技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種臺灣乳白蟻內(nèi)源性β-葡萄糖苷酶的編碼基因、該基因編碼的蛋白質(zhì)、相應(yīng)的表達載體和應(yīng)用。技術(shù)背景能源短缺是全球面臨的嚴(yán)重問題，然而在混合燃料中所使用的絕大部分乙醇源于谷物發(fā)酵，存在與人爭糧的問題。木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生生物質(zhì)資源（園林綠化垃圾、谷物秸稈、雜草、木屑及一些動物的固體糞便等），如果用纖維素酶生物降解木質(zhì)纖維素產(chǎn)生還原糖，再進一步發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，不僅提供了大量纖維素乙醇燃料，并且有助于生態(tài)環(huán)境的保護（鄧天福等，2010）。此外，纖維素酶在食品、紡織、飼料、洗滌劑和中草藥提取等行業(yè)或領(lǐng)域都有應(yīng)用的廣泛：提高食品的品質(zhì)、縮短酒精、醬油發(fā)酵時間、提高果汁提取率和促進汁液澄清（閆訓(xùn)友等，2004）；纖維素酶作為飼料添加劑，可明顯提高飼料的營養(yǎng)價值，強化消化系統(tǒng)的酶解功能，促進動物生長發(fā)育（胡軼和孫波，2006）；改善紡織工業(yè)棉織物的手感和外觀，并且基本解決了石磨水洗工藝中存在的環(huán)境污染等問題（吳大付等，2007）。纖維素是由D-葡萄糖以β-1,4糖苷鍵組成的多聚糖，包括內(nèi)切葡聚糖酶（endo-β-1,4-glucanases,EGs,EC3.2.1.4）、外切葡聚糖酶（exo-β-1,4-glucanases,C1）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidases,BGs,EC3.2.1.21）三種主要的類型。外切葡聚糖酶水解纖維素產(chǎn)生纖維二糖和葡萄糖，而多數(shù)內(nèi)切葡聚糖酶作用后產(chǎn)生纖維二糖、少量葡萄糖和纖維三糖，β-葡萄糖苷酶作用于纖維二糖及低分子量的纖維寡糖的非還原端，水解生成葡萄糖（Klesov,1991;Watanabeetal.,2010）。β-葡萄糖苷酶是降解纖維素的關(guān)鍵酶系。目前從自然界中尋找高活性的纖維素酶，進行生物降解是解決纖維素酶效率和降低成本的有效途徑。一些植食性昆蟲特別是木食性昆蟲（xylophagousinsects）能通過纖維素酶高效降解纖維素類物質(zhì)，并滿足自身生長發(fā)育的需要（WatanabeandTokuda,2001;2010），如食木白蟻、天牛幼蟲、木蜂幼蟲及鱗翅目幼蟲等。其中，白蟻（等翅目Isoptera，現(xiàn)有證據(jù)支持其并入蜚蠊目Blattodea）是消化纖維素最有效的昆蟲類群，被認為是地球上最小的高效生物反應(yīng)器（Ohkuma,2003），每年消化的纖維素類物質(zhì)總量巨大。臺灣乳白蟻（CoptotermesformosanusShiraki）屬鼻白蟻科（Rhinotermitidae）、乳白蟻屬（Coptotermes），對農(nóng)林樹木、建筑結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重危害（Lin,1987；RustandSu,2012），對纖維素類物質(zhì)具有很高的降解效率。臺灣乳白蟻體內(nèi)具有豐富纖維素酶及其基因，目前多個臺灣乳白蟻內(nèi)源性纖維素酶基因已經(jīng)克隆得到全長cDNA序列，其中EG酶有包括CfEG1、CfEG1b、CfEG2、CfEG3、CfEG3a、CfEG3b、CfEG4、CfEG5在內(nèi)的八個同源基因（Nakashimaetal.,2002b;Zhangetal.,2009;Zhangetal.,2011），而β-葡萄糖苷酶基因僅有Glu1A、Glu1B、Glu1C、Glu1D四個同源基因（Zhangetal.,2010;Zhangetal.,2012a）。目前用纖維素酶降解纖維素的工藝中，困難在于纖維素酶效率低，對環(huán)境條件要求苛刻，而且成本高，從白蟻體內(nèi)挖掘新的纖維素酶基因加以利用，是解決這一問題的有效途徑之一。此外纖維素酶基因作為白蟻防治藥物靶標(biāo)，也是未來白蟻生物防治的發(fā)展方向。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種在不同溫度下相對穩(wěn)定表達的β-葡萄糖苷酶的編碼基因。本發(fā)明另一目的在于提供上述編碼基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還有一個目的在于提供上述編碼基因的原核表達載體。本發(fā)明還有一個目的在于提供上述編碼基因的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：一種臺灣乳白蟻內(nèi)源性β-葡萄糖苷酶的編碼基因，其序列如SEQIDNO:1所示。上述臺灣乳白蟻內(nèi)源性β-葡萄糖苷酶的編碼基因所編碼的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。一種原核表達載體，用于表達臺灣乳白蟻內(nèi)源性β-葡萄糖苷酶的編碼基因。本發(fā)明所述臺灣乳白蟻內(nèi)源性β-葡萄糖苷酶的編碼基因?qū)囟让舾行缘?，?jīng)實驗證實，低溫與高溫脅迫不會影響該基因的表達。本發(fā)明所述臺灣乳白蟻內(nèi)源性β-葡萄糖苷酶的編碼基因?qū)r(nóng)藥脅迫作出響應(yīng)，經(jīng)試驗證實，臺灣乳白蟻取食吡蟲啉后該基因表達第三天開始作出明顯響應(yīng)，第四天該基因表達量顯著上調(diào)。該基因可用于研究白蟻纖維素酶基因表達調(diào)控機理；該基因編碼的β-葡萄糖苷酶可用于纖維素降解；該基因及其表達酶類可用于纖維素乙醇燃料、食品與飼料工業(yè)的開發(fā)應(yīng)用；該基因及其表達酶類可用作為白蟻防治的靶標(biāo)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明提供了一種新的β-葡萄糖苷酶的編碼基因、引物及載體?？捎糜诶w維素的降解、纖維素乙醇燃料、食品與飼料工業(yè)的開發(fā)應(yīng)用，所述β-葡萄糖苷酶的編碼基因及其表達酶類可用作為白蟻防治的靶標(biāo)。附圖說明圖1為基因CfBG-Ib的3’RACE和5’RACEPCR結(jié)果（M為D2000DNAMaker，1為基因的5’RACEPCR擴增結(jié)果，2為基因的3’RACEPCR擴增結(jié)果）。圖2為基因CfBG-Ib編碼的氨基酸序列信號肽預(yù)測。圖3為CfBG-Ib的三維結(jié)構(gòu)（注：基于模板構(gòu)建的CfBG-Ib蛋白的三維結(jié)構(gòu)，模板覆蓋84%的氨基酸，可信度大于90%）。圖4為重組蛋白的原核表達（1、2、4是誘導(dǎo)的pET-32a-CfBG-Ib的原核表達，3是未誘導(dǎo)的pET-32a-CfBG-Ib的原核表達）。圖5為溫度脅迫處理24h后CfBG-Ib基因表達水平（所有數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示差異顯著（P<0.05））。圖6為溫度脅迫處理24h后Glu1B基因表達水平（所有數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示差異顯著（P<0.05））。圖7為吡蟲啉處理后CfBG-Ib基因表達水平（所有數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示差異顯著（P<0.05））。圖8為吡蟲啉處理后Glu1B基因表達水平（所有數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示差異顯著（P<0.05））。具體實施方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明做進一步闡述。但實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例11.白蟻總RNA的提取臺灣乳白蟻總RNA的提取按照TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit（TaKaRa公司）使用說明進行。2.第一鏈cDNA合成第一鏈cDNA的合成使用PrimeScriptTMII1stStrandcDNASynthesisKit（TaKaRa）。3.簡并引物設(shè)計采用CODEHOP（ConsensusDegenerateHybridOligonuleotidePrimers）在線軟件程序設(shè)計β-葡萄糖苷酶的簡并引物，可以得到數(shù)對由有簡并性的核苷酸鏈組成的簡并引物序列（其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，H=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T，N=A/C/G/T）。PCR擴增后，取5μl產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，檢測后剩余的產(chǎn)物用作切膠回收目的DNA片段。PCR產(chǎn)物連接采用pMDTM18-TVectorCloingKit。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化4.1大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備：1)從大腸桿菌DH5α平板上挑取一個單菌落接于3mlLB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃搖床培養(yǎng)過夜；2)取0.5ml上述菌液轉(zhuǎn)接到含有50mLLB液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃下250rpm搖床培養(yǎng)2-3h，測定OD550為0.6左右；3)將菌液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm離心5min；4)將離心管倒置以倒盡上清液，加入25ml冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30min后，4℃，5000rpm離心5min；5)棄上清液后，用2.5ml冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液重懸，每份100μl分裝細胞，可以直接用作轉(zhuǎn)化。4.2熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞：1)取兩管制備好的100μlDH5α感受態(tài)細胞，其中一管加入10μl連接產(chǎn)物，另一管作陰性對照，兩管輕輕混勻后冰上放置30min；2)42℃水浴中45s進行熱激轉(zhuǎn)化，然后迅速放回冰中，靜置3min；3)向上述管中分別加入400μlLB液體培養(yǎng)基輕輕混勻，37℃震蕩培養(yǎng)1h；4)在超凈工作臺中取上述轉(zhuǎn)化混合液100μl，滴到含氨芐青霉素（100ug/ml）的固體LB平板上，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻后，封口膜將培養(yǎng)皿密封；5)在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記，37℃倒置過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化子篩選及驗證5.1菌液PCR鑒定在超凈工作臺中挑取5個單菌落，分別接種至5mlLB液體培養(yǎng)基（含100μg/ml氨芐青霉素）的10ml搖菌管中，37℃，250rpm搖菌過夜培養(yǎng)，至OD550為0.6左右。取1μl菌液作為cDNA模板，進行PCR鑒定。在PCR管中加入以下體系：組分使用量PremixTaq10μlpMD18T-simpleprimers0.5+0.5μlcDNA模板1μldH2Oupto20μl將上述菌落PCR反應(yīng)體系混勻，進行PCR擴增后，取5μl產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，經(jīng)鑒定呈陽性的菌液抽提重組質(zhì)粒，部分菌液4℃保存?zhèn)溆?。質(zhì)粒酶切鑒定質(zhì)粒DNA的提取與純化采用PlasmidMiniKitI（OmegaBio-Tek），具體步驟如下：1)用離心管收集1.5-5ml經(jīng)菌落PCR鑒定呈陽性的菌液，12000rpm，室溫離心1min，棄去上清，收集菌體于1.5ml離心管中；2)加入250μl預(yù)冷的SolutionⅠ（已加RNaseA），充分懸浮菌體沉淀；3)加入250μlSolutionⅡ，溫和充分地上下顛倒離心管，至液體澄清，室溫放置2min；4)加入350μlSolutionⅢ，溫和充分地上下顛倒離心管8-9次，至白色沉淀不再形成，12000rpm，室溫離心10min；5)把一干凈HiBind?DNAMinicolumn置于一2ml收集管中，將上述離心上清液轉(zhuǎn)移至HiBind?DNAMinicolumn中，12000rpm，室溫離心1min；6)棄濾液，加入500μlBufferHB，12000rpm，室溫離心1min；7)棄濾液，加入750μlWashBuffer（已加無水乙醇），12000rpm，室溫離心1min；8)重復(fù)操作步驟7；9)棄濾液，12000rpm，室溫離心1min；10)將HiBind?DNAMinicolumn置于一新的離心管中，加入50-100μl滅菌去離子水或TEBuffer至Silica膜中央，12000rpm，室溫離心1min洗脫質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒雙酶切反應(yīng)體系如下：組分使用量質(zhì)粒DNAxμlQuickCutEcoRI1μlQuickCutSalI1μl10×QuickCutGreenBuffer5μldH2Oupto20μl輕輕混勻后瞬時離心，37℃保溫15min。酶切產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定。測序鑒定將酶切鑒定呈陽性的菌液送華大基因進行測序，序列去載體拼接后提交至NCBI進行BLAST比對分析。纖維素酶基因全長序列的克隆6.1cDNA文庫的構(gòu)建為了獲取白蟻纖維素酶cDNA的全長序列，采用快速擴增cDNA末端（RACE）的方法。應(yīng)用SMARTer?RACEcDNAAmplificationKit（Clontech公司）構(gòu)建cDNA全長文庫，用作RACEPCR的模板，具體步驟如下：1)在PCR管（A管）中加入以下體系(MixtureB)：組分使用量5×First-StrandBuffer4μlDTT（100mM）0.5μldNTPs（20mM）1μlTotal5.5μl輕輕混勻后瞬時離心，室溫放置備用；2)在另一PCR管中加入以下體系（5’-RACE和3’-RACE分開進行）：5’-RACE（B1管）3’-RACE（B2管）5μlRNA5μlRNA1μl5’-CDSPrimerA1μl3’-CDSPrimerA5μlRNasefreedH2O6μlRNasefreedH2OTotal11μlTotal12μl輕輕混勻后瞬時離心；3)將B1管和B2管置于PCR儀上，72℃，3min；42℃，2min，冷卻后14000g，離心10s；4)B1管中加入1μlSMARTerIIAOligonucletide；5)配制以下反應(yīng)體系：5’-RACEcDNA3’-RACEcDNA5.5μlBufferMixfromtubeA5.5μlBufferMixfromtubeA12μlBufferMixfromtubeB112μlBufferMixfromtubeB20.5μlRNaseInhibitor（40U/μl）0.5μlRNaseInhibitor（40U/μl）2.0μlSMARTScribeReverseTranscriptase2.0μlSMARTScribeReverseTranscriptaseTotal20μlTotal20μl輕輕混勻后瞬時離心；6)置于PCR儀上，42℃，90min；70℃，10min；7)加入90μl的Tricine-EDTABuffer稀釋上述反應(yīng)產(chǎn)物RACEcDNA，分裝后-20℃保存。6.2基因特異引物的設(shè)計將簡并引物擴增獲得的中間片段序列輸入Genbank中，進行序列比對，選出含有纖維素酶基因保守序列的序列，按照SMARTer?RACE5’/3’Kit（Clontech公司）提供的引物設(shè)計說明，設(shè)計5’-RACE和3’RACE的基因特異引物GSPs和NGSPs。所述5’-RACE和3’RACE的基因特異引物GSPs和NGSPs名稱及對應(yīng)的序列如下表所示：引物名稱引物序列（5’-3’）GSP-BG12RGATTACGCCAAGCTTCCACAACGATTTCAGGGACACACAAGCGSP-BG11FGATTACGCCAAGCTTAGCTCGAATTGCACGGCTCTCTCCGSP-BG22RGATTACGCCAAGCTTGCCGATGCCTGGTGACTTGATTGCGSP-BG23FGATTACGCCAAGCTTTCAACGAACCGCTTACTTTCATGGGAGGNGSP-BG11RGATTACGCCAAGCTTGCCAGAACAATGCTGCTTGCTCACGNGSP-BG13FGATTACGCCAAGCTTGCTGAGGCAAATCCCAGTGGTACATCGNGSP-BG21RGATTACGCCAAGCTTCGATGCCCGCCAGGTTCACTTTATTGNGSP-BG22FGATTACGCCAAGCTTAATGTACGCTCACCCCATCTTCAGCACUPMLongTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTUPMShortCTAATACGACTCACTATAGGGC6.3RACEPCR用上述合成的cDNA作為RACEPCR的模板，采用SMARTer?RACE5’/3’Kit（Clontech公司）操作說明進行RACEPCR，具體步驟如下：1)在PCR管（C管）中加入以下體系(MasterMix)：組分使用量PCR-GradeH2O15.5μl2×SeqAmpBuffer25μlSeqAmpDNAPolymerase1μlTotal41.5μl輕輕混勻后瞬時離心，放置備用；2)在PCR管中加入以下體系(MixtureC)：5’-RACE3’-RACE2.5μl5’-RACEcDNA2.5μl3’-RACEcDNA10×UPMLong10×UPMLong5’GSP（10μM）3’GSP（10μM）41.5μlMasterMixfromtubeC41.5μlMasterMixfromtubeCTotal50μlTotal50μl3)將上述PCR反應(yīng)體系輕輕混勻瞬時離心后，進行PCR擴增。4)如果RACEPCR擴增產(chǎn)物沒有明顯條帶或產(chǎn)物出現(xiàn)彌散條帶，則要進行nestedPCR。a.取5μlRACEPCR擴增產(chǎn)物，用245μl的Tricine-EDTABuffer稀釋后備用；b.重復(fù)步驟1-3，其中，5μl稀釋后的RACEPCR擴增產(chǎn)物代替RACEcDNA，UPMShort代替UPMLong，NGSP代替GSP，PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：94℃變性30s，68℃退火30s，72℃延伸3min，循環(huán)20次。基因全長的拼接應(yīng)用軟件Lasergene中的Seqman程序?qū)啿CR獲取的中間片段，以及5’RACE和3’RACEPCR獲取的5’和3’末端進行拼接，最終獲取纖維素酶基因的cDNA全長序列，并登錄至NCBI數(shù)據(jù)庫中。生物信息學(xué)分析利用SingalP4.1在線軟件預(yù)測信號肽序列，用NetOGlyc分析N-連接糖基化位點，用Phyre2預(yù)測蛋白質(zhì)立體模型。從BLAST核酸數(shù)據(jù)庫中選取22條來自β-葡糖苷酶，利用MEGA5.1分析上述24條β-葡糖苷酶氨基酸序列和本研究1條β-葡糖苷酶，CfBG-Ib的氨基酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。基因的原核表達1原核表達載體的構(gòu)建1.1特異引物的設(shè)計根據(jù)克隆得到的β-葡糖苷酶基因CfBG-Ib的cDNA，選取基因的ORF作為原核表達的片段，設(shè)計特異性引物。同時根據(jù)選取的原核表達載體pET-32a(+)圖譜序列，在設(shè)計的特異性引物的5’端添加合適的酶切位點SacI和XhoI（下劃線標(biāo)示），以及保護堿基，引物名稱及序列如下：引物名稱引物序列（5’-3’）Ex-bgFCGAGCTCGTCATGTTAAGTGGAGCAGEx-bgRCCACTCGAGTCATAACGGAATCGTCGG1.2原核表達目的片段的PCR擴增、切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化以及測序分析1.3原核表達目的片段及原核表達載體pET-32a(+)的雙酶切反應(yīng)將經(jīng)測序正確的目的片段和pET-32a(+)空載體分別進行雙酶切反應(yīng)，以得到具有相同粘性末端的片段。雙酶切反應(yīng)體系如下：組分使用量目的基因片段/pET-32a(+)空載體xμlQuickCutSacI1μlQuickCutXhoI1μl10×QuickCutGreenBuffer5μldH2Oupto20μl輕輕混勻后瞬時離心，37℃保溫30min。雙酶切反應(yīng)完全后，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，然后切膠回收。連接及陽性重組質(zhì)粒的篩選將上述切膠回收的具有相同粘性末端的目的片段和pET-32a(+)載體連接，連接體系如下：組分使用量帶粘性末端目的基因片段10μl帶粘性末端的pET-32a(+)載體4μlT4DNALigase1μl10×T4DNA連接緩沖液2μldH2Oupto20μl輕輕混勻后瞬時離心，16℃連接過夜；再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，用菌液PCR及雙酶切反應(yīng)篩選陽性克隆，并測序，步驟參照2.2.1.3.6。將測序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達型菌株Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞中，并篩選陽性單克隆。重組蛋白的誘導(dǎo)表達及細菌總蛋白的提取誘導(dǎo)表達：1）吸取10μl測序驗證過的菌液至10mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中（含100μg/ml氨芐青霉素）37℃，250rpm搖菌過夜培養(yǎng)；2）吸取1mL過夜培養(yǎng)的菌液至100mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中（含100μg/ml氨芐青霉素），37℃，250rpm搖菌培養(yǎng)，至OD550為0.6左右；3）向上述菌液中加入IPTG至終濃度為1mM，23℃誘導(dǎo)表達16h；細菌總蛋白的提取：蛋白樣品的制備采用細菌蛋白抽提試劑盒提取，具體步驟如下：1）取lml菌液，在4℃，5000×g條件下離心10min，棄上清，收集菌體；2）按照每克菌體沉淀加入20mL細菌蛋白抽提試劑的比例，向菌體沉淀中加入抽提液，充分渦旋至菌體完全重懸；3）重懸后，室溫孵育10min；4）15000×g條件下離心5min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中，即為細菌總蛋白。電泳1）配制12%的分離膠，加入凝膠模具中，然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5cm的水層，使凝膠表面保持平整，靜置45min，待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個清晰的界面后，去除覆蓋在分離膠上的水層；2）配制5%的濃縮膠，加至分離膠上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端，將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡，待凝膠聚合后，小心拔掉梳子；3）取10μl蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水加熱變性5min，泠卻至室溫后，3000rpm的條件下離心30s，取適量上清加入SDS-PAGE凝膠加樣孔內(nèi)；4）接通電源，首先80V電壓電泳30min后，使蛋白樣品進入濃縮膠，再將電壓轉(zhuǎn)成120V恒壓電泳直至溴酚藍到達距離凝膠底端0.5-1cm處即可停止電泳。5）將電泳后的凝膠切除濃縮膠后，放入容器中，加入適量蒸餾水，加熱至沸騰后停止；6）棄去蒸餾水，加入適量ProteinShow-G250蛋白快速染色液，加熱至沸騰，繼續(xù)在脫色搖床上搖動5min；7）棄去染色液，加入適量蒸餾水，加熱至沸騰后停止，棄去蒸餾水，重復(fù)此步驟脫色至背景清晰；結(jié)果與分析1.白蟻總RNA的提取按照試劑盒TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit提取臺灣乳白蟻總RNA，微量分光光度計檢測OD260/OD280的值在1.8-2.2之間，達到了反轉(zhuǎn)錄的要求，用于第一鏈cDNA的合成。β-糖苷酶基因全長序列的克隆利用Multalin序列比對軟件，將得到的中間片段與已克隆得到的臺灣乳白蟻β-葡糖苷酶基因（GluA，GluB，GluC，GluD）進行核酸序列比對，發(fā)現(xiàn)存在顯著性差異核酸序列，該β-葡糖苷酶基因中間片段分別長817bp，分別命名為CfBG-Ib。3’RACE和5’RACEPCR（圖1）擴增CfBG-Ib的中間片段，得到臺灣乳白蟻β-葡糖苷酶基因完整的cDNA，這個cDNA全長由包括多聚腺苷酸尾巴（polyA）的1966個堿基組成。開放閱讀框（ORF）起始于第115個堿基，終止于第1806個堿基，長度為1692bp，編碼563個氨基酸。利用SingalP4.1軟件發(fā)現(xiàn)其中有一個預(yù)測的26個氨基酸的信號肽序列（圖2）。利用http://www.expasy.org/網(wǎng)站的在線工具預(yù)測該基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為64.02kDa，等電點為6.41。β-葡糖苷酶的序列分析根據(jù)蛋白序列，結(jié)合其它已知物種的β-葡糖苷酶三維結(jié)構(gòu)，推測CfBG-Ib三維結(jié)構(gòu)圖（圖3）。三維結(jié)構(gòu)圖顯示CfBG-Ib具有糖基水解酶家族1的典型結(jié)構(gòu)，8個（β/α）結(jié)構(gòu)圍成的桶狀結(jié)構(gòu)，2個催化活性中心：親核中心（nucleophilicresidue）Glu244和酸堿催化中心（acid/baseresidue）Glu453，2個順式肽鍵（cis-peptidebond）：Ala259-Pro260和Trp495-Ser496?；贐LAST搜索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）蛋白查找表明CfBG-Ib編碼蛋白屬于糖苷水解酶家族1（GHF1），同時存在相應(yīng)的催化位點和底物結(jié)合位點。同源性分析同樣顯示基因CfBG-Ib屬于GHF1家族。β-糖苷酶基因的原核表達1.重組原核表達載體pET-32a-CfBG-Ib的構(gòu)建經(jīng)過PCR擴增，回收目的片段及pET-32a空載體的雙酶切反應(yīng)，帶有相同粘性末端的目的片段及載體的連接，重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化等一系列反應(yīng)后，通過菌液PCR驗證，擴增的PCR片段大小符合預(yù)期的大小。測序結(jié)果顯示重組原核表達載體中的目的基因片段與CfBG-Ib基因ORF核酸序列一致，并且預(yù)測的蛋白序列也一致，沒有發(fā)生突變和讀碼框移碼的現(xiàn)象。因此，重組原核表達載體pET-32a-CfBG-Ib構(gòu)建成功，可以用于進一步的重組蛋白的誘導(dǎo)表達。重組原核表達載體pET-32a-CfBG-Ib的誘導(dǎo)表達轉(zhuǎn)化重組表達載體后的大腸桿菌Rosetta2(DE3)經(jīng)1mMIPTG誘導(dǎo)后，CfBG-Ibβ-葡萄糖苷酶基因?qū)崿F(xiàn)表達。10%SDS-PAGE電泳檢測，不同于轉(zhuǎn)化了空載體pET-32a的對照組細菌總蛋白，轉(zhuǎn)化了重組原核表達載體pET-32a-CfBG-Ib的細菌細胞總蛋白顯示出一條明顯的條帶，相對分子質(zhì)量約82kD的融合蛋白（圖4）。而預(yù)測的β-葡糖苷酶基因CfBG-Ib編碼蛋白的分子質(zhì)量為64.02kDa，是由于空載體pET-32a上帶有分子量約為18kD的Trx-tag、S-tag和His-tag三個融合表達標(biāo)簽。實施例2逆境脅迫下β-葡萄糖苷酶基因表達差異1溫度處理取臺灣乳白蟻工蟻設(shè)置4℃、27℃、38℃三個溫度梯度的溫度脅迫處理，于相對濕度75%人工氣候箱中培養(yǎng)24h。藥劑處理供試白蟻的饑餓處理：取直徑為150mm的玻璃培養(yǎng)皿，放入臺灣乳白蟻工蟻120頭，兵蟻10頭，放入溫度27℃，相對濕度75%的人工氣候箱中饑餓培養(yǎng)24h。吡蟲啉不同時間處理：取2×2cm的濾紙片，分別用60μL的丙酮和濃度為0.1mg/L的吡蟲啉浸濕，室溫下放置一天，使丙酮充分揮發(fā)。取直徑為90mm的玻璃培養(yǎng)皿，每組放入丙酮充分揮發(fā)后的濾紙2片，每組放入饑餓處理后白蟻，于溫度27℃，相對濕度75%的人工氣候箱中培養(yǎng)4d，每處理24h，取10頭工蟻提取RNA。熒光定量PCR3.1白蟻總RNA的提取提取各逆境脅迫處理組和對照的白蟻總RNA。第一鏈cDNA合成第一鏈cDNA的合成使用PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa），具體步驟如下：1）基因組DNA的去除在PCR管中加入以下體系（MixtureD）：組分使用量TotalRNAxμl5×gDNAEraserBuffer2μlgDNAEraser1μlRNasefreedH2Oupto10μlx根據(jù)所測TotalRNA的濃度計算，使用量在1μg以下。42℃反應(yīng)5min后，4℃保存?zhèn)溆谩?）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將以下試劑加入上述體系MixtureD中：組分使用量MixtureD10μl5×PrimeScriptBuffer4μlPrimeScriptRTEnzymeMixI1μlRTPrimerMix1μlRNasefreedH2Oupto20μl緩慢搖勻，37℃下反應(yīng)15min后，85℃終止反應(yīng)5s。反應(yīng)產(chǎn)物即第一鏈cDNA，短時離心后存放于-20℃下，用于qPCR反應(yīng)。稀釋度的確定有效的定量PCR結(jié)果其進入平臺期的Ct值最好在15-30之間。采用序列稀釋方法稀釋cDNA，以便其Ct值落在15-30之間。稀釋的濃度梯度為1，1/10，1/100，1/1000，1/10000，五個濃度梯度。定量PCR引物的設(shè)計通過上述脅迫處理，用熒光定量PCR檢測克隆得到的基因CfBG-Ib的差異性表達情況，同時參照已發(fā)表的臺灣乳白蟻β-葡萄糖苷酶基因Glu1B表達情況比較分析。用于熒光定量PCR檢測的特異性引物和內(nèi)參引物如下：引物名稱擴增基因引物序列（5’-3’）qPCR-BGFCfBG-IbGCCTTTCCTCTGCATTCACTGqPCR-BGRCfBG-IbCCTCAGCCCCTTCAAGACATTqPCR–Glu1B-FGlu1BTTGCCTCGTCGTCTTTGTGAqPCR–Glu1B-RGlu1BCCTTTCCATCCGCATCCCAT18S-F18SCGAGATTGAGCAATAACAGGTC18S-R18SACGTAATCAACGCGAGCTTATG3.5定量PCR反應(yīng)1）在PCR管中加入以下體系（冰上操作）：組分使用量cDNA1μlSYBRPremixExTaqTM(2×)10μlPCRForwardPrimer(10μM)0.5μlPCRReversePrimer(10μM)0.5μlRNasefreedH2Oupto20μl2）應(yīng)用StratageneMx3000P運行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序如下：95℃，30s，1個循環(huán)；95℃，10s，55℃，10s，72℃，20s，40個循環(huán)。在每個循環(huán)的延伸階段收集熒光信號，進行實時監(jiān)測。3）反應(yīng)結(jié)束后，先加熱到95℃1min，每升高1℃，記錄一次熒光信號，得出擴增產(chǎn)物的溶解曲線。熒光定量PCR的數(shù)據(jù)分析反應(yīng)結(jié)束后，確認擴增曲線和溶解曲線，采用2-△△Ct的方法進行目的基因的相對表達量分析。結(jié)果與分析1溫度脅迫下臺灣乳白蟻β-葡萄糖苷酶基因差異性表達結(jié)果提取溫度脅迫處理組和對照組的臺灣乳白蟻的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，作為模板進行熒光定量PCR。以18S基因為內(nèi)參基因，檢測β-葡萄糖苷酶基因CfBG-Ib和Glu1B在不同溫度脅迫下的表達情況。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示（圖5~6），溫度脅迫處理，β-葡萄糖苷酶的三個基因CfBG-Ib和Glu1B的相對表達量趨勢一致。在低溫和高溫脅迫下，基因CfBG-Ib的相對表達量不存在顯著差異。吡蟲啉脅迫下臺灣乳白蟻β-葡萄糖苷酶基因差異性表達結(jié)果提取吡蟲啉脅迫處理組和對照組的臺灣乳白蟻的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，作為模板進行熒光定量PCR。以18S基因為內(nèi)參基因，檢測β-葡萄糖苷酶基因CfBG-Ib和Glu1B在吡蟲啉脅迫下的表達情況。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示（圖7~8），吡蟲啉脅迫處理β-葡萄糖苷酶的三個基因CfBG-Ib和Glu1B的相對表達量趨勢基本一致。前3天，三個基因的相對表達量與對照組下的相對表達量相差不大，處理的第4天，三個基因的相對表達量均明顯高于對照組的相對表達量。SEQIDNO:1GAATTAGTTGAAGTTGGCGTCATATTTGACAAGTTTACAACTTGACGGCTTCCCATGGCGACTGGATAGGACGCAGATTGTGTAAGATTGAGAATATCACCGGCAACTCAAGTCATGTTAAGTGGAGCAGGTGCTTGGAGATGTTTCTTACTTTCAGTACTGTTGCTGAATTTATCAGCTACTGCCAGCGGTCGCCTTATTTCTAATATTTTGAATCCCATTTTAAGTAGTCTCGGCCTAAACTCCCAAAGTACCAAGAACACTGTTGCCCCTTCCCAATATAATGTTGTTACTACTCCCAAGAACACTGTTGCCCCTTCCCAAAGTAACACCGATCCTACCAAGAAGAACTTCACTTTTCCCGAAGACTTCTACTTTGCAGCTGCAACGGCGGCTTACCAAGCCGAAGGAGGTTGGAACGCAGACGGGAAAGGTCCTAATATCTGGGACACACTGACACACAACCATCCAGACTACATATCCGACTTCTCGAATGGTGACGTAGCAGCGGACTCCTACCACAAGTACACTGAAGACATCAAATTACTCAAGGACATTGGGGTGCAGTTTTACAGATTTTCCATATCCTGGTCACGGATACTTCCTAAGGGAAGTGTGGCAGCCATTAATCAGGCTGGTGTCGACTACTATAACAACATCATTAATGGTCTGCTAGCCGTCGGAATTCAGCCCATGGTTACGATGTACCACTGGGATTTGCCTCAGCCCCTTCAAGACATTGGAGGATGGGCCAATGATTCCATAGCCGATTTCTTCAAGGACTACGCCAGGCTTCTATATAGATTTTTCGGCGATAGAGTGAAATGGTGGATACCAATAAATGAGCCTTTCATGATAGCTAACGGATACAGTGAATGCAGAGGAAAGGCGCCGTCCCTCTGCCAGCCTGGGACGGCAGATTACCTGGCAGCCAGAACAATGCTGCTTGCTCACGCAAAAGCCTATCACGTCTACCACAACGATTTCAGGGACACACAAGCAGGTAAAGTGAGCACCTCGTTTAGCATCGACTGGCACGAACCGCGCACCAACAGTACGGCAGATATTTTAGCAGCGGAGAGAGCCGTGCAATTCGAGCTAGGGATGTTCGCTCATCCCATCTACAGTACCTCGGGGGACTATCCACCGGAAGTAAGAGCCAGAGTCGATAACAACAGCAGAGCTGAGGGCTACAATACTTCCCGCCTGCCGAAATTCACCCAAGAGGAGATAGATTACATTAAAGGGACGTGGGACTTCTTCGCATTAAATCATTACACAACTTATTGGGCCCAGGATGGACTGCAAGGGCCGGACCCTTCCCGACAGCGCGATTCGGGTGTCATGAAATCGCAAGACCCCAGCTGTCCTGAGACCAGCTCTCCGTGGTTTAGGGTTGTTCCCTGGGGATTCAGGAAGATACTGCGTTGGGTGAAGAAAGAATACAACAATCCCCCAATATTCATCACAGAGTCCGGTTACTCTGACGATGGTCGTCTCCAGGATACGGGACGGATTAAGTATTACGTAGACTACATCCGTGAGCTGCTGAAGGCAAAATACGAAGATGGATGTCAAATAATTGGCTACACTGCTTGGAGTCTAATTGACAATTTTCAATGGGAAGAAGGCTATGAGAGTAAGTTTGGGCTGGTCTACGTCAACTTCAGTGACCCTGCAAGAACTCGGATCATCAAGCAGTCAGCAAGGTTGTACAGCGAGATCATCCGCACAAGAAAAGTTCCGGACCGCTACCCGCAGTACAGCTATGACACGCAGGAATGTCACCCGACGATTCCGTTATGAAAGCTATATGAATCATAGTTCCTCACTATCGATGTTTACGAAAGAGCGCGTGCCTATGGAATTACGATGGGGAAGAATTTTTCTATTGCGTGTAAACGATTCAGACTATTAAGTGTATTATGAGAACAGAAAAATCATGAAAATATCGAAAAAAAAAAAASEQIDNO:2MLSGAGAWRCFLLSVLLLNLSATASGRLISNILNPILSSLGLNSQSTKNTVAPSQYNVVTTPKNTVAPSQSNTDPTKKNFTFPEDFYFAAATAAYQAEGGWNADGKGPNIWDTLTHNHPDYISDFSNGDVAADSYHKYTEDIKLLKDIGVQFYRFSISWSRILPKGSVAAINQAGVDYYNNIINGLLAVGIQPMVTMYHWDLPQPLQDIGGWANDSIADFFKDYARLLYRFFGDRVKWWIPINEPFMIANGYSECRGKAPSLCQPGTADYLAARTMLLAHAKAYHVYHNDFRDTQAGKVSTSFSIDWHEPRTNSTADILAAERAVQFELGMFAHPIYSTSGDYPPEVRARVDNNSRAEGYNTSRLPKFTQEEIDYIKGTWDFFALNHYTTYWAQDGLQGPDPSRQRDSGVMKSQDPSCPETSSPWFRVVPWGFRKILRWVKKEYNNPPIFITESGYSDDGRLQDTGRIKYYVDYIRELLKAKYEDGCQIIGYTAWSLIDNFQWEEGYESKFGLVYVNFSDPARTRIIKQSARLYSEIIRTRKVPDRYPQYSYDTQECHPTIPL當(dāng)前第1頁1 2 3