本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及適合于毛木耳表達(dá)的多功能纖維素酶基因Mfcsg及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

能源資源是國(guó)家的重要財(cái)富，在社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展中起到極為重要的作用。目前化石能源在世界能源消費(fèi)中長(zhǎng)期保持在85％以上。但由于化石能源不可再生并污染環(huán)境，迫切需要發(fā)掘替代能源。而生物能源具有可再生及環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)。纖維素降解酶類(lèi)可以利用纖維基質(zhì)分解生產(chǎn)可再生的生物燃料，價(jià)值巨大。

纖維素酶是將纖維素降解成纖維二糖和葡萄糖等小分子物質(zhì)的一類(lèi)酶的總稱(chēng)。從纖維素分解成葡萄糖至少需要3種纖維素酶協(xié)同作用，它們分別是內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶。而研究報(bào)道認(rèn)為福壽螺胃組織分離的多功能纖維素酶基因(multi-functional cellulase gene,Mfc)能夠編碼內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，前景看好。但多功能纖維素酶基因(Mfc)源于福壽螺，為動(dòng)物源基因，在其它物種中可能無(wú)法穩(wěn)定高效表達(dá)。因?yàn)槊總€(gè)物種的氨基酸密碼子使用上具有明顯的物種偏好性，并且密碼子是否得到優(yōu)化將直接影響mRNA穩(wěn)定性，影響細(xì)胞核糖體蛋白翻譯等活動(dòng)?；诖耍瑢?duì)異源基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化和改造以使外源基因能完成遺傳轉(zhuǎn)化并進(jìn)行高效表達(dá)是一個(gè)研究的難點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種適合毛木耳表達(dá)的多功能纖維素酶基因Mfcsg。

本發(fā)明公開(kāi)了一種適合于毛木耳表達(dá)的纖維素酶基因Mfcsg，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本發(fā)明還提供了含有所述多功能纖維素酶基因Mfcsg的表達(dá)載體。

具體的，所述的表達(dá)載體含有多功能纖維素酶基因Mfcsg表達(dá)框。

具體的，所述的表達(dá)框從5’到3’依次包含以下元件：毛木耳Gpd啟動(dòng)子、內(nèi)含子、多功能纖維素酶基因Mfcsg和Hpt基因。

本發(fā)明還提供的含有所述多功能纖維素酶基因Mfcsg或所述表達(dá)載體的宿主。

具體的，所述的宿主為原核生物或真菌。

具體的，所述的原核生物為大腸桿菌或農(nóng)桿菌。

本發(fā)明還提供了所述多功能纖維素酶基因Mfcsg在制備纖維素酶中的用途。

本發(fā)明還提供了所述的表達(dá)載體在制備纖維素酶中的用途。

本發(fā)明還提供了所述的宿主在制備纖維素酶中的用途。

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示福壽螺與毛木耳在氨基酸密碼子偏好性上存在明顯差異，如果不經(jīng)密碼子優(yōu)化直接轉(zhuǎn)入毛木耳，可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)化后該基因不能轉(zhuǎn)錄形成mRNA，或形成mRNA在宿主細(xì)胞內(nèi)不能穩(wěn)定存在。在翻譯上，如果福壽螺的基因密碼子在毛木耳細(xì)胞內(nèi)剛好是稀有密碼子，這類(lèi)問(wèn)題會(huì)導(dǎo)致該基因不能得到較好翻譯，從而影響該基因高效表達(dá)。如分析發(fā)現(xiàn)毛木耳存在UUA、CUA、AUA、GUA等稀有密碼子，如果不排除這些毛木耳稀有密碼子的序列，那么轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入的毛木耳細(xì)胞的外源基因表達(dá)就會(huì)受到影響，不易實(shí)現(xiàn)外源基因在目標(biāo)宿主細(xì)胞進(jìn)行高效表達(dá)。而排除了稀有密碼子、重復(fù)序列等不良影響因素設(shè)計(jì)的序列將是外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入宿主細(xì)胞表達(dá)的最佳材料。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化形成的Mfcsg基因片段與PPK2連接構(gòu)建農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體，通過(guò)AGL-1工程菌轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入毛木耳細(xì)胞，得到了高效表達(dá)，其轉(zhuǎn)化子菌株與對(duì)照菌株(出發(fā)菌株)的木屑培養(yǎng)料菌絲生長(zhǎng)速度存在極顯著差異，菌絲生長(zhǎng)速度比對(duì)照提高了10.57％，提升了菌絲在木屑基質(zhì)中的吃料速度，這也是對(duì)密碼子優(yōu)化型基因高效表達(dá)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本發(fā)明將福壽螺基因Mfc與毛木耳轉(zhuǎn)錄本CDS密碼子偏好性進(jìn)行了比較分析，并依據(jù)毛木耳密碼子偏好性特征優(yōu)化獲得了改造型Mfcsg序列，并在毛木耳細(xì)胞中得到了較好表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為毛木耳外源基因改造和表達(dá)提供了參考，表明外源基因的密碼子優(yōu)化改造能夠?qū)崿F(xiàn)異源基因在宿主細(xì)胞高效表達(dá)。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的多功能多功能纖維素酶基因Mfcsg，所述基因能夠在毛木耳等真菌中高效表達(dá)。將含有該基因表達(dá)元件的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌或農(nóng)桿菌，得到了重組菌。該重組菌轉(zhuǎn)化毛木耳等真菌就可以發(fā)酵批量生產(chǎn)多功能纖維素酶蛋白，或者提高毛木耳菌株吃料能力，提升產(chǎn)量。對(duì)于多功能纖維素酶制劑商業(yè)化生產(chǎn)和毛木耳等食用菌產(chǎn)量提升具有重大價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1福壽螺Mfc基因與其它近源序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

圖2優(yōu)化型多功能纖維素酶基因(Mfc)序列密碼子使用情況。

圖3改造型Mfcsg基因和Mfc基因的序列比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示兩個(gè)序列相似度只有0.801，表明兩個(gè)序列間存在明顯差異，豎線對(duì)應(yīng)堿基表示相同堿基。

圖4為重組載體示意圖。Pgpd1ap為毛木耳Gpd啟動(dòng)子，gpdA為內(nèi)含子，Mfcsg為Mfc基因改造序列，Hpt為潮霉素B抗性基因。

圖5為Mfcsg基因相對(duì)定量PCR檢測(cè)結(jié)果。PCR分析結(jié)果顯示Mfcsg基因已在轉(zhuǎn)化菌株中高效表達(dá)，而出發(fā)菌株并無(wú)該基因表達(dá)信號(hào)。17為出發(fā)菌株；agakimfc為Mfcsg基因轉(zhuǎn)化菌株。圖例由Bio-Rad CFX Manager 3.1軟件計(jì)算生成。

圖6為Mfcsg轉(zhuǎn)基因菌株與出發(fā)菌株吃料速度比較圖。吃料速度結(jié)果顯示Mfcsg基因轉(zhuǎn)化菌株吃料速度顯著高于出發(fā)菌株。17為出發(fā)菌株；agakimfc為Mfcsg基因轉(zhuǎn)化菌株。

具體實(shí)施方式

下屬實(shí)施例中所使用的材料：

福壽螺，購(gòu)自成都市青石橋市場(chǎng)。

感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自上海邁其生物科技有限公司。

毛木耳菌株“黃耳10號(hào)”四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所保存的菌株，為廣泛栽種的商業(yè)化菌株，在市場(chǎng)上也易買(mǎi)到。

下屬實(shí)施例中所使用的試劑：

本試驗(yàn)RNA提取、1st cDNA合成試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，RT-PCR試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司合成，高保真Taq酶購(gòu)自MBI Fermentas，pEASY-T1載體購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司。

實(shí)施例1 多功能纖維素酶基因Mfc的克隆及優(yōu)化

將福壽螺胃組織獲得后提取RNA，按照1st cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，使用引物對(duì)(mfcF1：5'-TCGACGACGCTTCAGTCAAGC-3'，mfcR1：5'-GTTGCCCTCTGAGTGT CGCTC-3')通過(guò)高保真Taq酶PCR擴(kuò)增MFC基因序列，純化擴(kuò)增片段并兩端加“A”后將擴(kuò)增片段連接到pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒到DH5α感受態(tài)細(xì)胞后挑單克隆送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。測(cè)序后發(fā)現(xiàn)該基因序列有1188bp，編碼395個(gè)氨基酸，提交GenBank得到受理號(hào)為KF636134.1(SEQ ID No.1)。

將福壽螺Mfc基因序列與近緣基因Egxa(FJ183727.1，Ampullaria crossean)、Mfc(EU599577.1,Ampullaria crossean)、Egx1(DQ848667.1，Pomacea canaliculata)、Xylanase(AY941794.1，Ampullaria crossean)、Egx3(DQ848668.1，Pomacea canaliculata)、Egx1(DQ848670.1，Pomacea canaliculata)、Egx3(DQ848669.1，Pomacea canaliculata)進(jìn)行序列比對(duì)。采用MEGA4軟件進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)克隆獲得Mfc基因與其他近源基因存在差異，差異最小的是福壽螺來(lái)源的Egxa(FJ183727.1)和Mfc(EU599577.1)，遺傳距離分別為0.006和0.007；差異最大的是同樣來(lái)源的Egx1(DQ848670.1)及Egx3(DQ848669.1)，遺傳距離分別為0.799和0.816。

由于該基因?yàn)楦勐菥幋a酶蛋白，而后續(xù)研究需要在毛木耳等真核生物表達(dá)，因此將上述福壽螺源多功能纖維素酶基因的編碼密碼子與毛木耳偏好密碼子進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)Paul和Elizabeth(1991)篩選原則^[10](一條以ATG為起始密碼子，以TAA、TAG或TGA為終止密碼子且長(zhǎng)度大于300bp的完整CDS序列)，選取德陽(yáng)什邡毛木耳栽培基地采集的黃耳10號(hào)子實(shí)體樣品測(cè)序獲得的CDS(comp22688_c0_seq，環(huán)三磷酸核苷水解酶蛋白編碼基因序列，具有完整起始密碼子ATG及終止密碼子TAA，密碼子4996個(gè))為毛木耳測(cè)試樣本，以克隆獲得的Mfc基因?yàn)楦勐轀y(cè)試樣本，運(yùn)用CodonW軟件計(jì)算福壽螺及毛木耳密碼子使用次數(shù)和同義密碼子相對(duì)使用度(表1和表2)。

表1 Mfc基因密碼子偏好性分析

表2 毛木耳CDS密碼子偏好性分析

注：表1和表2中RSCU值大于1的用下劃線標(biāo)記；使用頻率最高的密碼子用“□”標(biāo)記。

運(yùn)用CodonW軟件分析了Mfc基因的密碼子(共計(jì)396個(gè))使用次數(shù)和同義密碼子相對(duì)使用度(表1)。其中RSCU>1的密碼子共計(jì)21個(gè)，為福壽螺Mfc基因的偏好性密碼子，其中CUG、GUG、AGC、AGA這4個(gè)密碼子RSCU≥2，偏好性較強(qiáng)。而毛木耳CDS(comp22688_c0_seq，環(huán)三磷酸核苷水解酶蛋白)共4996密碼子，RSCU>1的密碼子共計(jì)26個(gè)，其中RSCU≥2密碼子有5個(gè)，分別為CUC、AUC、GUC、CGC、GGC，偏好性較強(qiáng)。

總體上，福壽螺與毛木耳偏好密碼子不同的氨基酸有10個(gè)(不包含起始密碼子及終止密碼子)，相同偏好密碼子的氨基酸有11個(gè)，不同偏好性密碼子約占半數(shù)。其中RSCU≥2密碼子中，福壽螺Mfc基因有4個(gè)，毛木耳CDS有5個(gè)。其中4個(gè)氨基酸的密碼子偏好性最強(qiáng)，分別是亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)、絲氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)，并且偏好的密碼子都各不相同，毛木耳還多一個(gè)偏好性較強(qiáng)的異亮氨酸(Ile)。在利用率低于10％的密碼子方面，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)毛木耳有亮氨酸(UUA 2.4％、CUA 5.75％)、纈氨酸(GUA 6.87％)等利用率極低的密碼子。優(yōu)化型多功能纖維素酶基因(Mfc)序列密碼子使用情況見(jiàn)圖2。

根據(jù)密碼子的偏好性，在不改變氨基酸組成順序的基礎(chǔ)上，對(duì)已知的編碼多功能纖維素酶基因Mfc序列進(jìn)行改造，將福壽螺的某些稀有密碼子替換為毛木耳偏愛(ài)密碼子，替換掉毛木耳利用率低于10％的密碼子，避免出現(xiàn)mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)及翻譯起始位點(diǎn)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，篩選具有最佳RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及自由能的序列，最后得到的多功能纖維素酶基因優(yōu)化序列Mfcsg(如SEQ ID No.4所示)。用DNAstar7.1.0軟件檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)原始序列及改造序列兩個(gè)序列相似度只有0.801，表明兩個(gè)序列間存在明顯差異(圖3)。優(yōu)化前的序列GC含量為54.04％，與毛木耳GC含量(58.16％)不一致。未經(jīng)優(yōu)化的Mfc序列最小自由能為-283.53Kcal/mol，存在反向重復(fù)序列，序列不太理想。改造后的Mfcsg序列GC含量從原始Mfc序列的54.04％增加到58.16％，與毛木耳遺傳背景一致，沒(méi)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、重復(fù)序列及反向重復(fù)序列，達(dá)到實(shí)驗(yàn)預(yù)期目的，能夠作為毛木耳外源基因轉(zhuǎn)化材料。較低的自由能使得優(yōu)化型的基因轉(zhuǎn)錄RNA結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，無(wú)發(fā)夾及重復(fù)序列結(jié)構(gòu)更利于轉(zhuǎn)錄和翻譯，序列優(yōu)化效果良好。

實(shí)施例2 毛木耳Mfcsg基因轉(zhuǎn)化菌株定量PCR檢測(cè)

將毛木耳Gpd啟動(dòng)子、Mfcsg及Hpt基因起始密碼子到NcoⅠ之間序列組成的表達(dá)序列(Gpd啟動(dòng)子引物為F：CGAAGTTTGAGGTGGTGCG，R：TTTAATTCAAGCAGTCAATGGATTG，如SEQ ID No.2所示)，Mfcsg基因克隆自福壽螺并進(jìn)行了密碼子改造(如SEQ ID No.4所示)，Hpt基因起始密碼子到NcoⅠ之間序列PCR擴(kuò)增自ppk2質(zhì)粒(如SEQ ID No.5所示)，插入到PPK2(購(gòu)自杭州工道生物技術(shù)有限公司)的EcoRⅠ和NcoⅠ位點(diǎn)間得到的重組質(zhì)粒(圖譜見(jiàn)圖4)。通過(guò)購(gòu)買(mǎi)DH5α試劑(上海邁其生物科技有限公司)感受態(tài)，按照說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化子，液體放大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化到AGL1感受態(tài)細(xì)胞(上海邁其生物科技有限公司)，得到轉(zhuǎn)化子AGL1::Akimfc。而后通過(guò)AGL1工程菌(AGL1::Akimfc)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入毛木耳得到毛木耳轉(zhuǎn)化菌株AG-Akimfc。以AG-Akimfc轉(zhuǎn)化菌株為測(cè)試菌株，以出發(fā)菌株為對(duì)照菌株，將轉(zhuǎn)化子菌株及對(duì)照菌株接種到PDA液體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)10d后收集菌絲。將菌絲樣品提取RNA后RT-PCR獲得1st cDNA，以此為模板，采用引物對(duì)(GAPDF：5'-GCCGTATCGGTCGGATTGTGAC-3'，GAPDR：5'-TGAGCTTGCCGTCCTTGGTCT-3')擴(kuò)增Gapdh內(nèi)參基因，擴(kuò)增片段為167bp。以引物對(duì)(mfcrtF：CGGCTACAACCTGGAGCTGTTC，mfcrtR：TGACTGGAGCGAGGCGATGT)擴(kuò)增優(yōu)化型基因Mfcsg，擴(kuò)增片段為118bp。PCR擴(kuò)增程序：95℃40S，1cycle；95℃20S，60℃20S，plate read，45cycles。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Mfcsg表達(dá)量高，而對(duì)照菌株未檢測(cè)到Mfcsg擴(kuò)增信號(hào)(圖5)，說(shuō)明多功能纖維素酶基因Mfcsg已經(jīng)轉(zhuǎn)入到了毛木耳細(xì)胞，并能夠得到高效表達(dá)。

實(shí)施例3 Mfcsg基因轉(zhuǎn)化菌株吃料能力測(cè)試

為了測(cè)試毛木耳轉(zhuǎn)化子AG-Akimfc中Mfcsg基因?qū)瓿粤夏芰Φ挠绊?，以出發(fā)菌株為對(duì)照，以Akimfc轉(zhuǎn)化菌株為測(cè)試菌株。將轉(zhuǎn)化子菌株及對(duì)照菌株接種到培養(yǎng)料試管中(培養(yǎng)料配方：木屑33％，玉米芯30％，米糠20％，棉籽殼10％，玉米粉2％，石灰4％，石膏1％)，25℃培養(yǎng)，在14d、18d、22d、24d劃線記錄菌絲生長(zhǎng)尖端位置，而后計(jì)算平均菌絲生長(zhǎng)速度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Akimfc轉(zhuǎn)化菌株菌絲生長(zhǎng)速度與對(duì)照存在極顯著差異，比對(duì)照提高了10.57％(圖6)，表明改造型多功能纖維素酶基因Mfcsg基因的表達(dá)對(duì)毛木耳吃料能力有極大提升作用，利于提高毛木耳生物轉(zhuǎn)化率，提高生物產(chǎn)量。

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SEQUENCE LISTING

<110> 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所

<120> 適合于毛木耳表達(dá)的多功能纖維素酶基因Mfcsg及其應(yīng)用

<130> A161063KN

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1188

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 福壽螺多功能纖維素酶基因Mfc序列

<400> 1

atgccctctg gtgctgctgg tgctggggtg accagcgaga tcgacagact gagaagaagc 60

gacataacgg tccacgtgaa tgttggtggt aacatcaacc acggtcaagt gagcattcgt 120

gtattacaaa agagaaaggc attcccgttc gggacatgtg tggccgcctg ggcctacaac 180

gatgggtcca aaggagcata ccgggatttc atccaccagc actacaactg ggcggtgcca 240

gaaaactcac tcaagtgggc tagcatcgaa cctaacaggg gacaaaagaa ctatcagcct 300

ggcctaaaca tgcttcacgg actgagaaat cacgggatta aggtgagagg tcacaacctg 360

gtgtggtctg tcgacaatac ggtgcagaac tgggtcaagg ctctgcatgg ggatgagctt 420

cgaaaggttg tccatgacca cattgtggaa accatcaaca catttaaggg attagtggag 480

cactgggatg tgaacaacga gaacctgcat ggccagtggt accagcatca actgaatgac 540

aatggctaca acctggaact gttccgtatc gcacacgccg ccgaccccaa cgtcaaactc 600

ttcctcaacg actacaacgt tgtgtccaac agttattcaa caaacgacta tcttcgacaa 660

ggtcaacagt ttaaggccgc taatgtgggt ctttacggtt tgggtgctca gtgccacttt 720

ggcgacgaaa gcgacccaga acccggtact aagcaacgtc tggatacttt agctcaagtg 780

ggcgtgccca tctgggccac tgagttggat gtggtagctt cggatgagaa cagacgagcg 840

gacttctacg agcacgcgct gacagtcctg tacggccatc atgccgtgga gggcatcctc 900

atgtggggct tctgggacaa ggcccaccgg cgtggtgcca gggctgctct tgttgtcgga 960

gacaacctgc agctgacggc ggccggacgt cgcgtgctgg agctctttga gcacaggtgg 1020

atgacagacg agacgcacaa cctggcagcg ggcactcagt tcacagtacg cggtttccat 1080

ggcgactacg aggtgcaagt catcgtccag ggtcaagagc acactaacct gaggcagacg 1140

ttctcgttgg gcaacggtcc ccacaccgtc aacattaatg ttagctag 1188

<210> 2

<211> 1021

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Gpd啟動(dòng)子序列

<400> 2

cgaagtttga ggtggtgcga atacgctcgt aaggtgacaa tacagcataa ctgatatatc 60

ttgtgacaag ccatatcggg catatccccg gtcacatcgt cgagcggaat tttttctctt 120

tccagagtgc tagtgagatg cgactcttgt cgtactagct tagtgaacaa tgaccaagaa 180

agctcgtgaa gaggtcgggt ccggtcgcgc taatgtacag gatggcctta gctggagtat 240

agcagttaac tcgggagtga ttatacatcg gttgagaggt atttcgtttc aggccttgcc 300

tctaatccct tgctctgcat atgcaccaga taaatccgtt ttgtcgtaga tgcgagagtt 360

caggttttac gccaaaccga aaagagttgc atgagcatcc ctttatgctg gttatctgag 420

cgggcccgta tcctatcggc gttagagtgc agtcggagag ccgcatgtat cacggaaagg 480

actcgaacag ggagttttat ctatttttat tggtcgatat cagtcagatt gtcagtgcgt 540

caaagttgca tccataaggc tactacggtg aaaccggtgt atcctgggat atcatgaaat 600

ggttgtatgc agaagataag aataagagta gttctagaac aacaaaccca ggccagggag 660

gaagctgtag catttgcaag actttgcagg gcttttcaaa ggcacttcca tccaaagctc 720

gagcacggtt ccaggcaacc ttagtcatgg ggcgatagaa ctgaagaacg tttgctgatt 780

ggcagtccat cccaaaggac tcggccaata aatcctaccc aatcgcaggt ccgaggtact 840

aaagtgtttt aaggtctaga cttttagggc tattgtcgaa gtcacaacat cacgcaatca 900

agatttgact gaagcgcgat tatctataaa aggatcagtt gtgtttttcg tccgcatctt 960

ttccttgttc cacaaccttc gattctaaat acactccaat ccattgactg cttgaattaa 1020

a 1021

<210> 3

<211> 116

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> PPK2質(zhì)粒內(nèi)含子序列

<400> 3

gtaagtactt tgctacatcc atactccatc cttcccatcc cttattcctt tgaacctttc 60

agttcgagct ttcccacttc atcgcagctt gactaacagc taccccgctt gagcag 116

<210> 4

<211> 1188

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 改造型多功能纖維素酶基因Mfcsg序列

<400> 4

atgccaagcg gtgctgcagg tgctggagtt acaagcgaga tcgacaggct taggcggtct 60

gatatcacag tccacgtcaa cgtcggtggt aacatcaacc acggtcaggt ctcgatccgg 120

gtcctccaga agcggaaggc gttcccattc ggaacctgcg tggcagcatg ggcatacaac 180

gacggtagta agggggcata ccgggacttc atacaccagc actacaactg ggctgtgccc 240

gagaactcgc tcaagtgggc ttccatcgag ccgaacaggg gacagaagaa ctaccagccg 300

ggattgaaca tgctgcacgg cctgcggaac catggaatca aggtgcgggg tcataacctc 360

gtgtggtcgg tggacaatac ggtgcagaac tgggtcaagg ctctgcacgg ggacgagctg 420

aggaaggtgg ttcacgacca tatcgtcgag accatcaaca cgttcaaggg cctggtggag 480

cactgggacg tcaacaatga gaacctccac ggccagtggt accagcacca gctgaacgac 540

aacggctaca acctggagct gttccggatc gcccacgctg ccgatcccaa tgtgaaactc 600

ttcctcaacg actacaatgt cgtctccaac agttactcga cgaacgacta tctccgccag 660

gggcagcagt tcaaagccgc caatgtcggt ctctacgggc tcggggcgca gtgccacttc 720

ggcgacgagt ctgaccccga accgggaact aagcaacggc ttgacacgct cgcgcaagtt 780

ggggttccga tttgggccac tgaactcgac gttgtcgcgt ctgatgagaa tcgccgcgcg 840

gatttctatg agcacgcgct tacggtcctc tatggacacc acgcggttga gggcattctc 900

atgtggggct tctgggacaa agcgcaccgg cgcggggcgc gggcggcgct tgttgttggg 960

gacaatttgc aattgactgc ggcgggccgc cgcgtccttg aattgtttga acatcggtgg 1020

atgactgacg agacgcataa tcttgccgcg ggcacccaat tcaccgtccg cgggtttcat 1080

ggcgactatg aggtccaagt cattgtccaa ggccaagagc ataccaacct ccggcaaacg 1140

ttctccttgg gcaatgggcc gcataccgtc aacataaacg tctcctaa 1188

<210> 5

<211> 347

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Hpt基因起始密碼子到NcoⅠ之間序列

<400> 5

atgcctgaac tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt cgacagcgtc 60

tccgacctga tgcagctctc ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt cgatgtagga 120

gggcgtggat atgtcctgcg ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa agatcgttat 180

gtttatcggc actttgcatc ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga cattggggaa 240

ttcagcgaga gcctgaccta ttgcatctcc cgccgtgcac agggtgtcac gttgcaagac 300

ctgcctgaaa ccgaactgcc cgctgttctg cagccggtcg cggaggc 347

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物mfcF1

<400> 6

tcgacgacgc ttcagtcaag c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物mfcR1

<400> 7

gttgccctct gagtgtcgct c 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Gpd啟動(dòng)子上游引物

<400> 8

cgaagtttga ggtggtgcg 19

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Gpd啟動(dòng)子下游引物

<400> 9

tttaattcaa gcagtcaatg gattg 25

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物GAPDF

<400> 10

gccgtatcgg tcggattgtg ac 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物GAPDR

<400> 11

tgagcttgcc gtccttggtc t 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物mfcrtF

<400> 12

cggctacaac ctggagctgt tc 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物mfcrtR

<400> 13

tgactggagc gaggcgatgt 20