一種耐熱β-葡萄糖苷酶及其突變體在制備牛蒡子苷元中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體說涉及一種耐熱0-葡萄糖苷酶突變體N223T、 G224F和N223T/G224F，以及該酶及其突變體在牛蒡苷轉(zhuǎn)化為牛蒡子苷元中的應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 牛蒡子苷元是一種中草藥，具有治療或預(yù)防慢性腎功能衰竭及腎纖維化、抗病毒、 抗腫瘤等功效，在自然界存在于牛蒡子中，多以葡萄糖苷型的牛蒡苷存在，含量是苷元含量 的4-5倍。研宄發(fā)現(xiàn)，糖苷形式的牛蒡子苷不具有最佳的生理活性狀態(tài)，須在葡萄糖 苷酶的作用下轉(zhuǎn)化成甙元形式的牛蒡子苷元才能被吸收而發(fā)揮藥效。因此，若將牛蒡子苷 轉(zhuǎn)化成牛蒡子苷元，會大大提高牛蒡子苷元生產(chǎn)得率，提高其生物利用率，降低成本。目 前制備牛蒡子苷元的方法主要有：酸、堿水解方法和酶水解法。由于酸堿的應(yīng)用存在對甙 元破壞性大，污染大，目的性差等缺點(diǎn)，因此，酶水解法以其具有高效、安全、生態(tài)和環(huán)保等 特點(diǎn)是牛蒡子苷元制備的理想途徑。歐志敏等報(bào)道了采用葡萄糖苷酶水解牛蒡子苷 制備牛蒡子苷元的最佳水解反應(yīng)條件為35°C，pH5. 0, 40h，轉(zhuǎn)化率達(dá)80%以上（藥物生物 技術(shù)，2009, 16 (5): 443-446);采用黑曲霉CGMCCNo. 2594發(fā)酵產(chǎn)生的葡萄糖苷酶酶液 水解牛蒡子苷制備牛蒡子苷元的最佳水解反應(yīng)條件為pH值為6. 0、30°C、36h，牛蒡子苷元 的產(chǎn)率達(dá)到94.7% (浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009, 37(6) :629-633);FengLiu等人報(bào)道酶法 水解牛蒡子苷制備牛蒡子苷元的最佳水解反應(yīng)條件為40°C，pH5. 0, 24h，其收率達(dá)89. 6% (J.S印.Sci.，2014, 37:376 - 381);王秀伶等人公開了一種底物牛蒡苷元粗品與布勞特菌 AUH-JLD56共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化為3'-去甲基-牛蒡苷元方法（CN103509741B);陳潔等人公開了 一種微生物聯(lián)合發(fā)酵進(jìn)行牛蒡子中牛蒡苷轉(zhuǎn)化為牛蒡子苷的方法（CN103233056B);蔡寶 昌等人公開了一種直接利用乙酸乙酯滲漉提取牛蒡子中牛蒡苷的成分，調(diào)pH于3. 0-4. 0間 使牛蒡苷直接水解為牛蒡苷元粗品，然后經(jīng)反相高效制備液相色譜法純化得到高純度生產(chǎn) (CN103145655A)。盡管已有較多相關(guān)論文發(fā)表和專利申請，但是仍未能很好解決轉(zhuǎn)化時(shí)間 長，酶作用底物特異性不高，收率低以及成本高的問題。
[0003] 酶的熱穩(wěn)定性直接關(guān)系到酶的使用壽命，從而決定酶的應(yīng)用效率和酶的價(jià)值。極 端嗜熱袍菌屬Thermotoga所產(chǎn)的0-葡萄糖苷酶（Tm-BglA)屬于水解酶家族1，在95°C下 保溫6h仍保留60%活性，具有極高的耐熱性，其在生物轉(zhuǎn)化中具有減少污染危險(xiǎn)、加快反 應(yīng)速度、提高酶作用底物溶解度和較高的抗化學(xué)變性等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)高底物濃度的熱 水抽提與酶水解并存的生物轉(zhuǎn)化工藝，極具工業(yè)應(yīng)用潛力。但是野生型Tm-BglA水解作用 的底物范圍廣，包括纖維二糖、乳糖、水楊苷、熊果苷、烷基糖苷、對硝基苯酚-D-葡萄糖 苷和對硝基苯酚-0 -D-果糖苷、對硝基苯酚--D-半糖乳糖苷、黃豆苷、染料木苷、丙二酰 黃豆苷、丙二酰染料木苷、昆布二糖和槐糖，若能提高Tm-BglA對蒡苷轉(zhuǎn)化為牛蒡子苷元的 底物特異性，將會大大提高牛蒡苷的轉(zhuǎn)化效率，降低反應(yīng)副產(chǎn)物，進(jìn)而提高牛蒡子苷元的產(chǎn) 量與純度，降低生產(chǎn)成本。
[0004] 科學(xué)研宄表明：游離形式的牛蒡子苷元水溶性最差，基本不溶于水，而葡萄糖苷型 的牛蒡苷易溶于熱水，在60-95°C時(shí)其溶解度隨著溫度的升高而顯著增加，因此。本發(fā)明針 對此特性，將耐熱0 _葡萄糖苷酶用于牛蒡苷原料的熱抽提取工藝中，進(jìn)行邊抽提邊轉(zhuǎn)化， 使得牛蒡苷一旦從固相原料中溶出即被去糖基進(jìn)而轉(zhuǎn)化為牛蒡子苷元，這樣用乙醇直接提 取離心所得沉淀即可得到牛蒡子苷元。由于耐高溫葡萄糖苷酶穩(wěn)定性高，所得殘液中 酶殘余活性和有效成分可回用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明通過對極端嗜熱袍菌屬（Thermotiga)的家族1的|3-葡萄糖苷酶Tm-BglA 與纖維四糖進(jìn)行分子對接，以及Tm-BglA的苷元結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測，選擇位于Tm-BglA蛋白結(jié)構(gòu) 中第五折疊股上的兩個(gè)氨基酸（N223和G224)進(jìn)行單突變和雙突變，分別將位于223 位和224位上的天冬酰胺（N)和甘氨酸（G)分別替換成蘇氨酸（T)和苯丙氨酸（F)，獲得突 變基因，然后插入表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化宿主獲得重組工程菌，令其表達(dá)，獲得0 _葡萄糖苷酶突 變體N223T、G224F和N223T/G224F，進(jìn)一步將這些耐熱0 -葡萄糖苷酶及其突變體水解牛 蒡苷后，酶解產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜檢測分析發(fā)現(xiàn)：水解10_20min后突變酶N223T和G224F 對牛蒡苷轉(zhuǎn)化為牛蒡子苷元的效率分別提高了 12%和12. 6% ; 0 -葡萄糖苷酶及其突變體 N223T和G224F轉(zhuǎn)化牛蒡苷轉(zhuǎn)化為牛蒡子苷元中單位每小時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)95-98%。
[0006] 本發(fā)明公開了耐熱葡萄糖苷酶及其突變體在牛蒡苷轉(zhuǎn)化為牛蒡子苷元中 的應(yīng)用，所述的耐熱13 -葡萄糖苷酶是指來源熱袍菌屬Thermotiga的糖苷水解酶家族 1 0 -葡萄糖苷酶TbglA;耐熱0 -葡萄糖苷酶突變體是N223T、G224F和N223T/G224F，氨基 酸序列如SEQ:IDN0. 1、IDN0. 2 和IDN0. 3 所示。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種制備牛蒡子苷元的方法，是利用上述耐熱葡萄糖苷酶及 其突變體水解牛蒡苷底物制得牛蒡子苷元。
[0008] 具體的方法是：向牛蒡苷底物中加入pH為4. 2-7. 5的磷酸鈉-檸檬酸緩沖溶液， 料液比為1:2-10 (g/mL)。;加入0 -葡萄糖苷酶及其突變體，其添加量為100-1000U/g底物， 混合均勻后于60-95°C下低速攪拌反應(yīng)5-90min，取反應(yīng)液于4-10°C和4000rpm-8000rpm下 離心10-20min，取沉淀物備用，上清液用作下批提取的配料用水；向沉淀物中加入3-10倍 體積且濃度為75 % -100 %乙醇進(jìn)行邊攪拌邊提取，然后抽濾去渣，濾液進(jìn)一步經(jīng)真空濃縮 得到所述牛蒡子苷元產(chǎn)品。
[0009] 本發(fā)明通過定點(diǎn)突變獲得高活性水解牛蒡苷制備牛蒡子苷元的葡萄糖苷酶 的突變體N223T、G224F和N223T/G224F，并對其進(jìn)行高效表達(dá)，進(jìn)一步經(jīng)破細(xì)胞、熱處理和 離心分離所得到的0 _葡萄糖苷酶及突變體的粗酶液對牛蒡苷水解獲得組分單一的牛蒡 子苷元產(chǎn)物，這不僅排除了供體菌共生的其他一系列酶系的干擾，而且相對其野生型酶，水 解牛蒡苷的活性分別得到顯著提高，具有轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化時(shí)間短且反應(yīng)副產(chǎn)物少，產(chǎn)物分 離和純化容易，得到的牛蒡子苷元產(chǎn)物量大且純度高等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0010] 圖1純化0-葡萄糖苷酶及突變體N223T、G224F和N223T/G224F的SDS-PAGE圖 譜? 1:野生型Tm-BglA，2 :N223T，3 :G224T，4 :N223T/G224F
[0011] 圖2Tm-BglA及突變體N223T和G224F對牛蒡苷轉(zhuǎn)化為牛蒡子苷元的水解進(jìn)程 (在 80°C和pH6. 2 下反應(yīng) 2min、5min、10min、20min、60min)
[0012] 圖3 Tm-BglA(B:野生型）及突變體N223T(C)和G224F(D)轉(zhuǎn)化牛蒡苷制備牛蒡 子苷元產(chǎn)品的HPLC圖譜（在80°C和pH 6. 2下反應(yīng)30min，A :未加酶）.色譜條件：儀器： Agilent HPLC-1100型高效液相色譜儀；色譜柱：Agilent Z0RBAX-C18(4.6X150mm，5ym); 檢測器：UV detector ;檢測波長：280nm ;柱溫：30°C ;流速：1. OmL/min ;流動相：A相為乙 腈，B相為水。進(jìn)樣量為10yL。以保留時(shí)間定性，以峰面積定量，以外標(biāo)法計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)樣品 牛蒡子苷購于阿拉丁（上海）試劑有限公司，牛蒡子苷元購于上海源葉生物科技有限公司。 其中，保留時(shí)間7. 3min為牛蒡子苷，保留時(shí)間11. 3min為牛蒡子苷元。
[0013] 梯度程序：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 耐熱e-葡萄糖苷酶及其突變體在牛蒡苷轉(zhuǎn)化為牛蒡子苷元中的應(yīng)用，其特征在于 所述的耐熱0 -葡萄糖苷酶是指來源熱袍菌屬Thermotiga的糖苷水解酶家族113 -葡萄 糖苷酶TbglA;耐熱0 -葡萄糖苷酶突變體是N223T、G224F和N223T/G224F，氨基酸序列如 SEQ:IDNO. 1、IDNO. 2 和IDNO. 3 所示。
2. -種制備牛蒡子苷元的方法，其特征在于，以牛蒡苷為底物，在耐熱0 _葡萄糖苷酶 及其突變體的作用下通過酶解法制得牛蒡子苷元；所述的耐熱葡萄糖苷酶是指來源熱 袍菌屬Thermotiga的糖苷水解酶家族1 0 -葡萄糖苷酶TbglA;耐熱0 -葡萄糖苷酶突變 體是吧231\6224?和吧231/6224?，氨基酸序列如5￡0:1〇勵(lì).1、1〇勵(lì).2和1〇勵(lì).3所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，向牛蒡苷底物中加入pH為4. 2-7. 5的磷酸 鈉-檸檬酸緩沖溶液，料液比為1:2-10g/mL;加入0 -葡萄糖苷酶及其突變體，其添加量為 100-1000U/g底物，混合均勻后于60-95°C下低速攪拌反應(yīng)5-90min，取反應(yīng)液于4-10°C和 4000rpm-8000rpm下離心10-20min，取沉淀物備用，上清液用作下批提取的配料用水；向沉 淀物中加入3-10倍體積且濃度為75 % -100 %乙醇進(jìn)行邊攪拌邊提取，然后抽濾去渣，濾液 進(jìn)一步經(jīng)真空濃縮得到所述牛蒡子苷元產(chǎn)品。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種耐熱β-葡萄糖苷酶的突變體N223T、G224F和N223T/G224F在牛蒡苷轉(zhuǎn)化為牛蒡子苷元中的應(yīng)用。所述耐熱β-葡萄糖苷酶的突變體N223T、G224F和N223T/G224F，氨基酸序列如SEQ：ID NO.1、ID NO.2和ID NO.3所示；利用本發(fā)明的耐熱β-葡萄糖苷酶及其突變體水解牛蒡苷制備牛蒡子苷元，相對其野生型酶，具有轉(zhuǎn)化效率高，反應(yīng)副產(chǎn)物少，產(chǎn)量和純度高，分離純化容易、化學(xué)污染少等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C12P17-04, C12N9-42
【公開號】CN104818261
【申請?zhí)枴緾N201510203453
【發(fā)明人】薛業(yè)敏, 候靜靜
【申請人】南京師范大學(xué)
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年4月24日