StNHX1基因表達(dá)盒、應(yīng)用及耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆培育法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因StNHX1及其在轉(zhuǎn)基因作物育種中的應(yīng)用，提供該基因表達(dá)盒、構(gòu)建方法及重組植物表達(dá)載體、宿主菌及耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法、StNHX1基因相對表達(dá)量的測定方法、試劑盒。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中耐鹽大豆培育和篩選技術(shù)薄弱的問題，通過選擇合適的酶切位點(diǎn)，將經(jīng)過人工PCR擴(kuò)增的StNHX1基因引入35s啟動(dòng)子和終止子，增加了StNHX1基因在外源基因中的表達(dá)調(diào)控，構(gòu)建的重組植物表達(dá)載體含有除草劑抗性基因，便于檢測也提高了轉(zhuǎn)基因植株對除草劑的抗性。以本發(fā)明的培育方法生產(chǎn)出的大豆，具有高鹽耐受性。
【專利說明】StNHXI基因表達(dá)盒、應(yīng)用及耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆培育法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因StNHXl及其在轉(zhuǎn)基因作物育種中的應(yīng)用，具體涉及一種Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因StNHXl表達(dá)盒、該表達(dá)盒的構(gòu)建，及利用該表達(dá)盒進(jìn)行耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法、在培育過程中所使用的表達(dá)載體、宿主菌和應(yīng)用以及該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因定量檢測方法、試劑盒。
技術(shù)背景
[0002]土壤鹽潰化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境的最主要問題之一。隨著全球水資源危機(jī)以及土壤鹽化問題的加劇，鹽脅迫已成為影響作物生長與產(chǎn)量的主要限制因素(Apse MP，Aharon G S，Snedden W A, Blumwald E.Salt tolerance conferred by overexpressionof a vacuolar Na./H+antiport in Arabidopsis.Science， 1999，285(5431):1256-1258)o目前，世界鹽潰土壤面積約10億hm2，我國鹽堿地已由過去的0.26億hm2，發(fā)展到0.33億hm2，主要分布在沿海地區(qū)(丁海榮，洪立洲，楊智青，王茂文，朱小梅，劉沖.鹽堿地及其生物措施改良研究現(xiàn)狀.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010(6):299-300) 0鹽堿地中，鹽對植物的毒害主要有水分萬缺及離子毒害兩種類型(Blumwald Ej Aharon G S，Apse M P.Sodiumtransport in plant c ells.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes, 2000，1465(1-2):140-151),主要對光合作用、新陳代謝、離子及水分吸收、細(xì)胞質(zhì)酶的活性等影口向(Takahashi RjLiu S，Takano T.1solation and characterization of plasma membraneNa./H+antiporter genes from salt-sensitive and salt-tolerant reed plants.Journal of Plant Physiology，2009，166 (3): 301-309)，從而導(dǎo)致植物減產(chǎn)甚至死亡。
[0003]植物克服鹽脅迫的機(jī)制有Na+的外排和液泡區(qū)室化(Blumwald Ej Aharon GS and Apse M P，Sodium transport in plant cells.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)_Biomembranes，2000.1465(1-2): 140-151)。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sodium/hydrogen antiporter)在 Na+外排與區(qū)室化中占有重要作用(Liu Lj Zeng Y，Pan X，ZhangF.1solation, molecular characterization, and functional analysis of the vacuolarNa./H+antiporter genes from the halophyte Karelinia caspica.Molecular Biologyreports, 2012，39 (6): 1-10)。質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用質(zhì)膜H+-ATPase產(chǎn)生的跨膜質(zhì)子梯度將Na+排出細(xì)胞，減少Na+向葉片中的長距離轉(zhuǎn)運(yùn)而保護(hù)光合組織免受鹽的毒害(Shi H, Quintero F Jj Pardo J M and Zhu J K，The putative plasma membraneNa+/H+antiporter SOSlcontrols long-distance Na+transport in plants.The PlantCell Online, 2002.14(2):465-477);而液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則利用液泡膜質(zhì)子泵(H+-ATPase和H+-PPase)產(chǎn)生的跨膜質(zhì)子梯度將Na+區(qū)室化進(jìn)入液泡(Vasekina AV,Yershovp P V, Reshetova O S，Tikhonova T V, Lunin V Gj Troofimova M S，BabakovA V.Vacuolar Na+/H+antiporter from barley:1dentification and response to saltstress.Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes,2005，70 (I):123-132)。Na+的外排及區(qū)室化不僅減輕了過多Na+在細(xì)胞中過量累積對細(xì)胞質(zhì)的毒害，而且可以利用NaCl作為溶質(zhì)維持滲透勢以驅(qū)動(dòng)水分進(jìn)入細(xì)胞(Wu G Q，Xi J J, Wang Q, Bao A K, MaQ, Zhang J L, Wang S M.The ZxNHX gene encoding tonoplast Na./H+antiporter from thexerophyte Zygophyllum xanthoxylum plays important roles in response to salt anddrought.Journal of Plant Physiology, 2011, 168(8):758-767)。
[0004]提高作物耐鹽性是解決土壤鹽害的有效方式，然而傳統(tǒng)育種方法由于其遺傳異質(zhì)性、周期長及其他因素等，在提高作物耐鹽性方面收之甚微(Shannon M C.Adaptation ofplants to salinity.Advances in Agronomy, 1997，60:75-120)。植物基因工程的應(yīng)用為人們提高作物耐鹽性提高了一種全新的方法。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸采用耐鹽相關(guān)基因遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)來改良作物的耐鹽性(Ashraf M.Biotechnological approachof improving plant salt tolerance using antioxidants as markers.BiotechnologyAdvances, 2009, 27:84-93)。將耐鹽相關(guān)基因遺傳轉(zhuǎn)化植物，可顯著提高植物的耐鹽性(Ashraf M, Akram N A.1mproving salinity tolerance of plants through conventionalbreeding and genetic engineering:An analytical comparison.BiotechnologyAdvances, 2009, 27(6):744-752)。
[0005]近年來，研究者已從多種植物中克隆Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因并利用植物基因工程應(yīng)用到作物的遺傳改良上(Ashraf M, Akram N A.1mproving salinity toleranceof plants through conventional breeding and genetic engineering:An analyticalcomparison.Biotechnology Advances, 2009, 27 (6): 744-752)。研究結(jié)果顯不，通過超表達(dá)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，多種植物耐鹽性均得到顯著提高，如油菜、水稻、蕎麥、牽?；ǖ?Ashraf M, Akram N A.1mproving salinity tolerance of plants through conventionalbreeding and genetic engineering:An analytical comparison.BiotechnologyAdvances, 2009, 27(6):744-752)。 [0006]大豆[Glycine max(L.)Merrill]是當(dāng)今重要的農(nóng)作物之一,其富含的蛋白質(zhì)作為工業(yè)及農(nóng)業(yè)的重要原料。但隨著土壤鹽潰化和次生鹽潰化的不斷加重，露地及保護(hù)地栽培的大豆產(chǎn)量和品質(zhì)受到了嚴(yán)重影響。在鹽脅迫下，大豆出苗率顯著下降，生長期葉片失綠、黃化壞死，生物量、株高、葉面積等均顯著下降；不僅如此，大豆根瘤的數(shù)量及干重也顯著下降，進(jìn)而影響大豆單株莢數(shù)、粒數(shù)、百粒重，最終導(dǎo)致減產(chǎn)絕收(姜靜涵，關(guān)榮霞，郭勇，常汝鎮(zhèn)，邱麗娟.大豆苗期耐鹽性的簡便鑒定方法.作物學(xué)報(bào)，2013，39 (7): 1248-1256)。此外，我國栽培和野生種質(zhì)資源豐富，但在種質(zhì)資源研究上較國際上的大豆主要生產(chǎn)國存在明顯差距，大豆耐鹽品種的篩選及培育也相對較薄弱。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中耐鹽大豆培育和篩選技術(shù)薄弱，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆應(yīng)用領(lǐng)域空白的問題。
[0008]本發(fā)明通過以下技術(shù)實(shí)現(xiàn)上述目的
[0009]本發(fā)明提供一種Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白StNHXl基因表達(dá)盒，該表達(dá)盒序列如SEQ IDN0.2所示，具有EcoRI和HindIII雙酶切位點(diǎn)。
[0010]本發(fā)明還提供上述的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白StNHXl基因表達(dá)盒的構(gòu)建方法，包括如下步驟:[0011]I)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增序列為SEQ ID N0.1所示的StNHXl基因片段；其中，上游引物Pl:如SEQ ID N0.3所示；下游引物P2:如SEQ ID N0.4所示；
[0012]2)將StNHXl基因連接到pMD19_T質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性重組質(zhì)粒，進(jìn)行BamHI和SacI雙酶切，回收StNHXl基因片段；
[0013]3)進(jìn)行植物表達(dá)載體pBI121BamHI和SacI雙酶切，回收pBI121大片段；
[0014]4)以連接酶連接上述回收的StNHXl基因片段和pBI121大片段，形成連接產(chǎn)物，以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，37°C過夜培養(yǎng)，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子；
[0015]5)提取步驟4)中轉(zhuǎn)化子的重組陽性質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI及HindIII雙酶切，回收小片段，即得到StNHXl基因表達(dá)盒； [0016]其中，步驟2)、3)和步驟5)中雙酶切體系為:50 μ L反應(yīng)體系，IOXBufferl5 μ L，BSA0.5 μ L，DNA15 μ L, BamHIl.0 μ L，Sacll.0 μ L，ddH20 補(bǔ)至 50 μ L ;37°C反應(yīng) 2h，雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析進(jìn)行回收；
[0017]步驟4)中連接反應(yīng)體系為:10XT4ligase Buffer2.5 μ L，pBI121 大片段 2 μ L，StNHXl 基因片段 8 μ L，T4DNA 連接酶 I μ L, ddH20 補(bǔ)至 25 μ L。
[0018]本發(fā)明提供StNHXl基因在耐鹽轉(zhuǎn)基因植物培育中的應(yīng)用，優(yōu)選地，在耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆培育中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明還提供一種耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法，將野生茄子Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因StNHXl構(gòu)建至植物表達(dá)載體pCAMBIA3301中獲得重組植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StNHXl，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將重組表達(dá)載體導(dǎo)入大豆；具體包括如下步驟:
[0020]I)重組植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StNHXl的構(gòu)建
[0021]將野生茄子StNHXl基因表達(dá)盒構(gòu)建至植物表達(dá)載體PCAMBIA3301中，形成重組植物表達(dá)載體 PCAMBIA3301-StNHXl ；
[0022]2) StNHXl轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體的獲得
[0023]農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)方法，將重組植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StNHXl導(dǎo)入大豆基因組中，通過除草劑(Bialaphos)篩選獲得Ttl代轉(zhuǎn)化體；
[0024]3)轉(zhuǎn)StNHXl基因大豆T3代陽性植株的獲得
[0025]T0代植株通過自花授粉獲得T1代種子，T1代種子萌發(fā)后通過PCR及GUS染色鑒定出陽性植株，陽性植株自花授粉獲得T2代種子；τ2代陽性植株自花授粉獲得T3代種子；τ3代種子萌發(fā)后通過同樣的方法鑒定出陽性植株。
[0026]本發(fā)明還提供一種重組植物表達(dá)載體pCAMBIA3301_StNHXl，含有上述的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白StNHXl基因表達(dá)盒和除草劑抗性基因bar基因，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白StNHXl基因表達(dá)盒位于載體PCAMBIA3301的EcoR I和HindIII位點(diǎn)之間。
[0027]本發(fā)明還提供上述重組植物表達(dá)載體pCAMBIA3301_StNHXl，在耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆培育中的應(yīng)用。
[0028]本發(fā)明還提供一種宿主菌，含有上述的重組植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StNHXl。
[0029]本發(fā)明提供上述宿主菌在耐鹽轉(zhuǎn)基因植物培育中的應(yīng)用，優(yōu)選地，在耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆培育中的應(yīng)用。
[0030]本發(fā)明提供一種耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆StNHXl基因相對表達(dá)量的測定方法，以大豆伸長因子EF-laX56856基因TefSl作為內(nèi)參基因，通過半定量RT-PCR測定StNHXl基因在耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆中的表達(dá)量；
[0031] 其中，使用629-bp StNHXl基因探針的制備引物，上游引物F:如SEQ ID N0.9 PJf示，下游引物R:如SEQ ID N0.10所示；
[0032]檢測TefSl基因的上游引物FT:如SEQ ID N0.11所示；下游引物RT:如SEQ IDN0.12所示。
[0033]本發(fā)明提供一種耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆StNHXl基因相對表達(dá)量測定的試劑盒，該試劑盒包括如下序列:
[0034]629-bp StNHXl基因探針的制備引物，上游引物P:如SEQ ID N0.9所示，下游引物P:如 SEQ ID N0.10 所示；
[0035]TefSl基因的檢測引物，上游引物FT JBSEQ ID N0.11所示;下游引物RT:如SEQID N0.12 所示。
[0036]本發(fā)明有益效果:
[0037]1.本發(fā)明通過選擇合適的酶切位點(diǎn)，將經(jīng)過人工PCR擴(kuò)增的StNHXl基因引入35s啟動(dòng)子和終止子，增加了 StNHXl基因在外源基因中的表達(dá)調(diào)控，提高了 StNHXl基因的表達(dá)水平；同時(shí)，通過引入EcoRI及Hindi 11雙酶切位點(diǎn)，形成的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白StNHXl基因表達(dá)盒可以應(yīng)用于多種耐鹽轉(zhuǎn)基因植株的培育，尤其是耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆的培育，填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)中的空白。
[0038]2.采用本發(fā)明提供的耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法生產(chǎn)出的含有StNHXl基因的大豆，具有高鹽耐受性的特點(diǎn)，通過試驗(yàn)鑒定，通過本發(fā)明提供的培育方法生產(chǎn)出的轉(zhuǎn)基因大豆，IOOmM NaCl脅迫下正常生長。
[0039]3.本發(fā)明構(gòu)建的含有Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白StNHXl基因的重組植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StNHXl，含有除草劑抗性基因bar基因，使得攜帶有Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白StNHXl基因的植物表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中表達(dá)更容易檢測，額外增加的除草劑抗性基因bar基因提高了轉(zhuǎn)基因植株對除草劑的抗性，增加了品質(zhì)。
[0040]4.本發(fā)明通過選擇合適的看家基因即大豆伸長因子EF_laX56856基因(TefSl)作為內(nèi)參基因，以此作為基準(zhǔn)，使用集成凝膠顯像系統(tǒng)，凝膠圖像分析StNHXl基因相對于TefSl基因的表達(dá)量，通過該方法可以定量測定StNHXl基因轉(zhuǎn)化率，從而選擇出合適表達(dá)的轉(zhuǎn)基因大豆，為轉(zhuǎn)基因育種提供方便。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1StNHXl基因表達(dá)盒
[0042]圖2 植物表達(dá)載體 pCAMBIA3301-StNHXl 的 T-DNA 區(qū)
[0043]圖3農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化過程
[0044]A:無菌苗5天苗齡；B:子葉節(jié)共培養(yǎng)；C =Bialaphos篩選2個(gè)月的外植體；D:抗性芽伸長至3-4cm ；E:GUS陽性芽生根；F:轉(zhuǎn)基因陽性植株。
[0045]圖4轉(zhuǎn)基因大豆植株P(guān)CR及Southern雜交鑒定
[0046]A:PCR 鑒定 T。代植株:a — gus 基因；b—bar 基因；c—StNHXl 基因；M—DNAMarker:大小分別為 2KbUKb,0.75Kb,0.5Kb,0.25Kb,0.1Kb ;P—質(zhì)粒 DNA 陽性對照；WT—野生型植株陰性對照；1~3—分別為Ttl代轉(zhuǎn)基因植株12N-1~12N-3。
[0047]B =Southern雜交分析:P—質(zhì)粒DNA陽性對照；WT—野生型植株陰性對照；I~3—分別為Ttl代轉(zhuǎn)基因植株12N-1~12N-3。
[0048]圖5轉(zhuǎn)基因大豆⑶S染色鑒定
[0049]A-C:分別為Ttl代植株的根、葉、花；D:T0代植株的丑莢；Ε:1\代種子萌發(fā)24h后⑶S染色；F =T2代種子萌發(fā)3天后⑶S染色；G =T3代10天苗齡側(cè)根⑶S染色；WT—野生型植株；1~3—分別為Ttl代基因植株12N-1~12N-3。
[0050]圖6轉(zhuǎn)StNHXl基因植株Basta抗性分析
[0051]A:黑色箭頭表示轉(zhuǎn)基因植株具有Basta抗性；B:白色箭頭表示陰性植株不具有Basta抗性。
[0052]圖7半定量RT-PCT檢測StNHXl基因在T3代植株中的表達(dá)
[0053]A:半定量RT-PCT檢測StNHXl基因表達(dá)電泳結(jié)果；B:光密度分析StNHXl基因相
對表達(dá)量。
[0054]WT—野生型植株陰性對照；I~3—分別為T3轉(zhuǎn)基因植株12N-1~12N_3 ;TefSl—
看豕基因。
[0055]圖8IOOmM NaCl脅迫下植株生長情況
[0056]A =T3轉(zhuǎn)基因植株在IOOmM NaCl處理前植株形態(tài)；B:野生型對照植株在IOOmMNaCl處理前植株形態(tài)；C:100mM NaCl處理15天后T3代轉(zhuǎn)基因植株和野生型對照植株葉片形態(tài)；D:100mM NaCl處理15天后T3轉(zhuǎn)基因植株和野生型對照植株根部形態(tài)。StNHXlT3+T3轉(zhuǎn)基因植株；WT—野生型對照。豎線表示圖比例(Bar)，Bar = 15cm。
[0057]圖9葉片及根中Na+、K+含量分析
[0058]A:葉片Na.含量；B:葉片K.含量；C:葉片K+/Na+比；D:根Na.含量；E:根K.含量；
[0059]F:根K+/Na+比。不同字母表示Duncan’ s多重比較在P〈0.05水平上差異顯著。
[0060]圖10葉盤對鹽害敏感性檢測⑷及相對葉綠素含量(B)
[0061]1-3:分別為轉(zhuǎn)StNHXl基因T3代株系12N-1~12N2-3 ；WT:野生型植株。
【具體實(shí)施方式】
[0062]下述實(shí)施例中所用方法若無特殊說明均為本領(lǐng)域慣用的技術(shù)手段，所用的試劑、材料，如無特殊說明均可通過商業(yè)途徑得到。
[0063]一、植物重組表達(dá)載體pCAMBIA3301-StNHXl的構(gòu)建
[0064]1.Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白StNHXl基因的克隆:
[0065]以野生爺子‘Torvum Vigor’葉片作為材料,參照TaKaRa公司總RNA提取試劑盒(目錄號(hào):D9108A)說明書方法，提取葉片總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNase消化cDNA產(chǎn)物，參照野生茄子Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列信息(NCBI登錄號(hào)JN606860.1)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增StNHXl基因；其中，StNHXl基因序列如SEQ ID N0.1所示的；擴(kuò)增引物序列，上游引物Pl:如SEQ ID N0.3所示，下游引物P2:如SEQ ID N0.4所示。
[0066]以上述反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)；
[0067]PCR 反應(yīng)體系:10 XPCR Buffer5.0yL, dNTP mix4.0 μ L (2.5mmol.L-1)，引物 Pl和 P2 各 1.0 μ L(20 μ mo I.L-1)，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase0.4 μ L，cDNA 模板 I μ L,ddH20 補(bǔ)至 50 μ L ;
[0068]PCR 反應(yīng)程序:94°C，5min ；95°C，2min, 55°C，lmin, 72°C，lmin, 30 個(gè)循環(huán)；72°C，總延伸IOmin ；
[0069]PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN，目錄號(hào):AP-GX_50)回收純化，用T4DNA連接酶(TaKaRa,目錄號(hào):D2011A)連接到pMD19_T載體(TaKaRa,目錄號(hào):D102A)，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽性重組質(zhì)粒，進(jìn)行序列測定。
[0070]2.StNHXl基因表達(dá)盒的構(gòu)建
[0071]提取上述重組陽性質(zhì)粒進(jìn)行BamHI和SacI雙酶切，回收StNHXl基因片段；
[0072]同時(shí)進(jìn)行植物表達(dá)載體pBI121BamHI和SacI雙酶切，回收pBI121大片段；
[0073]雙酶切體系(50μ L): 10 X Buffer I 5 μ L，BSA0.5 μ L，DNA15 μ L，BamHIL O μ L，Sacll.0 μ L，ddH20補(bǔ)至50 μ L ;37°C反應(yīng)2h ;雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的片段；
[0074]上述回收的p BI121大片段和StNHXl基因片段，按照1:4的比例，用T4DNA連接酶連接，連接反應(yīng)體系=IOXT4Iigase Buffer2.5 μ L, ρΒΙ121大片段2 μ L，StNHXl基因片段8μ L, T4DNA連接酶I μ L，ddH20補(bǔ)至25 μ L ; 16°C反應(yīng)過夜，取10 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞。37°C過夜培養(yǎng)，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子；
[0075]提取轉(zhuǎn)化子的陽性重組質(zhì)粒，依據(jù)上述酶切體系進(jìn)行EcoRI及HindIII雙酶切，回收小片段，即得到StNHXl基因表達(dá)盒，序列如SEQ ID N0.2所示。
[0076]3.植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StNHXl的構(gòu)建
[0077]植物表達(dá)載體pCAMBIA3301依據(jù)上述雙酶切體系進(jìn)行EcoRI及HindIII雙酶切，回收大片段
[0078]上述回收的pCAMBIA3301大片段和StNHXl基因表達(dá)盒，按照1:4的比例，用T4DNA連接酶連接，連接反應(yīng)體系:10XT4ligase Buffer2.5 μ L, pCAMBIA3301大片段2μ L，StNHXl基因表達(dá)盒8 μ L，T4DNA連接酶I μ L，ddH20補(bǔ)至25 μ L ; 16°C反應(yīng)過夜，取10 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Τ0Ρ10感受態(tài)細(xì)胞。37°C過夜培養(yǎng)，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StNHXl構(gòu)建成功。
[0079]二、重組表達(dá)載體pCAMBIA3301-StNHXl轉(zhuǎn)染農(nóng)桿菌EHA105
[0080](I)提取10 μ L 即2 μ g純化的重組表達(dá)pCAMBIA3301_StNHXl，加入200 μ L農(nóng)桿菌ΕΗΑ105感受態(tài)，混勻；
[0081](2)冰浴5min,轉(zhuǎn)入液氮冷凍Imin ；
[0082](3)加入 8OO μ L YEB 液體培養(yǎng)基，250rpm, 28°C，4-5h ；
[0083](4)用移液器將菌液移至YEB固體選擇培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中含有50mg.L-1卡那霉素)均勻涂布；
[0084](5)281:培養(yǎng)1-2(1，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，酶切檢測獲得轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌工程菌。三、農(nóng)桿菌介導(dǎo)StNHXl基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大豆
[0085]1.大豆子葉節(jié)外植體的制備及侵染
[0086]取成熟飽滿的大豆‘新遼鮮’種子，表面消毒后接種于萌發(fā)培養(yǎng)基[B5+3% (w/v)鹿糖+0.8% (w/v)瓊脂，pH5.8]，25°C條件下,光照(16h晝/8h夜,光照強(qiáng)度90 μ mol mH培養(yǎng)5-6天獲得無菌苗(如圖3-A所示)。保留子葉下方2-3cm的下胚軸，垂直沿下軸胚將子葉分開，水平劃5-7次腋芽原基區(qū)，得到子葉節(jié)外植體。
[0087]將含pCAMBIA3301-StNHXl的農(nóng)桿菌EHA105劃線于平板，28°C培養(yǎng)24h，挑取單克隆液體培養(yǎng)24h，然后取2mL菌液加入200mL YEP液體培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)至OD65tl為
0.6-0.8，菌液離心后，用液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基[添加有1/10B5+1.67mg.L、-芐基氨基嘌呤 +0.25mg.I71 赤霉素 +200 μ mol.I71 乙酰丁香酮 +3% (w/v)鹿糖和 0.7% (w/v)瓊脂，ρΗ5.4]重懸，調(diào)節(jié)OD650值為I。
[0088]外植體放入到50mL重懸菌液中，侵染30min。侵染結(jié)束后，吸干多余菌液，將外植體近軸面向下接種于鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)基(3mM L-半胱氨酸+ImM硫代硫酸鈉+ImM 二硫蘇糖醇)，25°C暗培養(yǎng)4天(如圖3-B所示)。
[0089]2.轉(zhuǎn)基因植株的再生
[0090]共培養(yǎng)結(jié)束后的外植體，用液體芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基[B5培養(yǎng)基+1.67mg.L^6-芐基氨基嘌呤+500mg.L-1羧芐青霉素+3% (w/v)蔗糖+3mmol.T1MES, ρΗ5.6]搖動(dòng)洗滌4-5次除去表面多余菌體，將外植體近軸面向上接種于固體芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基[液體芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基+0.8% (w/v)瓊脂瓊脂，]。25°C光照(1611晝/811夜，光照強(qiáng)度9(^11101 n^s—1)培養(yǎng)10天。10天后，外植體接種于芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基(芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基+4mg.L—1雙丙氨磷)，篩選培養(yǎng)4周，每2周繼代一次。
[0091]培養(yǎng)4周后，將有叢生芽分化的外植體(如圖3-C所示)，接種到芽伸長培養(yǎng)基[MS+lmg.I71玉米素+0.5mg.I71赤霉素+0.1mg.L-1 口引哚乙酸+IOOmg.I71焦谷氨酸+50mg.L^1L-天冬酰胺+300mg.L—1羧節(jié)青霉素+2mg.L—1雙丙氨磷+3% (w/v)鹿糖，3mmol.L^MES+0.8% (w/v)瓊脂，ρΗ5.6]上進(jìn)行培養(yǎng)，每隔兩周繼代I次，培養(yǎng)約6-8周。
[0092]待芽伸長至3-4cm時(shí)(如圖3_D所示)，用手術(shù)刀從基部切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基[1/2B5+0.5mg *L_1IBA+3% (w/v)鹿糖+0.8% (w/v)瓊脂，ρΗ5.6],根長至 l_2cm 長時(shí)(如圖3-E所示)，馴化移入溫室，常規(guī)管理，直至成熟收獲(如圖3-F所示)。通過除草劑(Bialaphos)篩選獲得Ttl代轉(zhuǎn)化體；
[0093]3.轉(zhuǎn)StNHXl基因大豆T3代陽性植株的獲得
[0094]T0代植株通過自花授粉獲得T1代種子，T1代種子萌發(fā)后通過PCR及GUS染色鑒定出陽性植株，陽性植株自花授粉獲得T2代種子；τ2代陽性植株自花授粉獲得T3代種子；τ3代種子萌發(fā)后通過同樣的方法鑒定出陽性植株
[0095]四、轉(zhuǎn)基因大豆的鑒定
[0096]1.轉(zhuǎn)基因大豆植株P(guān)CR鑒定
[0097]取Ttl代轉(zhuǎn)基因大豆葉片，SDS法提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，分別對gus、bar和StNHXl基因進(jìn)行PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖4-A所示)。通過對轉(zhuǎn)化植株中外源基因gus、bar和StNHXl的PCR檢測，初步證實(shí)植株的StNHXl基因成功轉(zhuǎn)化植株
并獲得重組。
[0098]其中，StNHXl的PCR檢測引物，上游引物Pl:如SEQ ID N0.3所示，下游引物P2:如 SEQ ID N0.4 所示；
[0099]gus基因的PCR檢測引物，上游引物⑶S1:如SEQ ID N0.5所示，下游引物⑶S2:如 SEQ ID N0.6 所示；
[0100]bar基因的PCR檢測引物，上游引物barl:如SEQ ID N0.7所示，下游引物bar2:如 SEQ ID N0.8 所示。
[0101]gus 因的 PCR 擴(kuò)增程序:94°C，5min，94t:，45sec，55t:，lmin，72°C，lmin，30 個(gè)循環(huán)后，72 °C 總延伸 IOmin ；bar 基因的 PCR 擴(kuò)增程序:MV, 5min, 94 V，45sec，58 V，lmin,72°C，lmin, 30 個(gè)循環(huán)后，72°C總延伸 IOmin ；StNHXl 基因的 PCR擴(kuò)增程序 94°C，5min ；95°C，2min, 55°C，lmin, 72°C，lmin, 30 個(gè)循環(huán)；72°C,總延伸 IOmin0
[0102]2.轉(zhuǎn)基因大豆植株Southern blot鑒定
[0103]采用SDS法，大量提取Ttl代植株葉片基因組DNA。30 μ g基因組DNA被EcoRI酶切消化后用于Southern blot分析；629_bp StNHXl探針的標(biāo)記及雜交方法依據(jù)RoachDIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 說明書進(jìn)行(Roach,產(chǎn)品號(hào):11745832910)。如圖4_B所示，轉(zhuǎn)基因植株各含有I個(gè)拷貝。 [0104]629-bp StNHXl片段通過PCR擴(kuò)增獲得:
[0105]PCR擴(kuò)增引物，上游引物P如SEQ ID N0.9所示，下游引物P:如SEQ ID N0.10所
/Jn ο
[0106]PCR 反應(yīng)程序:95°C,4min ；95°C,2min, 55°C 30s ；72°C,30s ；72°C, IOmin0
[0107]3.轉(zhuǎn)基因大豆花和種子的⑶S鑒定
[0108]取Ttl代轉(zhuǎn)基因大豆和野生型大豆葉片、花和種子，分別置于⑶S染色液[SOmmoI.L-1 憐酸鈉緩沖液(pH7.0), I % (v/v) Triton X100, 20% (v/v)甲醇，50mmol.L-1六氰合亞鐵酸鉀，50mmol L-1六氰合鐵酸鉀，ImM X-gluc (G0LDB10，貨號(hào):G1281C) ]，37°C染色12h。70%乙醇脫色后，拍照觀察(如圖5所示)。由圖5所示，轉(zhuǎn)基因植株花與種子均檢測有g(shù)us基因表達(dá)，且外源基因可遺傳給后代。
[0109]以上培養(yǎng)基或染色液中成分的濃度、質(zhì)量體積百分比均相對于對應(yīng)培養(yǎng)基或染色液體積而言。
[0110]4.轉(zhuǎn)基因大豆Basta涂抹鑒定
[0111]選取健康生長的Ttl代轉(zhuǎn)基因大豆和野生型大豆葉片，用棉棒蘸取0.05 % Basta涂抹于半張葉片，5天之后觀察葉片表現(xiàn)，拍照記錄(如圖6所示)。圖6所示，非轉(zhuǎn)基因植株涂抹Basta的葉片表現(xiàn)出失綠，而轉(zhuǎn)基因植株的葉片正常，表明轉(zhuǎn)基因植株具有除草劑抗性，進(jìn)一步證明植株含有bar基因、gus基因及StNHXl基因這三個(gè)外源基因。
[0112]5.轉(zhuǎn)基因大豆T3代植株中StNHXl基因相對表達(dá)量的測定
[0113]半定量反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)測定StNHXl基因在上述轉(zhuǎn)StNHXl基因植株T3代植株中的表達(dá)量，大豆伸長因子EF-laX56856基因(TefSl)作為內(nèi)參基因。使用集成凝膠顯像系統(tǒng)(GenoSenslSSO，上海勤翔科技有限公司，中國)進(jìn)行溴化乙錠染色后的凝膠圖像獲取及分析。設(shè)定看家基因TefSl基因的光密度為I,StNHXl基因的光密度與其比值為StNHXl基因的相對表達(dá)量。
[0114]其中，反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增StNHXl引物，上游引物P:如SEQ ID N0.9所示，下游引物P:如 SEQ ID N0.10 所示。
[0115]反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增TefSl引物，上游引物TefSl JBSEQ ID N0.11所示，下游引物TefSl:如 SEQ ID N0.12 所示。
[0116]為檢測大豆T3代植株中StNHXl基因的表達(dá)情況，取T3代轉(zhuǎn)基因植株(分別標(biāo)記為12Ν-1、12Ν-2、12Ν-3)及野生型對照植株的葉片及根，分別提取總RNA(參照TaKaRaTrizol Reagent說明書)，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，貨號(hào):DRR047A)的方法將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行半定量PCR反應(yīng)。20μ L反應(yīng)體系包括:10XPCR Buffer2.0 μ L，dNTP mixl.6 μ L(2.5mmol.L-1)，上游引物和下游引物(TefSl和StNHXl基因)各1.0 μ L(20 μ mol.L-1)，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase0.2 μ L, cDNA 模板 I μ L, ddH20 補(bǔ)至 20μ L。反應(yīng)程序:95°C，4min ；95°C,2min, 55°C,30s ；72°C,30s ；30 個(gè)循環(huán)后 72°C延伸IOmin0對葉片及根進(jìn)行TefSl基因表達(dá)量和StNHXl基因相對表達(dá)量的測定(如圖7所示)。由圖7可觀察到，StNHXl基因在T3代轉(zhuǎn)基因植株葉片及根部中均為超表達(dá)。
[0117]6.轉(zhuǎn)基因大豆耐鹽性鑒定
[0118]上述3個(gè)超表達(dá)轉(zhuǎn)StNHXl基因T3代株系用于耐鹽性試驗(yàn)。將3個(gè)轉(zhuǎn)StNHXl基因大豆T3代株系(12Ν-1，12Ν-2及12N-3)的陽性植株與野生型對照植株(WT)用于耐鹽性試驗(yàn)。10天苗齡的植株定植于含有l(wèi)/2Hoagland溶液(EC = 1.34dS.m-1)的18L水桶中(上圍直徑為30cm)，每桶含有3棵不同株系的T3代植株及I棵野生型植株(四棵植株呈正方形排列，對角線距離為26cm)，對營養(yǎng)液進(jìn)行連續(xù)通氧，并每3天更換(用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.5)。每個(gè)株系重復(fù)5次。溫室環(huán)境采用人工控制，晝夜溫度:28°C/20°C，光周期:12h 晝 /12h 夜(HPS 燈，PPFD:光強(qiáng)度 600 μ mol.m-2.s’，相對濕度:70 - 80%, CO2濃度:400 μ M0營養(yǎng)液培養(yǎng)20天后，用含有IOOmM NaCl的l/2Hoagland營養(yǎng)液栽培(EC =
7.35dS.m-1)，為避免鹽沖擊效應(yīng)，先用含有50mM NaCl的營養(yǎng)液栽培，2天后NaCl增加至100mM。鹽處理15天后進(jìn)行下列各項(xiàng)生理生化指標(biāo)檢測。對照試驗(yàn)為以不加NaCl溶液進(jìn)行栽培。
[0119]耐鹽前后觀察各植株癥狀(如圖8所示)。在鹽處理前，30天苗齡的轉(zhuǎn)基因及野生型植株在形態(tài)上沒有差別(如圖8A，8B所示)。而IOOmM NaCl處理15天后，野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株在形態(tài)上有顯著的差別(如圖8C，8D所示)，轉(zhuǎn)基因植株株高、根長、莖粗、葉數(shù)、葉面積及生物量均顯著高于野生型對照(如表1所示)，且野生型植株的生長明顯受到抑制，葉片失綠且枯萎(如圖8C所示)。野生型植株鹽害指數(shù)也顯著比轉(zhuǎn)基因植株高(如表1所示)。
[0120]NaCl處理前及處理15天后取根、葉進(jìn)行Na+、K+含量測定(如圖9所示)。由圖9所示，在NaCl處理前，植株Na+、K+含量及K+/Na+比值沒有顯著差別；IOOmM NaCl處理15天后，轉(zhuǎn)基因植株葉片中Na+含量顯著比野生型低而K+含量顯著比野生型對照高，轉(zhuǎn)基因植株KVNa+比值及根部Na+、K+含量均顯著高于野生型對照。
[0121]NaCl處理前后測定植株葉片丙二醛(MDA)、相對水含量(RWC)及脯氨酸含量(如表2所示)。IOOmM NaCl處理前轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株葉片的MDA、RWC及脯氨酸含量無顯著差別，而NaCl處理15天后，轉(zhuǎn)基因植株的RWC及脯氨酸含量顯著高于野生型對照，MDA含量則顯著低于野生型對照(如表2所示)，表明轉(zhuǎn)基因植株具有較強(qiáng)的耐鹽性。
[0122] 取無鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因及野生型植株的葉片進(jìn)行葉盤敏感性檢測(如圖10A所示)。將葉片分成大小相同的葉盤置于不同濃度NaCl濃度下光照培養(yǎng)，3天后觀察葉盤的顏色，結(jié)果如圖9A所示，隨著NaCl濃度的升高，葉盤的綠色越淡，但同一濃度下，轉(zhuǎn)基因植株葉盤的顏色遠(yuǎn)比野生型植株的深。測定鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因及野生型植株葉片相對葉綠素的含量(如圖9B所示)。由圖9B所示，轉(zhuǎn)基因植株相對葉綠素含量顯著高于野生型植株，表明轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性強(qiáng)于野生型對照植株。[0123]表1營養(yǎng)液栽培植株生長指標(biāo)比較
【權(quán)利要求】
1.一種Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白StNHXl基因表達(dá)盒，其特征在于:該表達(dá)盒序列如SEQ IDN0.2所示。
2.權(quán)利要求1所述的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白StNHXl基因表達(dá)盒的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟: 1)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增序列為SEQID N0.1所示的StNHXl基因片段；其中，上游引物Pl:如SEQ ID N0.3所示；下游引物P2:如SEQ ID N0.4所示； 2)將StNHXl基因連接到pMD19-T質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性重組質(zhì)粒，進(jìn)行BamHI和SacI雙酶切，回收StNHXl基因片段； 3)進(jìn)行植物表達(dá)載體pBI121BamHI和SacI雙酶切，回收pBI121大片段； 4)以連接酶連接上述回收的StNHXl基因片段和pBI121大片段，形成連接產(chǎn)物，以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，3 7°C過夜培養(yǎng)，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子； 5)提取步驟4)中轉(zhuǎn)化子的重組陽性質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI及HindIII雙酶切，回收小片段，即得到StNHXl基因表達(dá)盒； 其中，步驟2)、3)和步驟5)中雙酶切體系為:50 μ L反應(yīng)體系，IOXBufferl 5 μ L，BSA0.5μ L，DNA15y L，BamHIl.Ομ L，SacIl.Ομ L，ddH20 補(bǔ)至 50 μ L ;37°C反應(yīng) 2h，雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析進(jìn)行回收； 步驟 4)中連接反應(yīng)體系為:10XT4ligase Buffer2.5 μ L，pBI121 大片段 2 μ L，StNHXl基因片段8 μ L，T4DNA連接酶I μ L，ddH20補(bǔ)至25 μ L。
3.StNHXl基因在耐鹽轉(zhuǎn)基因植物培育中的應(yīng)用，優(yōu)選地，在耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆培育中的應(yīng)用。
4.一種耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法，其特征在于將野生茄子Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因StNHXl構(gòu)建至植物表達(dá)載體pCAMBIA3301中，獲得重組植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StNHXl，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將重組表達(dá)載體導(dǎo)入大豆；具體包括如下步驟: 1)重組植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StNHXl的構(gòu)建 將野生茄子StNHXl基因表達(dá)盒構(gòu)建至植物表達(dá)載體pCAMBIA3301中，形成重組植物表達(dá)載體 PCAMBIA3301-StNHXl ； 2)StNHXl轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體的獲得 農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)方法，將重組植物表達(dá)載體PCAMBIA3301-StNHXl導(dǎo)入大豆基因組中，通過除草劑Bialaphos篩選獲得Ttl代轉(zhuǎn)化體； 3)StNHXl轉(zhuǎn)基因大豆T3代陽性植株的獲得 T0代植株通過自花授粉獲得T1代種子，T1代種子萌發(fā)后通過PCR及⑶S染色鑒定出陽性植株，陽性植株自花授粉獲得T2代種子；T2代陽性植株自花授粉獲得T3代種子；Τ3代種子萌發(fā)后通過同樣的方法鑒定出陽性植株。
5.一種重組植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StNHXl，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因StNHXl表達(dá)盒和除草劑抗性基因bar基因，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白StNHXl基因表達(dá)盒位于載體pCAMBIA3301的EcoR I和HindIII位點(diǎn)之間。
6.權(quán)利要求5所述的重組植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StNHXl，在耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆培育中的應(yīng)用。
7.—種宿主菌，其特征在于含有權(quán)利要求5所述的重組植物表達(dá)載體PCAMBIA3301-StNHXl ο
8.權(quán)利要求7所述的宿主菌在耐鹽轉(zhuǎn)基因植物培育中的應(yīng)用，優(yōu)選地，在耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆培育中的應(yīng)用。
9.一種耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆StNHXl基因相對表達(dá)量的測定方法，其特征在于:以大豆伸長因子EF-laX56856基因TefSl作為內(nèi)參基因，通過半定量RT-PCR測定StNHXl基因在耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆中的表達(dá)量； 其中，使用629-bp StNHXl基因探針的制備引物，上游引物P:如SEQ ID N0.9所示，下游引物P:如SEQ ID N0.10所示； 檢測TefSl基因的上游引物TefSl JnSEQ ID N0.11所示；下游引物TefSl JnSEQ IDN0.12所示。
10.一種耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆StNHXl基因相對表達(dá)量測定的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括如下序列: 629-bp StNHXl基因探針的制備引物，上游引物F:如SEQ ID N0.9所示，下游引物R:如 SEQ ID N0.10 所示； TefSl基因的檢測引物，上游引物FT:如SEQ ID N0.11所示；下游引物RT:如SEQ IDN0.12所示。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103981179SQ201410229771
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】朱月林, 蓋鈞鎰, 陳國戶, 楊立飛 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)