專利名稱：一種用于轉(zhuǎn)基因大豆檢測的兩基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的質(zhì)粒分子，具體來說，涉及一種轉(zhuǎn)基因大豆檢測用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
自1996年以來，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積以年均10%以上的速率增長，2009年全球批準(zhǔn)種植的轉(zhuǎn)基因作物達(dá)1.34億公頃，其中轉(zhuǎn)基因大豆種植面積達(dá)到6900萬公頃，占大豆總種植面積的77%。隨著轉(zhuǎn)基因作物的廣泛種植，其安全性問題引起了全球公眾的普遍重視。歐盟于1998年在世界上簽署第一個法案，要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)簽說明；1999年要求出口到歐盟的非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不得含有的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品污染；2002年，歐盟將標(biāo)識的最低限量降低到0.9%。隨之，日本、澳大利亞、韓國等國家對轉(zhuǎn)基因成分的最低含量做了不同的規(guī)定，閾值從1-5%不等。我國于2001年5月23日發(fā)布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，2002年1月5日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價、標(biāo)識和進(jìn)口安全管理三個配套管理辦法，確定了第一批實施標(biāo)識管理的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物目錄，并于2002年3月20日起正式實施。標(biāo)識制度的實施依賴于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)。目前主要有兩類技術(shù)一類是基于核酸方法，如PCR、基因芯片等，另一類是基于蛋白質(zhì)方法，如ELISA、試紙條等，在這些檢測方法中，PCR方法因具有高靈敏度和特異性強的優(yōu)點，已成為目前最重要、應(yīng)用最廣泛的轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品檢測技術(shù)。在進(jìn)行PCR檢測時，需要設(shè)置陽性對照以確保檢測過程的有效性和檢測結(jié)果的可靠性，特別是在定量PCR檢測中需要用含量準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因作物陽性標(biāo)準(zhǔn)品(CRMs)來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。然而，由于轉(zhuǎn)基因作物存在生物安全性和和現(xiàn)有技術(shù)的限制，轉(zhuǎn)基因作物陽性標(biāo)準(zhǔn)品很難獲得，這種現(xiàn)狀已成為檢測方法和應(yīng)用的瓶頸。因此亟需研制能夠替代轉(zhuǎn)基因作物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的新型陽性對照材料，以滿足不斷發(fā)展的轉(zhuǎn)基因檢測需求。標(biāo)準(zhǔn)分子的概念由日本科學(xué)家Kuribara等于2002年提出，它是指一種含有轉(zhuǎn)基因檢測目的外源基因和/或內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的特異性片段的線性化重組質(zhì)粒分子，研究表明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子在GMO鑒定檢測中是很好的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)替代物。近年來，國內(nèi)外眾多學(xué)者報道了一些用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的容量也有一個大的提升，從最初的單一目標(biāo)基因的質(zhì)粒分子到多目標(biāo)基因的質(zhì)粒分子，這些質(zhì)粒分子可同時涉及不同物種的轉(zhuǎn)基因作物的多個基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一個目的在于提供一種用于轉(zhuǎn)基因大豆檢測的標(biāo)準(zhǔn)分子對照物及其構(gòu)建方法，這樣就為解決陽性標(biāo)準(zhǔn)品缺乏問題提供一條有效途徑，有效地保證檢測工作的進(jìn)行。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因大豆檢測用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其特征在于， 通過特異性PCR引物，從轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2基因組DNA中擴增出大豆內(nèi)源基因Lectin1特異性序列、外源基因EPSPS基因特異性序列，經(jīng)過與中間載體的連接、酶切、轉(zhuǎn)化，將插入這兩個特異性片段依次插入到質(zhì)粒載體PMDTM19-T Simple中，獲得了標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子 pTLE20本發(fā)明所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，以替代轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS40-3-2和轉(zhuǎn)PAT大豆，用于定性和定量PCR檢測。該標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子同時含有大豆內(nèi)源基因Lectin和外源基因EPSPS 的一段序列。本發(fā)明所述的一種轉(zhuǎn)基因大豆檢測用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)利用GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析，查找并獲得大豆內(nèi)源基因Lectin、 轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS-40-3-2外源基因EPSPS的特異性序列；(2)根據(jù)Lectin基因序列、EPSPS基因序列利用Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計 PCR特異性定性引物，分別擴增這兩個基因；(3)分別回收Lectin基因和EPSPS基因的定性PCR產(chǎn)物，將這兩個基因PCR回收產(chǎn)物構(gòu)建到質(zhì)粒載體PMDTM19-T Simple上獲得中間質(zhì)粒分子pMDLEC和pMDEPS ；(4)將中間質(zhì)粒分子pMDLEC和載體pET30a分別用限制性內(nèi)切酶Not I和Ml I 進(jìn)行雙酶切，回收目的基因片段及載體片段，用T4 DNA連接酶連接獲得質(zhì)粒分子pETLEC ；(5)將中間質(zhì)粒分子pMDEPS和pETLEC分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I和)(ba I進(jìn)行雙酶切，回收這兩種酶切產(chǎn)物，用jM DNA連接酶連接獲得質(zhì)粒分子PETLE2 ；(6)以質(zhì)粒分子pETLE2為模板，用Lec-Pl和Eps_P2引物擴增獲得Lec-Eps區(qū)擴增子序列；(7)將Lec-Eps區(qū)擴增產(chǎn)物回收連接到載體pMDTM19_T Simple上獲得質(zhì)粒分子 pTLE20(8)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子PTLE2的定量PCR檢測方法驗證。所述的定量PCR驗證，是指標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子PTLE2在進(jìn)行定量PCR分析大豆內(nèi)源基因Lectin 1和轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS_40_3_2外源基因EPSPS特異性序列的檢測極限、定量極限等特性，以鑒定該標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子代替陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的能力，進(jìn)而驗證標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子在轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS-40-3-2樣品實際檢測中的有效性。本發(fā)明的有益結(jié)果利用酶切、連接、轉(zhuǎn)化等分子克隆技術(shù)構(gòu)建了含有大豆內(nèi)源基因Lectin 1以及轉(zhuǎn)基因大豆大豆品系GTS_40_3_2外源基因EPSPS特異性序列的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子PTLE2。此標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子可以代替陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于轉(zhuǎn)基因大豆的定量PCR檢測，很好的解決了檢測過程中陽性標(biāo)注物質(zhì)缺乏的問題，此標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子PTLE2在實際檢測中具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點，應(yīng)用該標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子進(jìn)行實際樣品定量分析時，樣品檢測結(jié)果的偏差在國際上廣泛認(rèn)可的允許范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明中構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子PTLE2完全適用于對轉(zhuǎn)基因大豆及其加工產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因成分含量的定量分析。


圖1為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pTLE2的構(gòu)建示意圖及測序結(jié)果斜體加粗的為PCR引物所在位置，方框內(nèi)為定量引物和探針?biāo)谖恢?，在兩基因之間引入了四個限制性內(nèi)切酶Not I, Sal IjEcoR I和Xba I。
具體實施例方式為了更充分的解釋本發(fā)明的實施，提供轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)分子對照物的制備實施實例。這些實施實例僅僅是解釋而不是限制分發(fā)明的范圍。下列實施例中未標(biāo)明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件操作。實施例1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的構(gòu)建一、實驗材料轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS40-3-2 ；非轉(zhuǎn)基因大豆品種。二、實驗試劑pMDTM19-T Simple Vector購自大連寶生物工程公司；dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA marker I、II和marker III購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶Not I ,Sal I、EcoR I , Xba I購自NEB北京有限公司；質(zhì)?；蚪MDNA提取及純化采用北京天根生化科技有限公司研制的質(zhì)粒小量提取試劑盒；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。三、實驗儀器TC-512型PCR擴增儀(英國TECHNE公司)；Geliance 200 DNA電泳凝膠成像儀 (美國PerkinElmer公司)；Nano-Drop ND-1000核酸蛋白儀(美國Nano Drop公司)；離心機；恒溫水浴鍋；培養(yǎng)箱；天平等。四、試驗方法和過程 1、植物基因組DNA提取-SDS法a、稱取0. Ig經(jīng)粉碎機粉碎的大豆樣品，加入Iml 65°C預(yù)熱的2% SDS抽提液， 10 μ 1 RNase-A混勻，于65°C溫育30min，置于室溫后13000r離心lOmin。b、取上清加0. 6倍體積的KAc，冰浴20min后，13000r離心lOmin，取上清加2倍體積預(yù)冷無水乙醇，混勻。c、于-20°C靜置30min，13000r離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌，短時間離心后棄上清，重復(fù)一次。自然干燥后加200μ1 TE溶沉淀，-20°c保存。d、取2 μ 1提取的DNA樣品，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。利用核酸儀測定所提取的DNA濃度和純度。2、引物設(shè)計在GenBank中搜索大豆內(nèi)源基因Lectin 1、轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS-40_3_2外源基因EPSPS特異性序列，利用軟件I^rimer 5. 0設(shè)計兩對定性PCR引物，分別用于擴增大豆內(nèi)參基因特異性序列Lectin 1、轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS-40-3-2外源基因EPSPS特異性序列。具體的引物序列見表1。表1構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的PCR引物序列
權(quán)利要求
1.一種用于轉(zhuǎn)基因大豆檢測的兩基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其構(gòu)建，其特征在于，含有大豆內(nèi)源基因特異性序列Lectin 1和轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS40-3-2外源基因EPSPS特異性序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因大豆檢測用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其特征是，所述的大豆內(nèi)源基因Lectin指的是大豆凝集素基因，其在大豆基因組中高度保守，具有種間特異性、種內(nèi)非特異性和單拷貝數(shù)的特點；所述的EPSPS基因是指5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSPS)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因大豆檢測用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其中Lectin1和EPSPS標(biāo)準(zhǔn)分子的引物序列如下目標(biāo)基因引物名稱引物序列(5'-3')產(chǎn)物大小(bp)Lectin 1Lec-PlATAAGAATGCGGCCGCGGCTTGCCTTCTTTCTCLec-P2GCGTCGAC CCCTTCGATCTGTCACATTT530EPSPSEps-PlGGAATTCTTCATGTTCGGCGGTCTCEps-P2GCTCTAGAATCATCGTGGCATCGTCC1199
4. 一種如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因大豆檢測用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟(1)利用GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析，查找并獲得大豆內(nèi)源基因Lectin1、轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS-40-3-2外源基因EPSPS的特異性序列；(2)根據(jù)Lectin1基因序列、EPSPS基因序列利用Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計PCR 特異性定性引物，分別擴增這兩個基因；(3)分別回收Lectin1基因和EPSPS基因，將這兩個基因PCR回收產(chǎn)物構(gòu)建到質(zhì)粒載體pMDTM19-T Simple上獲得中間質(zhì)粒分子pMDLEC和pMDEPS ；(4)將中間質(zhì)粒分子pMDLEC和載體pET30a分別用限制性內(nèi)切酶NotI和Ml I進(jìn)行雙酶切，回收目的基因片段及載體片段，用T4 DNA連接酶連接獲得質(zhì)粒分子pETLEC ；(5)將中間質(zhì)粒分子pMDEPS和pETLEC分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI和)(ba I進(jìn)行雙酶切，回收這兩種酶切產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接獲得質(zhì)粒分子PETLE2 ；(6)以質(zhì)粒分子PETLE2為模板，用Lec-Pl和Eps_P2引物擴增獲得Lec-Eps區(qū)擴增子序列；(7)將Lec-Eps區(qū)擴增產(chǎn)物回收連接到載體pMDTM19-TSimple上獲得質(zhì)粒分子pTLE2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因作物檢測中必要的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法。一種轉(zhuǎn)基因大豆檢測用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法，所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子包含大豆內(nèi)源基因Lectin特異性片段、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2品系中外源基因EPSPS特異性片段。通過分析序列，設(shè)計引物擴增獲得兩個目的基因片段。通過融合PCR、連接、轉(zhuǎn)化等分子克隆技術(shù)獲得人工重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pTLE2。本發(fā)明中構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子完全可以代替陽性標(biāo)準(zhǔn)品，適用于對轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS40-3-2結(jié)構(gòu)基因特異性的定性和定量PCR分析和檢測。如有新的轉(zhuǎn)基因材料出現(xiàn)，可在原標(biāo)準(zhǔn)分子的基礎(chǔ)上加入新的外源基因片段，滿足日益增多的轉(zhuǎn)基因作物材料的檢測需要。
文檔編號C12N15/63GK102409080SQ20101028687
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月20日
發(fā)明者楊雅麟, 滕達(dá), 王建華, 王秀敏 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所