本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及玉米母本單倍體主效誘導(dǎo)基因及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

玉米是世界上第一大作物，具有食用、飼用和工業(yè)加工等多方面用途。玉米的增產(chǎn)對(duì)于供應(yīng)當(dāng)前食用、飼用和工業(yè)加工需求具有十分重要的意義。在當(dāng)前耕地面積逐漸減少的情況下，培育高產(chǎn)、多抗和廣適的玉米雜交種是關(guān)鍵。玉米雜交種的育成依賴于優(yōu)良自交系的選育。傳統(tǒng)選育自交系的方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，常常需通過(guò)7代以上方能育成一個(gè)穩(wěn)定的自交系。近年來(lái)，單倍體育種技術(shù)具有育種周期短、效率高、易于結(jié)合分子標(biāo)記輔助育種方法等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)逐漸成為選育玉米自交系的主要技術(shù)。目前，玉米中單倍體主要來(lái)源于玉米孤雌生殖誘導(dǎo)系的誘導(dǎo)，即Stock6或其衍生的誘導(dǎo)系作為父本，與其他材料雜交后產(chǎn)生的。由于大多數(shù)誘導(dǎo)系導(dǎo)入了R1-nj標(biāo)記，因而可以使用胚和胚乳顏色標(biāo)記進(jìn)行玉米單倍體的鑒別。因而大大提高了玉米單倍體育種的效率。

由于誘導(dǎo)系通過(guò)生產(chǎn)孤雌生殖而產(chǎn)生母本單倍體的方法具有廣泛的應(yīng)用前景和價(jià)值，因此，全球多家科研單位對(duì)于Stock6及其衍生系誘導(dǎo)產(chǎn)生母本單倍體的遺傳基礎(chǔ)和生物學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行了大量的研究。結(jié)果表明，玉米孤雌生殖誘導(dǎo)能夠產(chǎn)生玉米單倍體這一性狀是可遺傳的，并受到多個(gè)遺傳位點(diǎn)的控制。(1999)等檢測(cè)到2個(gè)控制誘導(dǎo)率性狀的遺傳位點(diǎn)，分別位于1號(hào)染色體和2號(hào)染色體。能夠解釋約17％的表型變異。Barrant等(2008)也檢測(cè)到位于1號(hào)染色體的遺傳位點(diǎn)，驗(yàn)證了前人研究的結(jié)果。Prigge等(2012)利用多個(gè)群體進(jìn)行全基因組掃描，共發(fā)現(xiàn)8個(gè)控制誘導(dǎo)率的遺傳位點(diǎn)，其中包括位于1號(hào)染色體1.04bin的主效遺傳位點(diǎn)，并命名為qhir1。因此，位于qhir1是多個(gè)控制單倍體誘導(dǎo)率相關(guān)QTL中的效應(yīng)最大、功能最為重要的QTL。董昕等(2014)對(duì)qhir1進(jìn)行了精細(xì)定位，并成功將定位區(qū)間縮小至243Kb的范圍。研究qhir1的候選基因?qū)τ谛滦驼T導(dǎo)系的選育及孤雌生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的遺傳學(xué)及生物學(xué)機(jī)理尤為重要，鑒于目前育種行業(yè)中單倍體育種技術(shù)利用的廣泛性，該發(fā)明具有十分廣泛的應(yīng)用空間和市場(chǎng)前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供玉米母本單倍體主效誘導(dǎo)基因，ZmPLA突變基因。

本發(fā)明提供的ZmPLA突變基因，其核苷酸序列為將野生ZmPLA基因核苷酸序列上進(jìn)行插入或/和缺失或/和替換突變，得到序列；

所述野生ZmPLA基因核苷酸序列為序列1。

上述基因中，所述ZmPLA突變基因的核苷酸序列為如下1)-4)中任一種(下面對(duì)應(yīng)實(shí)施例中的ZmPLA突變基因ZmHIR1-1、ZmHIR1-2、ZmHIR1-3、ZmHIR1-Stock6)：

1)為野生ZmPLA基因核苷酸序列第280位和281位之間插入T堿基，其他堿基不變，得到的序列；

2)為野生ZmPLA基因核苷酸序列第271位-281位堿基缺失，其他堿基不變，得到的序列；

3)為野生ZmPLA基因核苷酸序列第281位堿基G缺失，其他堿基不變，得到的序列；

4)為野生ZmPLA基因核苷酸序列第1569位后插入CGAG，且第409位的C突變?yōu)門(mén)、第421位的C突變?yōu)镚，第441位的T突變?yōu)镃，第887位的T突變?yōu)镚，第1210位的G突變?yōu)镃，第1306位的T突變?yōu)镃，第1435位的G突變?yōu)锳，第1471位的C突變?yōu)锳，第1541位的A突變?yōu)镃，第1588位的T突變?yōu)镃，第1591位的C突變?yōu)锳，得到的序列所示的DNA分子。第1687位堿基A突變?yōu)镃，第1691位堿基G突變?yōu)锳，第1706位堿基T突變?yōu)镃，第1708位堿基G突變?yōu)镃，第45-46堿基位缺失兩個(gè)堿基TA，第65-67為堿基由TCG替換為CAA，第67-68堿基位之間插入兩個(gè)堿基TC，第80-81位堿基由TT替換為CG，499-503位堿基GTAC缺失，524位堿基C突變?yōu)镚，530位堿基G突變?yōu)門(mén)，553-560位堿基GCATGCAT缺失，第806-809位堿基GTAC缺失，第1741位堿基G突變?yōu)锳，第1781位堿基C突變?yōu)門(mén)，第1787位堿基A突變?yōu)門(mén)，其他堿基不變，得到的序列。

上述的突變基因或所述野生ZmPLA基因核苷酸序列在誘導(dǎo)產(chǎn)生玉米或其他植物單倍體或在雙單倍體系(Double Haploid，DH)育種中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

沉默或抑制目的植物基因組中ZmPLA基因的表達(dá)或敲除ZmPLA基因在生產(chǎn)植物單倍體中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或，沉默或抑制目的植物基因組中ZmPLA基因的表達(dá)或敲除ZmPLA基因的物質(zhì)在生產(chǎn)植物母本單倍體中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述應(yīng)用為，沉默或抑制或敲除目的植物基因組中ZmPLA基因的表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植物，再將所述轉(zhuǎn)基因植物用于雜交或自交，得到母本單倍體。

上述應(yīng)用中，所述沉默或抑制目的植物基因組中ZmPLA基因的表達(dá)或敲除ZmPLA基因?yàn)槭鼓康闹参锘蚪M中ZmPLA基因表達(dá)量降低或發(fā)生缺失或插入突變；

上述應(yīng)用中，所述使目的植物基因組中ZmPLA基因發(fā)生缺失或插入突變?yōu)樗鍪鼓康闹参锘蚪M中ZmPLA基因第一外顯子和/或第二外顯子和/或第三外顯子和/或第四外顯子發(fā)生缺失或插入突變；

或所述使目的植物基因組中ZmPLA基因發(fā)生缺失或插入突變的方式為CRISPER/Cas9和/或TELLEN技術(shù)和/或T-DNA插入和/或EMS誘變。

上述應(yīng)用中，所述使目的植物基因組中ZmPLA基因第一外顯子發(fā)生缺失或插入突變的方式為CRISPER/Cas9；

或所述沉默或抑制目的植物基因組中ZmPLA基因的表達(dá)或敲除ZmPLA基因的物質(zhì)為使目的植物基因組中ZmPLA基因第一外顯子發(fā)生缺失或插入突變的物質(zhì)；

所述使目的植物基因組中ZmPLA基因第一外顯子發(fā)生缺失或插入突變的物質(zhì)為CRISPER/Cas9系統(tǒng)；

所述CRISPER/Cas9系統(tǒng)的靶序列為序列3所示的第1外顯子中第264-286位堿基；

所述CRISPER/Cas9系統(tǒng)的sgRNA序列為序列4。

沉默或抑制目的植物基因組中ZmPLA基因的表達(dá)或敲除ZmPLA基因在雙單倍體系(Double Haploid，DH)選育或基于DH系的雜交種選育中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

或沉默或抑制目的植物基因組中ZmPLA基因的表達(dá)或敲除ZmPLA基因的物質(zhì)在雙單倍體系(Double Haploid，DH)選育或基于DH系的雜交種選育中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述目的植物為玉米或其他植物。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供沉默或抑制目的植物基因組中ZmPLA基因的表達(dá)或敲除ZmPLA基因的物質(zhì)。

本發(fā)明提供的物質(zhì)，包括CRISPER/Cas9系統(tǒng)，所述CRISPER/Cas9系統(tǒng)的靶序列為序列3所示的第1外顯子中第264-286位堿基。

上述物質(zhì)中，所述CRISPER/Cas9系統(tǒng)的sgRNA序列為序列4。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：通過(guò)候選基因預(yù)測(cè)，在qhir1區(qū)間內(nèi)獲得了一個(gè)編碼磷脂酶基因(PLA)命名為ZmPLA，基因通過(guò)CRISPER/Cas9定點(diǎn)突變技術(shù)和轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)，成功獲得了目的基因的突變體材料，利用雜合基因型突變體和純合基因型突變體對(duì)其他玉米材料雜交，驗(yàn)證了ZmPLA突變后的材料作為父本能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生母本單倍體的功能，將序列突變后沒(méi)有功能的ZmPLA基因命名為ZmHIR1。所述基因ZmPLA人工定點(diǎn)突變采用了CRISPER/Cas9定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)ZmPLA基因的第一外顯子加以修飾，使得第一外顯子的堿基發(fā)生替換、缺失和/或插入而得到。CRISPER/Cas9修飾時(shí)修飾靶點(diǎn)設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為20bp，位于ZmPLA第1外顯子中第264-286位堿基，靶位點(diǎn)序列為：GCTGCAGGAGCTGGACGGACCGG。

所述CRISPER/Cas9定點(diǎn)突變技術(shù)在靶位點(diǎn)體產(chǎn)生的ZmPLA人工定點(diǎn)突變體，其特征在于，所述CRISPER/Cas9基因修飾技術(shù)在修飾靶位點(diǎn)造成280-281位堿基位之間1bpT堿基插入，得到ZmPLA基因突變體，插入堿基后的第一外顯子序列，插入堿基后的基因命名為ZmHIR1-1，該突變體后代中能夠產(chǎn)生約1％～2％玉米母本單倍體

所述CRISPER/Cas9定點(diǎn)突變技術(shù)在靶位點(diǎn)體產(chǎn)生的ZmPLA人工定點(diǎn)突變體，其特征在于，所述CRISPER/Cas9基因修飾技術(shù)在修飾靶位點(diǎn)造成271-281位堿基位之間缺失GAGCTGGACGG，得到ZmPLA基因突變體，缺失堿基后的第一外顯子序列，缺失堿基后的基因命名為ZmHIR1-2，該突變體后代中能夠產(chǎn)生約1％～2％玉米母本單倍體

所述CRISPER/Cas9定點(diǎn)突變技術(shù)在靶位點(diǎn)體產(chǎn)生的ZmPLA人工定點(diǎn)突變體，其特征在于，所述CRISPER/Cas9基因修飾技術(shù)在修飾靶位點(diǎn)造成第281位堿基G缺失，得到ZmPLA基因突變體，缺失堿基后的第一外顯子序列，缺失堿基后的基因命名為ZmHIR1-3，該突變體后代中能夠產(chǎn)生約1％～2％玉米母本單倍體

本發(fā)明還提供了一種已知玉米母本單倍體誘導(dǎo)系Stock6的突變基因序列，并將其命名為ZmHIR1-Stock6，其特征ZmHIR1-Stock6導(dǎo)致自交或作為父本與其他材料雜交的后代出現(xiàn)單倍體。該序列是本發(fā)明經(jīng)過(guò)候選基因預(yù)測(cè)和測(cè)序獲得，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)證明了該基因的功能喪失導(dǎo)致了玉米母本單倍體的產(chǎn)生。

本發(fā)明還提供所述所述基因ZmPLA的人工定點(diǎn)突變體在玉米單倍體育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明的基本原理如下：針對(duì)候選基因ZmPLA，在基因的第一個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)序列，通過(guò)CRISPER/Cas9定點(diǎn)突變的方法，將ZmPLA基因的第一個(gè)外顯子進(jìn)行突變篩選，獲得ZmPLA基因功能缺失的轉(zhuǎn)基因突變體。將成功突變的單株進(jìn)行自交后，獲得的T1代種子，再種植，并以T1代植株純合突變體和雜合突變體的花粉對(duì)兩個(gè)玉米雜交種鄭單958和京科968雜交，獲得后代。將該雜交后代種于田間，根據(jù)后代單株田間的長(zhǎng)勢(shì)、分子標(biāo)記及流式細(xì)胞倍性鑒定等方法驗(yàn)證其中是否出現(xiàn)母本單倍體。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，ZmPLA的突變能夠?qū)е掠衩啄副締伪扼w的產(chǎn)生，對(duì)于揭示玉米母本單倍體產(chǎn)生的遺傳學(xué)和生物學(xué)機(jī)理奠定了重要的基礎(chǔ)。同時(shí)，利用本實(shí)驗(yàn)或本方法所獲得的突變單株，具有玉米母本的單倍體誘導(dǎo)能力，對(duì)于選育新型的誘導(dǎo)系，進(jìn)一步提高誘導(dǎo)率，以及提高玉米單倍體育種效率方面具有重要的意義。

附圖說(shuō)明

圖1為ZmPLA基因結(jié)構(gòu)示意圖及利用Crisper/Cas9技術(shù)的靶位點(diǎn)的設(shè)定。

圖2為利用PCR和Sanger測(cè)序檢測(cè)CRISPER介導(dǎo)的ZmPLA基因定點(diǎn)突變及測(cè)序結(jié)果。

圖3為ZmPLA在與雜交種鄭單958、京科968雜交后，出現(xiàn)的單倍體照片。

圖4為田間單倍體葉片倍性鑒定結(jié)果。

圖5為田間單倍體分子標(biāo)記鑒定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、誘導(dǎo)產(chǎn)生玉米母本單倍體的方法

一、玉米母本單倍體表型相關(guān)基因的定位

通過(guò)對(duì)玉米母本單倍體Stock6衍生誘導(dǎo)系中的誘導(dǎo)率相關(guān)QTL進(jìn)行定位，獲得了控制單倍體誘導(dǎo)的主效QTL-qhir1，通過(guò)對(duì)定位區(qū)間內(nèi)的基因進(jìn)行功能注釋與候選基因預(yù)測(cè)，最終確定了一個(gè)候選基因ZmPLA。

二、敲除玉米ZmPLA基因后獲得玉米母本單倍體誘導(dǎo)能力

1、CRISPER/Cas9系統(tǒng)敲除玉米ZmPLA基因

1)sgRNA序列的選擇

圖1為基因結(jié)構(gòu)及靶位點(diǎn)示意圖。

玉米ZmPLA基因的基因組序列如序列表1所示。玉米ZmPLA基因的第一外顯子的序列如序列表2所示(序列2在序列1第91-450位)。

在玉米ZmPLA基因的第一外顯子序列上設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)序列，長(zhǎng)度為21bp，位于第一外顯子的第264-286堿基位。

靶位點(diǎn)序列為GCTGCAGGAGCTGGACGGACCGG(序列3)。

靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)sgRNA序列為GCUGCAGGAGCUGGACGGACCGG(序列4)，該sgRNA的編碼DNA分子為序列3。

2)、CRISPER/Cas9載體的構(gòu)建

CRISPER/Cas9載體為將將序列表中序列3所示的sgRNA的編碼DNA分子插入pBUN411載體(記載在如下文獻(xiàn)中：Xing H L,Dong L,Wang Z P,et al.A CRISPR/Cas9toolkit for multiplex genome editing in plants[J].BMC plant biology,2014,14(1):1.)得到的載體。

3)、轉(zhuǎn)基因玉米的獲得

將CRISPER/Cas9載體通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105，得到重組菌EHA105/CRISPER/Cas9載體。

農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自華越洋生物科技有限公司，公眾可通過(guò)購(gòu)買(mǎi)獲得

再將重組菌EHA105/CRISPER/Cas9載體采用農(nóng)桿菌侵染法(重組農(nóng)桿菌進(jìn)行28℃擴(kuò)繁，使用擴(kuò)繁后的菌液對(duì)玉米幼胚進(jìn)行侵染)轉(zhuǎn)化玉米Xu178(記載在如下文獻(xiàn)中：項(xiàng)艷,吳大強(qiáng),江海洋,等.玉米優(yōu)良自交系成熟胚再生體系的建立[J].激光生物學(xué)報(bào),2007,16(5):649-654.，公眾可以從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家玉米改良中心獲得)幼胚，經(jīng)過(guò)篩選、分化和生根后獲得T0代轉(zhuǎn)基因玉米植株。

4)、發(fā)生突變的ZmPLA基因轉(zhuǎn)基因玉米鑒定

采集T0代轉(zhuǎn)基因玉米植株葉片，并提取基因組DNA作為模板，用如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到不同株系的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

ZmPLA突變序列檢測(cè)引物：

1240F:CCCUCGACGAGUAUCUAUAGC

1240R:GAAGAUGAUAGGCUGCAGC。

將不同株系的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果與野生型玉米ZmPLA基因的第一外顯子(序列2)進(jìn)行比對(duì)，鑒定T0代轉(zhuǎn)基因玉米不同株系中ZmPLA基因是否發(fā)生突變。

結(jié)果如下：21株T0代轉(zhuǎn)基因玉米植株中，8株中的ZmPLA基因發(fā)生突變，具體突變形式如下，部分如圖2所示：

ZmPLA突變基因ZmHIR1-1為ZmPLA基因核苷酸序列1第280位-281位之間插入T堿基，得到的序列所示的DNA分子；

ZmPLA突變基因ZmHIR1-2為ZmPLA基因核苷酸序列1第271位-281位11個(gè)堿基缺失，得到的序列所示的DNA分子。

ZmPLA突變基因ZmHIR1-3為ZmPLA基因核苷酸序列1第281位堿基G缺失，得到的序列所示的DNA分子；

將ZmPLA基因發(fā)生突變的植株記做陽(yáng)性T0代轉(zhuǎn)基因玉米。

5)T1代ZmPLA基因發(fā)生突變的轉(zhuǎn)基因玉米的基因型鑒定

將上述1得到的陽(yáng)性T0代轉(zhuǎn)基因玉米，收獲種子后再播種，得到T1代轉(zhuǎn)基因玉米。

鑒定T1代轉(zhuǎn)基因玉米的ZmPLA基因是否為突變的基因型，具體如下：T1代轉(zhuǎn)基因玉米的基因組DNA作為模板，利用ZmPLA突變序列檢測(cè)引物：1240F：CCCTCGACGAGTATCTATAGC和1240R：GAAGATGATAGGCTGCAGC進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因玉米的基因型進(jìn)行分類(lèi)。

測(cè)序結(jié)果中，自靶位點(diǎn)序列起具有雙峰特征的序列，則為雜合基因型，則為T(mén)1代轉(zhuǎn)基因玉米雜合型ZmPLA基因突變(同源染色體的1條中ZmPLA基因突變，同源染色體的另1條中ZmPLA基因未突變)；

自靶位點(diǎn)序列起具有特異單峰特征的序列，與玉米ZmPLA基因的第一外顯子(序列2)對(duì)比，若一樣，則為野生型，沒(méi)有發(fā)生突變，下面分析不考慮；若有突變，則為T(mén)0代植株自交后獲得的純合突變，則為T(mén)1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA基因突變純合型(同源染色體的2條中ZmPLA基因均發(fā)生突變)。T1代轉(zhuǎn)基因玉米雜合型ZmPLA基因突變株系有ZmHIR1-1、ZmHIR1-2，且各個(gè)株系的突變類(lèi)型如下：

T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA基因突變雜合型株系ZmHIR1-1中同源染色體中的1條含有ZmPLA突變基因，該突變基因?yàn)閆mPLA基因核苷酸序列1第280位-281位之間插入T堿基，且其他堿基不變得到的序列所示的DNA分子，另一條含有野生型ZmPLA基因；

T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA基因突變雜合型株系ZmHIR1-2中同源染色體中的1條含有ZmPLA突變基因，該突變基因?yàn)閆mPLA基因核苷酸序列1第271位-281位缺失GAGCTGGACGG堿基，且其他堿基不變得到的序列所示的DNA分子，另一條含有野生型ZmPLA基因；

T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA基因突變純合型株系ZmHIR1-3中兩條同源染色體中均含有ZmPLA突變基因，該突變基因?yàn)閆mPLA基因核苷酸序列1第281位缺失G堿基，且其他堿基不變得到的序列所示的DNA分子。

2、CRISPER/Cas9系統(tǒng)敲除玉米ZmPLA基因所獲得突變體的單倍體誘導(dǎo)能力的鑒定

1)T1代雜合基因型轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA基因突變單株單倍體誘導(dǎo)能力鑒定

(1)田間表型鑒定

將T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA基因雜合突變株系ZmHIR1-1、ZmHIR1-2的花粉分別授予雜交種鄭單958(堵純信,曹春景,曹青,等.玉米雜交種鄭單958的選育與應(yīng)用[J].玉米科學(xué),2006,14(6):43-45或從奧瑞金種業(yè)股份有限公司獲得)和雜交種京科968(雜交種京科968購(gòu)自北京屯玉種業(yè)有限責(zé)任公司，貨號(hào)為屯玉京科968，公眾可以通過(guò)北京屯玉種業(yè)有限責(zé)任公司購(gòu)買(mǎi)獲得)，獲得雜交后代；

將T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA基因雜合突變株系ZmHIR1-2自交，獲得自交后代。

將上述所得后代播種于田間，觀察后代單株表型，單倍體具有植株矮小，葉片較窄，且上沖，株型緊湊，雄性不育等特征，二倍體則表現(xiàn)為植株高大，葉片寬大，披散，育性正常。

以野生型玉米(ZmPLA基因未突變)與雜交種的后代為對(duì)照。每個(gè)株系檢測(cè)數(shù)量如表1所示。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1和圖3所示：

T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA雜合型基因突變株系ZmHIR1-1與雜交種鄭單958雜交的54個(gè)后代中得到1個(gè)表現(xiàn)為單倍體性狀單株，擬定為單倍體植株；

T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA雜合型基因突變株系ZmHIR1-1與雜交種京科968雜交的50個(gè)后代中得到1個(gè)表現(xiàn)為單倍體性狀單株，擬定為單倍體植株；

T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA雜合型基因突變株系ZmHIR1-2與雜交種鄭單958雜交的93個(gè)后代中得到2個(gè)表現(xiàn)為單倍體性狀單株，擬定為單倍體植株；

T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA雜合型基因突變株系ZmHIR1-2與雜交種京科968雜交的57個(gè)后代中得到2個(gè)表現(xiàn)為單倍體性狀單株，擬定為單倍體植株；

在T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA雜合型基因突變株系ZmHIR1-2自交的27個(gè)后代中獲得1個(gè)表現(xiàn)為單倍體性狀單株，擬定為單倍體植株。

(2)流式細(xì)胞檢測(cè)葉片倍性

將上述(1)ZmHIR1-1與雜交種后代中鑒定獲得的共2個(gè)表現(xiàn)為單倍體性狀植株，ZmHIR1-2與雜交種后代中鑒定獲得的共4個(gè)表現(xiàn)為單倍體性狀植株，ZmHIR1-2自交后代中鑒定獲得的1個(gè)表現(xiàn)為單倍體性狀植株進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，方法如下：

提取待測(cè)植株幼嫩葉片的細(xì)胞核，以二倍體玉米葉片作為對(duì)照；再用流式細(xì)胞儀器檢測(cè)信號(hào)，首先檢測(cè)二倍體細(xì)胞核信號(hào)，并將二倍體細(xì)胞核信號(hào)峰位設(shè)為100(由于二倍體細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)是單倍體細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的兩倍，因此，單倍體細(xì)胞核信號(hào)峰位在50附近出現(xiàn))；若待測(cè)植株的信號(hào)峰出現(xiàn)在100附近，則認(rèn)為其與二倍體細(xì)胞核信號(hào)強(qiáng)度富集位置相同，該待測(cè)植株為二倍體。若待測(cè)植株細(xì)胞核信號(hào)峰出現(xiàn)在50附近，則認(rèn)為該待測(cè)植株為單倍體植株。

每個(gè)株系檢測(cè)數(shù)量如表1所示。

結(jié)果如圖4所示，上圖為野生型玉米流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果，下圖為T(mén)1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA基因突變雜合型株系流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果；

結(jié)果如下：

ZmHIR1-1與雜交種雜交后代中2個(gè)經(jīng)表型鑒定出的擬單倍體經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后，其倍性均為單倍體，記做T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA雜合型基因突變株系ZmHIR1-1擬單倍體植株。

ZmHIR1-2與雜交種雜交后代中4個(gè)經(jīng)表型鑒定出的擬單倍體經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后，其倍性均為單倍體，記做T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA雜合型基因突變株系ZmHIR1-2擬單倍體植株。

ZmHIR1-2自交后代中1個(gè)表型鑒定出的擬單倍體經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后，其倍性均為單倍體，記做T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA雜合型基因突變株系ZmHIR1-2擬單倍體植株。

(3)分子標(biāo)記鑒定

在基因組上隨機(jī)設(shè)計(jì)30對(duì)分子標(biāo)記，利用轉(zhuǎn)基因材料Xu178(項(xiàng)艷,吳大強(qiáng),江海洋,等.玉米優(yōu)良自交系成熟胚再生體系的建立[J].激光生物學(xué)報(bào),2007,16(5):649-654.，公眾可以從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家玉米改良中心獲得)和雜交種鄭單958、京科968的基因組DNA作為模板，進(jìn)行擴(kuò)增和多態(tài)性分子標(biāo)記篩選，最終獲得一對(duì)分子標(biāo)記，其PCR產(chǎn)物在Xu178中為500bp，而在雜交種鄭單958與雜交種京科968的產(chǎn)物長(zhǎng)度為300bp，具有較大差異，可以利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分辨，Xu178PCR產(chǎn)物較大，電泳速度慢，而雜交種鄭單958和雜交種京科968的PCR產(chǎn)物片段較小，電泳速度快，因此，Xu178的條帶位于雜交種鄭單958和雜交種京科968條帶的上方。(圖5，3、4泳道分別為雜交種鄭單958、雜交種京科968帶型，5泳道為Xu178帶型)

對(duì)上述T1代雜合型基因突變株系ZmHIR1-1與雜交種雜交后代中出現(xiàn)的2個(gè)擬單倍體植株和T1代雜合型基因突變株系ZmHIR1-2與雜交種雜交后代中出現(xiàn)的4個(gè)擬單倍體植株進(jìn)行基因組DNA提取、PCR及瓊脂糖帶型檢測(cè)，若待測(cè)單株只有鄭單958的條帶(圖5，1泳道)，則認(rèn)為該單株不存在父本材料的帶型，因此是母本單倍體。若雜交后代單株中同時(shí)存在Xu178和鄭單958/京科968的條帶(圖5,2泳道)，則認(rèn)為該單株是正常雜交的后代，是二倍體。

結(jié)果如圖5所示，M：Marker，5為父本Xu178帶型，4為母本鄭單958帶型，3為母本京科968帶型，1為后代中單倍體帶型，2為后代中雜合二倍體帶型。

分子標(biāo)記鑒定結(jié)果如下：

2個(gè)ZmHIR1-1與雜交種后代中經(jīng)表型鑒定出的擬單倍體的分子標(biāo)記鑒定結(jié)果表明，均為母本單倍體植株。

4個(gè)ZmHIR1-2與雜交種后代中經(jīng)表型鑒定出的擬單倍體的分子標(biāo)記鑒定結(jié)果表明，均為母本單倍體植株。

因此，雜合轉(zhuǎn)基因株系與雜交種的后代單株或者雜合轉(zhuǎn)基因株系自交后代單株中，若按照上述3種方法鑒定結(jié)果中任一種方法鑒定為單倍體，則該植株為或候選為玉米母本單倍體；若上述3種方法鑒定結(jié)果都不為單倍體，則該植株不為或候選不為玉米母本單倍體。

統(tǒng)計(jì)上述鑒定結(jié)果如表1所示，單倍體誘導(dǎo)率(％)＝(單倍體數(shù)/測(cè)驗(yàn)總株數(shù))*100，可以看出，ZmPLA基因突變后與其他材料雜交，在后代中可獲得玉米母本單倍體。

表1雜合突變株系測(cè)驗(yàn)后代中單倍體植株的出現(xiàn)頻率

注：對(duì)照是用野生型Xu178材料與雜交種鄭單958及京科968授粉后獲得的后代。

2)T1代純合基因型轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA基因突變單株單倍體誘導(dǎo)能力鑒定

(1)田間表型鑒定

將T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA基因純合突變株系ZmHIR1-3的花粉授予雜交種鄭單958，獲得雜交后代；

將T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA基因雜合突變株系ZmHIR1-3自交，獲得自交后代。

將上述所得后代播種于田間，觀察后代單株表型，單倍體具有植株矮小，葉片較窄，且上沖，株型緊湊，雄性不育等特征，二倍體則表現(xiàn)為植株高大，葉片寬大，披散，育性正常。

結(jié)果如下：

T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA純合型基因突變株系ZmHIR1-3與雜交種鄭單958的256個(gè)雜交后代中得到4個(gè)表現(xiàn)為單倍體性狀單株，擬定為單倍體植株；

T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA純合型基因突變株系ZmHIR1-3的30個(gè)自交后代中，得到了2個(gè)表現(xiàn)為單倍體性狀的單株，擬定為單倍體植株。

(2)流式細(xì)胞檢測(cè)葉片倍性

將T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmPLA純合型基因突變株系ZmHIR1-3與雜交種鄭單958雜交后后代中的4個(gè)擬單倍體，以及ZmHIR1-3純合突變自交后代中2個(gè)擬單倍體單株進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，方法如下：

提取待測(cè)植株幼嫩葉片的細(xì)胞核，以野生型玉米(ZmPLA基因未突變，二倍體)葉片作為對(duì)照；再用流式細(xì)胞儀器檢測(cè)信號(hào)，首先檢測(cè)二倍體細(xì)胞核信號(hào)，并將二倍體細(xì)胞核信號(hào)峰位設(shè)為100(由于二倍體細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)是單倍體細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的兩倍，因此，單倍體細(xì)胞核信號(hào)峰位在50附近出現(xiàn))；若待測(cè)植株的信號(hào)峰出現(xiàn)在100附近，則認(rèn)為其與二倍體細(xì)胞核信號(hào)強(qiáng)度富集位置相同，該待測(cè)植株為二倍體。若待測(cè)植株細(xì)每個(gè)株系檢測(cè)數(shù)量如表2所示。

結(jié)果如圖4所示，上圖為野生型玉米流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果，下圖為T(mén)1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmHIR1-3純合株系后代擬單倍體流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果；

結(jié)果如下：

ZmHIR1-3與鄭單958雜交后代中出現(xiàn)的4個(gè)擬單倍體經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后，其倍性均為單倍體。

ZmHIR1-3純合突變材料的自交后代產(chǎn)生的2個(gè)擬單倍體植株經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后，其倍性均為單倍體。

(3)分子標(biāo)記鑒定

在基因組上隨機(jī)設(shè)計(jì)30對(duì)瓊脂糖分子標(biāo)記，利用轉(zhuǎn)基因材料Xu178和雜交種鄭單958、京科968的基因組DNA作為模板，進(jìn)行擴(kuò)增和多態(tài)性分子標(biāo)記篩選，獲得一對(duì)分子標(biāo)記，其PCR產(chǎn)物在Xu178中為500bp，而在雜交種鄭單958與雜交種京科968的產(chǎn)物長(zhǎng)度為300bp，具有較大差異，可以利用利用瓊脂糖凝膠電泳可以分辨，Xu178PCR產(chǎn)物較大，電泳速度慢，而雜交種鄭單958和雜交種京科968的PCR產(chǎn)物片段較小，電泳速度快，因此，Xu178的條帶位于雜交種鄭單958和雜交種京科968條帶的上方。(圖5，3、4泳道分別為雜交種鄭單958、雜交種京科968帶型，5泳道為Xu178帶型)

對(duì)田間選出的ZmHIR1-3T1代轉(zhuǎn)基因玉米純合型基因突變株系與鄭單958雜交后代中的4個(gè)擬單倍體植株進(jìn)行基因組DNA提取、PCR及瓊脂糖帶型檢測(cè)，若待測(cè)單株只有鄭單958的條帶(圖5，1泳道)，則認(rèn)為該單株不存在父本材料的帶型，因此是母本單倍體。若雜交后代單株中同時(shí)存在Xu178和鄭單958的條帶(圖5,2泳道)，則認(rèn)為該單株是正常雜交的后代，是二倍體。

結(jié)果如圖5所示，M：Marker，5為Xu178帶型，4為雜交種鄭單958帶型，3為雜交種京科968帶型，1為后代中單倍體帶型，2為后代中純合二倍體帶型；

結(jié)果如下：

T1代轉(zhuǎn)基因玉米ZmHIR1-3基因純合突變株系與鄭單958的雜交后代中得到的4個(gè)擬單倍體經(jīng)分子標(biāo)記鑒定后均表現(xiàn)為母本單倍體。

因此，純合轉(zhuǎn)基因株系與雜交種的后代單株或者純合轉(zhuǎn)基因株系自交后代單株中，若按照上述3種方法鑒定結(jié)果中任一種方法鑒定為單倍體，則該植株為或候選為玉米母本單倍體；若上述3種方法鑒定結(jié)果都不為單倍體，則該植株不為或候選不為玉米母本單倍體。

結(jié)果如表2所示，誘導(dǎo)率(％)＝(單倍體株數(shù)/測(cè)驗(yàn)總株數(shù))*100，可以看出，ZmPLA基因突變后與其他材料雜交，在后代中可獲得玉米母本單倍體。

表2雜合突變株系測(cè)驗(yàn)后代中單倍體植株的出現(xiàn)頻率

三、玉米母本單倍體Stock6的基因型鑒定

Stock6是首次報(bào)道的能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生玉米母本單倍體的特殊材料(Coe EH(1959)A line of maize with high haploid frequency.Am Nat 93:381–382)經(jīng)過(guò)對(duì)誘導(dǎo)率主效QTL的精細(xì)定位和候選基因預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)與B73相比，在Stock6的基因ZmPLA上存在多處SNP突變以及一個(gè)4bp的插入(表3)，使得該基因喪失了正常功能。利用Crisper技術(shù)對(duì)野生型玉米材料的ZmPLA基因進(jìn)行定點(diǎn)突變后，證明該基因突變后作為父本與其他材料授粉，后代中能出現(xiàn)一定頻率的單倍體。Stock6基因組中的ZmPLA基因?yàn)閷⑿蛄?所示的基因ZmPLA的發(fā)生了如下的突變后所得到的突變序列，命名為ZmHIR-Stock6。

表3基因ZmPLA的外顯子突變形式

基因ZmPLA的5’UTR區(qū)域突變?yōu)椋旱?5-46堿基位缺失兩個(gè)堿基TA，第65-67為堿基由TCG替換為CAA，第67-68堿基位之間插入兩個(gè)堿基TC，第80-81位堿基由TT替換為CG

基因ZmPLA的內(nèi)含子區(qū)域突變?yōu)椋?99-503位堿基GTAC缺失，524位堿基C突變?yōu)镚，530位堿基G突變?yōu)門(mén)，553-560位堿基GCATGCAT缺失，第806-809位堿基GTAC缺失。

基因ZmPLA的3’UTR區(qū)域突變?yōu)?第1741位堿基G突變?yōu)锳，第1781位堿基C突變?yōu)門(mén)，第1787位堿基A突變?yōu)門(mén)。

上述誘導(dǎo)系Stock6中的ZmPLA突變基因4相比于B73中的ZmPLA野生型基因所發(fā)生的SNP和Insertion突變，具體突變形式如下：

ZmHIR-Stock6突變序列為ZmPLA基因核苷酸序列1第1569位后插入CGAG，且第409位的C突變?yōu)門(mén)、第421位的C突變?yōu)镚，第441位的T突變?yōu)镃，第887位的T突變?yōu)镚，第1210位的G突變?yōu)镃，第1306位的T突變?yōu)镃，第1435位的G突變?yōu)锳，第1471位的C突變?yōu)锳，第1541位的A突變?yōu)镃，第1588位的T突變?yōu)镃，第1591位的C突變?yōu)锳，得到的序列所示的DNA分子。第1687位堿基A突變?yōu)镃，第1691位堿基G突變?yōu)锳，第1706位堿基T突變?yōu)镃，第1708位堿基G突變?yōu)镃，第45-46堿基位缺失兩個(gè)堿基TA，第65-67為堿基由TCG替換為CAA，第67-68堿基位之間插入兩個(gè)堿基TC，第80-81位堿基由TT替換為CG，499-503位堿基GTAC缺失，524位堿基C突變?yōu)镚，530位堿基G突變?yōu)門(mén)，553-560位堿基GCATGCAT缺失，第806-809位堿基GTAC缺失，第1741位堿基G突變?yōu)锳，第1781位堿基C突變?yōu)門(mén)，第1787位堿基A突變?yōu)門(mén)。

上述位于1482堿基后的CGAG插入導(dǎo)致該基因發(fā)生了移碼突變。位于319堿基、331堿基和1120堿基處的SNP變異導(dǎo)致了氨基酸的變化，也影響了蛋白質(zhì)的功能。

玉米母本單倍體Stock6后代中從單倍體性狀、流式細(xì)胞檢測(cè)葉片倍性和分子標(biāo)記鑒定均證明有單倍體。

因此，無(wú)論玉米ZmPLA基因哪種突變導(dǎo)致功能喪失均能使其形成玉米母本單倍體。

序列表

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>玉米母本單倍體主效誘導(dǎo)基因及應(yīng)用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1795

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 1

agttcatcac taatcacact tattgtgccc tcgacgagta tctatagcta gctcattaat 60

cgattcgggg gtgtgttgtc gaaggcggca atggcgagct actcgtcgcg gcgtccatgc 120

aatacctgta gcacgaaggc gatggccggg agcgtggtcg gcgagcccgt cgtgctgggg 180

cagagggtga cggtgctgac ggtggacggc ggcggcgtcc ggggtctcat cccgggaacc 240

atcctcgcct tcctggaggc caggctgcag gagctggacg gaccggaggc gaggctggcg 300

gactacttcg actacatcgc cggaaccagc accggcggtc tcatcaccgc catgctcacc 360

gcgcccggca aggacaagcg gcctctctac gctgccaagg acatcaacca cttttacatg 420

cagaactgcc cgcgcatctt tcctcagaag tgagtccgat gctgccgcca ttgttcttgc 480

atccatccag catcgtacgt acgtcctcta tacatctgcg gatcatcatg tgcgcatgtt 540

tgtggcatgc atgcatgcat gtgagcagga gcaggcttgc ggccgccatg tccgcgctga 600

ggaagccaaa gtacaacggc aagtgcatgc gcagcctgat taggagcatc ctcggcgaga 660

cgagggtaag cgagacgctg accaacgtca tcatccctgc cttcgacatc aggctgctgc 720

agcctatcat cttctctacc tacgacgtac gtacgtcgtc acgaatgatt catctgtacg 780

tcgtcgcatg cgaatggctg cctacgtacg ccgtgcgcta acatactcag ctctttccta 840

tctgctgcgc caatttgcag gccaagagca cgcctctgaa gaacgctctg ctctcggacg 900

tgtgcattgg cacgtccgcc gcgccgacct acctcccggc gcactacttc cagactgaag 960

acgccaacgg caaggagcgc gaatacaacc tcatcgacgg cggtgtggcg gccaacaacc 1020

cggtaactga ctagctaact ggaaaacgga cgcacagact ccatgtccat ggcggcccac 1080

aaggtcgatg ctaattgttg cttatgtatg tcgcccgatt gcacatgcgt agacgatggt 1140

tgcgatgacg cagatcacca aaaagatgct tgccagcaag gacaaggccg aggagctgta 1200

cccagtgaag ccgtcgaact gccgcaggtt cctggtgctg tccatcggga cggggtcgac 1260

gtccgagcag ggcctctaca cggcgcggca gtgctcccgg tggggtatct gccggtggct 1320

ccgcaacaac ggcatggccc ccatcatcga catcttcatg gcggccagct cggacctggt 1380

ggacatccac gtcgccgcga tgttccagtc gctccacagc gacggcgact acctgcgcat 1440

ccaggacaac tcgctccgtg gcgccgcggc caccgtggac gcggcgacgc cggagaacat 1500

gcggacgctc gtcgggatcg gggagcggat gctggcacag agggtgtcca gggtcaacgt 1560

ggagacaggg aggtacgaac cggtgactgg cgaaggaagc aatgccgatg ccctcggtgg 1620

gctcgctagg cagctctccg aggagaggag aacaaggctc gcgcgccgcg tctctgccat 1680

caacccaaga ggctctagat gtgcgtcgta cgatatctaa gacaagtggc tttactgtca 1740

gtcacatgct tgtaaataag tagactttat tttaataaaa cataaaaata tatat 1795

<210> 2

<211> 360

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 2

atggcgagct actcgtcgcg gcgtccatgc aatacctgta gcacgaaggc gatggccggg 60

agcgtggtcg gcgagcccgt cgtgctgggg cagagggtga cggtgctgac ggtggacggc 120

ggcggcgtcc ggggtctcat cccgggaacc atcctcgcct tcctggaggc caggctgcag 180

gagctggacg gaccggaggc gaggctggcg gactacttcg actacatcgc cggaaccagc 240

accggcggtc tcatcaccgc catgctcacc gcgcccggca aggacaagcg gcctctctac 300

gctgccaagg acatcaacca cttttacatg cagaactgcc cgcgcatctt tcctcagaag 360

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 3

gctgcaggag ctggacggac cgg 23

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 4

gcugcaggag cuggacggac cgg 23