.1M NaCl洗脫峰樣品超濾濃縮后按床體積2-8％比例再上用平衡液平衡好的Sephacryl S-200-HR凝膠層析柱，流速為2-5ml/min；分步收集100min～120min間出現(xiàn)的蛋白峰，-20℃保存待鑒定(圖5)。

3.3純化的尿激酶原鑒定采用SDS蛋白電泳法，純度在97％以上；采用紫外分光光度計測定蛋白含量，約為0.5mg/ml。純化IL-18體積2-6L。

實施例4 hrIL-18生物活性測定

4.1人白血病細胞KG1細胞傳代培養(yǎng)：用含10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基，5％CO₂，37℃培養(yǎng)U937細胞；當細胞密度達到2×10⁶個細胞/ml時傳代；傳代細胞密度為4×10⁵細胞/ml。

4.2將hrIL-18用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基配制成50nmol備用；取96孔細胞培養(yǎng)板，于前5列每孔加100ul 20％FCS 1640培養(yǎng)基配制的細胞密度為2×10⁶細胞/ml，A、B、C、D排加ConA，終濃度為0.5mg/L；E、F、G、H孔不加ConA。于第1-5列每孔內(nèi)分別加入100ul 10倍稀釋的實施例3制備獲得的hrIL-18，混勻，第一列終濃度為25nmol；(每個稀釋度4孔)?；靹蚝?，將細胞培養(yǎng)板置37℃，5％CO₂孵箱培養(yǎng)24h；

4.3用ELISA法測IFN-γ效價收集培養(yǎng)上清，獲得IL-18的活性(圖6)。

實施例5 對比試驗

對照組：分為對照組1、對照組2、對照組3；

其中，對照組1(申請?zhí)枺?00820054133.1)；

對照組2(申請?zhí)枺?8103307.5)；

對照組3(J Immunol.156(1996),4274-4279)

實驗組：本發(fā)明實施例2、3制備獲得的發(fā)酵液、包涵體和IL-18。

結(jié)果見表1。

表1 試驗結(jié)果

從表1可見，本發(fā)明獲得的IL-18產(chǎn)量明顯高于對照組(P＜0.05)；純度優(yōu)于對照組。

實施例6 IL-18活性檢測方法對比例

對比例1：rhIL-18刺激PBMCs產(chǎn)生IFN-γ實驗

試驗方法：

(1)PBMCs的制備：取適量抗凝全血加等量的生理鹽水混勻，等量加入含淋巴細胞分離液的50ml離心管(或10ml)，離心2000rpm(水平轉(zhuǎn)子)，10min,取淋巴細胞層，用生理鹽水洗滌2次，1500rpm,10min，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×10⁶/ml；

(2)將上述細胞懸液加入IL-2或IL-12(100u/ml)，加入96孔培養(yǎng)板；100μl/孔；

(3)用1640-10％FCS稀釋IL-18(對照IL-18和自制IL-18)濃度分別為：1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml,1μg/ml,10μg/ml。

(4)加入上述含PBMCs的96孔板，每個滴度加4孔。

(5)37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)48h,收集細胞培養(yǎng)上清；

(6)用ELISA試劑盒測定IFN-γ含量。

(7)以標準IFN-γ為橫坐標，A值為縱坐標，化標準曲線；計算各IL-18組IFN-γ含量，換算比活性。

預(yù)期結(jié)果：

IL-18在IL-2或IL-12的協(xié)同下能夠刺激PBMCs細胞分泌IFN-γ，而且IFN-γ的分泌量與IL-18的用量和活性呈正相關(guān)。結(jié)果見圖7。

對比例2：rhIL-18增強NK細胞活性性實驗(直接熒光流式細胞儀法)

試驗方法：

(1)PBMCs的制備：取適量抗凝全血加等量的生理鹽水混勻，等量加入含淋巴細胞分離液的50ml離心管(或10ml)，離心2000rpm(水平轉(zhuǎn)子)，10min,取淋巴細胞層，用生理鹽水洗滌2次，1500rpm,10min，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×10⁶/ml；

(2)將上述細胞懸液加入IL-2或IL-12(100u/ml)，加入25ml培養(yǎng)瓶，共8瓶；

(3)用1640-10％FCS稀釋IL-18(對照IL-18和自制IL-18)濃度分別為：0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml。

(4)加入上述含PBMCs的PBMCs細胞中，每個滴度加1瓶。

(5)37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)24h,收集細胞培養(yǎng)；用培養(yǎng)基洗后調(diào)整細胞濃度為2×10⁶/ml。

(6)分別用熒光標記的抗CD56、CD69單抗標記；37℃孵育2h。

(7)用流式細胞儀測定CD56、CD69細胞的百分率。

計算各IL-18組CD56、CD69細胞的百分率，繪制比活性曲線。結(jié)果見圖8。

實驗組：本發(fā)明實施例4。實驗結(jié)果表明實驗組IL18能顯著刺激KG1細胞分泌INFγ，且有明顯的量效關(guān)系,與對照組比有極顯著性差異(p＜0.01)(圖6)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。