本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及一種構(gòu)建DNA聚合酶I缺陷型菌株的方法、一種DNA聚合酶I缺陷型菌株、一種sgRNA表達質(zhì)粒、一種CRISPR系統(tǒng)、該CRISPR系統(tǒng)在構(gòu)建DNA聚合酶I缺陷型菌株中的用途和一種試劑盒。

背景技術(shù)：

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)最早發(fā)現(xiàn)于原核生物的免疫系統(tǒng)中，這些成簇規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列旁邊經(jīng)常伴隨出現(xiàn)保守基因，而這些保守基因編碼的蛋白統(tǒng)稱為CRISPR相關(guān)蛋白(Cas，CRISPR-associated proteins)。CRISPR系統(tǒng)和TALEN(transcription activator-like effector nucleases)系統(tǒng)、ZFN(zinc finger nucleases)系統(tǒng)是現(xiàn)在常用的三種基因組編輯工具，可以用于復(fù)雜的基因組編輯。目前CRISPR系統(tǒng)成功已應(yīng)用于細菌、酵母、斑馬魚、小鼠及人細胞的基因組精確修飾，以及基因轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控以及其他方面。由于其突變效率高、突變成本低、作用物種廣泛，是一種非常有前景的基因組定點改造分子工具。

CRISPR系統(tǒng)主要由兩個部分組成：sgRNA(single guide RNA)和Cas9蛋白。sgRNA序列也是由兩部分組成：1)靶序列，長20bp，和基因組上目標序列互補，位于PAM(Protospacer-Adjacent Motif)序列之前，需要自行設(shè)計；2)crRNA-tracrRNA，由原核生物上的序列改造而成，形成可以被Cas9蛋白識別的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。Cas9是一種核酸酶。當sgRNA和Cas9共轉(zhuǎn)化受體細胞時，sgRNA可以將Cas9帶到基因組上靶序列的位置，在PAM序列上游2-3堿基處由Cas9將靶基因的DNA雙鏈切斷。如果新的DNA模板也一并導(dǎo)入的話，斷裂的DNA雙鏈會發(fā)生同源重組，如果沒有DNA模板導(dǎo)入，則在非同源末端連接修復(fù)機制下，會產(chǎn)生Indel突變。

DNA聚合酶I缺陷型菌株可以用來作為聚合酶突變體篩選的宿主細胞。市面上現(xiàn)有的DNA聚合酶I缺陷型菌株是Addgene的JS200溫度敏感型DNA聚合酶I缺陷菌株。此菌株非常容易老化，Pol I缺陷型基因型很容易丟失，很難用來作為宿主細胞。傳統(tǒng)缺陷型菌株的獲得是通過從自然界中分離或者通過傳統(tǒng)的同源重組的方法來獲得，這些方法耗時久，成功率低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在解決上述問題至少之一或者至少提供一種商業(yè)選擇。為此，本發(fā)明通過設(shè)計構(gòu)建出一種適于構(gòu)建DNA聚合酶缺陷型菌株的CRISPR系統(tǒng)，來獲得DNA聚合酶缺陷型菌株。

依據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種構(gòu)建DNA聚合酶I缺陷型菌株的方法，該方法基于CRISPR系統(tǒng)進行DNA聚合酶I缺陷型菌株的構(gòu)建，該方法以klenow1、klenow2和klenow3中的至少之一作為靶序列，所述klenow1為SEQ ID NO：1所示klenow片段中的第30-52位中的任意連續(xù)的20bp，所述klenow2為SEQ ID NO：1所示klenow片段中的第370-390位中的任意連續(xù)的20bp，所述klenow3為SEQ ID NO：1所示klenow片段中的第1048-1068位中的任意連續(xù)的20bp。klenow1、klenow2和klenow3是發(fā)明人經(jīng)過多次模擬和試驗確定的，目標基因序列上的這三個位置的至少之一都能使利用的CRISPR系統(tǒng)高成功率的獲得目標缺陷型菌株。

本發(fā)明的這一方面的構(gòu)建DNA聚合酶I缺陷型菌株的方法，步驟簡單、敲除效率高、特異性好，可以很好的對菌株的基因組進行編輯，例如對大腸桿菌中的DNA聚合酶I序列的至少一部分進行編輯，即利用對發(fā)明人多次篩選確定出的Klenow片段基因序列上的特定位置——klenow1、klenow2和klenow3至少之一進行切割，使菌株突變成DNA聚合酶I缺陷。通過該方法的利用CRISPR系統(tǒng)來獲得DNA聚合酶缺陷型菌株，耗時短，成功率高，且CRISPR系統(tǒng)構(gòu)建好后，目標缺陷型菌株容易獲得。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述klenow1為SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第33-52位，所述klenow2為SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第371-390位，所述klenow3為SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第1049-1068位。klenow1、klenow2和klenow3是發(fā)明人多次模擬和試驗確定的，目標基因序列上的這三個位置的至少之一都能使其對應(yīng)的CRISPR系統(tǒng)高成功率的獲得目標缺陷型菌株。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述方法包括以下步驟：(1)基于所述靶序列，獲得能夠與所述靶序列結(jié)合的雙鏈DNA序列；(2)構(gòu)建以獲得所述CRISPR系統(tǒng)，所述CRISPR系統(tǒng)包括sgRNA表達質(zhì)粒和Cas9表達質(zhì)粒，其中，構(gòu)建所述sgRNA表達質(zhì)粒包括，將(1)中的雙鏈DNA序列連接到sgRNA-載體1上，以獲得所述sgRNA表達質(zhì)粒，構(gòu)建所述Cas9表達質(zhì)粒包括，將Cas9連接到載體2上，以獲得所述Cas9表達質(zhì)粒；(3)利用(2)中的CRISPR系統(tǒng)染所述菌株的感受態(tài)細胞，以獲得所述DNA聚合酶I缺陷型菌株。較佳的，所述sgRNA-載體1所使用的載體1和所述載體2具有不同的復(fù)制起始子，這樣，利于避開共轉(zhuǎn)染兩個質(zhì)粒時兩個質(zhì)粒之間的競爭，避免感受態(tài)細胞中只存留一個質(zhì)粒。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，載體1和載體2中的其中的一個可以為PSB1A2和PSB1C3中的一個，另一個為PSB2K3，因為PSB1A2和PSB1C3的復(fù)制起始子都是pMB1，而PSB2K3的復(fù)制起始子與它們不同。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述菌株為大腸桿菌，包括但不限于XL-10和DH5a。在篩選聚合酶突變體時，一般需要把菌株本身的聚合酶給突變掉，而大腸桿菌的聚合酶I和要篩選的聚合酶klenow片段結(jié)構(gòu)功能相似，并且實驗證明失活聚合酶I后大腸桿菌細胞不會死亡，只會生長緩慢，因此可以選用大腸桿菌。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，能夠與klenow1結(jié)合的雙鏈DNA序列的互補的兩條鏈分別為SEQ ID NO：2和3，能夠與klenow2結(jié)合的雙鏈DNA序列的兩條鏈分別為SEQ ID NO：4和5，能夠與klenow3結(jié)合的雙鏈DNA序列的兩條鏈分別為SEQ ID NO：6和7。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施例，能夠與klenow1結(jié)合的雙鏈DNA序列的兩條鏈分別為SEQ ID NO：8和9，能夠與klenow2結(jié)合的雙鏈DNA序列的兩條鏈分別為SEQ ID NO：10和11，能夠與klenow3結(jié)合的雙鏈DNA序列的兩條鏈分別為SEQ ID NO：12和13。其中，SEQ ID NO：8和9分別對應(yīng)于SEQ ID NO：2和3——在SEQ ID NO：2的左側(cè)加上TAGC、在其右側(cè)加上G堿基即為SEQ ID NO：8，在SEQ ID NO：3的左側(cè)加上AAAC四個堿基，在其右側(cè)加上一個G堿基即為SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：8和9退火形成的雙鏈DNA序列相較于SEQ ID NO：2和3帶有BspQI酶切位點；類似的，SEQ ID NO：10和11分別對應(yīng)于SEQ ID NO：4和5——在SEQ ID NO：4的左側(cè)加上TAGC、在其右側(cè)加上G堿基即為SEQ ID NO：8，在SEQ ID NO：5的左側(cè)加上AAAC四個堿基，在其右側(cè)加上一個G堿基即為SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：10和11退火形成的雙鏈DNA序列相較于SEQ ID NO：4和5帶有BspQI酶切位點；類似的，SEQ ID NO：12和13分別對應(yīng)于SEQ ID NO：6和7——在SEQ ID NO：6的左側(cè)加上TAGC、在其右側(cè)加上G堿基即為SEQ ID NO：12，在SEQ ID NO：7的左側(cè)加上AAAC四個堿基，在其右側(cè)加上一個G堿基即為SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：12和13退火形成的雙鏈DNA序列相較于SEQ ID NO：6和7帶有BspQI酶切位點。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在進行步驟(1)時，分別基于靶序列klenow1、klenow2和klenow3，設(shè)計合成能夠分別與klenow1、klenow2和klenow3結(jié)合的雙鏈DNA序列SEQ ID NO：2和3、SEQ ID NO：4和5以及SEQ ID NO：6和7；而考慮到后續(xù)需要通過酶切連接的方式將雙鏈DNA序列插入到sgRNA質(zhì)粒骨架(sgRNA-載體1)上去，因此分別在SEQ ID NO：2、4和6的左側(cè)加上TAGC，右側(cè)加上G堿基，分別在SEQ ID NO：2、4和6各自的反向互補序列左側(cè)需加上AAAC四個堿基，右側(cè)加上一個G堿基，即相應(yīng)獲得 SEQ ID NO：8和9、SEQ ID NO：10和11以及SEQ ID NO：12和13，磷酸化各鏈，以期退火形成的雙鏈DNA序列帶有BspQI酶切位點，幫助將SEQ ID NO：2、4和6分別插入到sgRNA質(zhì)粒骨架上。

依據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種DNA聚合酶I缺陷型菌株，其利用上述本發(fā)明一方面或者任一實施例的方法構(gòu)建獲得。DNA聚合酶I缺陷型菌株可以用來作為聚合酶突變體篩選的宿主細胞。相較于市面上現(xiàn)有的DNA聚合酶I缺陷型菌株，例如Addgene公司的JS200溫度敏感型DNA聚合酶I缺陷菌株，本發(fā)明這一方面的菌株不易老化，Pol I缺陷型基因型不易丟失，能很好的作為宿主細胞。

依據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供一種sgRNA表達質(zhì)粒，該sgRNA表達質(zhì)粒包含能夠結(jié)合上述本發(fā)明一方面或者任一實施例的方法中的靶序列的序列，即包含能結(jié)合klenow1、klenow2和klenow3至少之一的序列。在本發(fā)明的一些實施例中，構(gòu)建該sgRNA表達質(zhì)粒，包括：基于所述靶序列，獲得能夠與所述靶序列結(jié)合的雙鏈DNA序列；將雙鏈DNA序列連接到sgRNA-載體1上，以獲得所述sgRNA表達質(zhì)粒。sgRNA-載體1由sgRNA質(zhì)粒骨架或者說sgRNA序列和載體連接構(gòu)成，可以預(yù)先連接獲得保存，可以在構(gòu)建該表達質(zhì)粒時同時獲得，也可以通過市售獲得。該sgRNA表達質(zhì)粒可用于編輯宿主細胞靶序列區(qū)域，使宿主細胞的DNA聚合酶I突變。在本發(fā)明的一個實施例中，載體1為PSB1C3。

依據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供一種CRISPR系統(tǒng)，其包括上述本發(fā)明一方面的sgRNA表達質(zhì)粒，任選的還包括Cas9表達質(zhì)粒。在本發(fā)明的一個實施例中，Cas表達質(zhì)粒是由Cas9組蛋白連接在PSB1A2載體或者PSB2K3載體上構(gòu)成的。CRISPR系統(tǒng)能夠用于編輯宿主細胞中的DNA聚合酶I，使宿主突變，獲得DNA聚合酶I缺陷型菌株。因為該CRISPR系統(tǒng)以質(zhì)粒的形式存在，后續(xù)可以很方便獲得缺陷型菌株。

依據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提供上述本發(fā)明一方面的CRISPR系統(tǒng)在構(gòu)建DNA聚合酶I缺陷型菌株中的用途。

依據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提供一種用于構(gòu)建DNA聚合酶I缺陷型菌株的試劑盒，其包括上述本發(fā)明一方面的CRISPR系統(tǒng)，任選的還包括宿主細胞。利用本發(fā)明這一方面的試劑盒構(gòu)建得的缺陷型菌株，不易老化，Pol I缺陷型基因型不易丟失，能很好的作為宿主細胞。

附圖說明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施方式的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1是本發(fā)明一個實施例中的CRISPR系統(tǒng)的sgRNA質(zhì)粒圖譜；

圖2是本發(fā)明一個實施例中的CRISPR系統(tǒng)的Cas9質(zhì)粒圖譜；

圖3是本發(fā)明一個實施例中的對照組的CRISPR系統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率結(jié)果圖；圖3A顯示陰性對照結(jié)果，其左邊圖片為PSB1C3質(zhì)粒陰性對照，其右邊圖片為PSB2K3-J04450質(zhì)粒陰性對照；圖3B顯示陽性對照結(jié)果；

圖4是本發(fā)明一個實施例中的實驗組的CRISPR系統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率結(jié)果圖；圖4A、4B和4C分別顯示實驗組1、2和3結(jié)果，圖4A、4B和4C各自的右圖分別為各自的左圖的局部示意圖；

圖5是本發(fā)明一個實施例中的實驗組1獲得的菌株的klenow1區(qū)域的序列與原始序列的比對結(jié)果示意圖；

圖6是本發(fā)明一個實施例中的實驗組2獲得的菌株的klenow2區(qū)域的序列與原始序列的比對結(jié)果示意圖；

圖7是本發(fā)明一個實施例中的實驗組3獲得的菌株的klenow3區(qū)域的序列與原始序列的比對結(jié)果示意圖。

具體實施方式

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例提供的構(gòu)建DNA聚合酶I缺陷型菌株的方法，該方法基于CRISPR系統(tǒng)進行DNA聚合酶I缺陷型菌株的構(gòu)建，該方法以klenow1、klenow2和klenow3中的至少之一作為靶序列，所述klenow1為SEQ ID NO：1所示klenow片段中的第30-52位中的任意連續(xù)的20bp，所述klenow2為SEQ ID NO：1所示klenow片段中的第370-390位中的任意連續(xù)的20bp，所述klenow3為SEQ ID NO：1所示klenow片段中的第1048-1068位中的任意連續(xù)的20bp。所稱klenow1、klenow2和klenow3都是klenow片段(Klenow fragment)基因序列中的一段。Klenow片段，又名DNA聚合酶I大片段、克列諾片段(Klenow fragment)或克列諾酶(Klenow enzyme)，是E.coli DNA聚合酶I經(jīng)胰蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶部分水解生成的C末端605個氨基酸殘基片段。該片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。DNA聚合酶I(DNA-pol I)斷開后的存在另一個323個氨基酸殘基片段，保留5‘-3’外切酶活性。

所稱靶序列與CRISPR系統(tǒng)中的sgRNA靶序列是互補的，即如果靶序列在基因序列上，sgRNA靶序列則選擇其反義鏈。sgRNA靶序列一般長度為20bp，在PAM序列上游。在確定靶序列的過程中，發(fā)明人經(jīng)過多次設(shè)計和試驗摸索發(fā)現(xiàn)，使靶序列上的種子序列，即靠近3’端的12bp，不與目標基因上其他位置的序列完全一致，能夠獲得較好的工作效率；進 一步的，靶序列選擇目標基因序列上面-35到1/10基因序列全長區(qū)域內(nèi)的位置能夠獲得較好的工作效率。在本發(fā)明的一個實施例中，根據(jù)DNA聚合酶I不同區(qū)域的DNA序列設(shè)計sgRNA靶序列，每個區(qū)域設(shè)計一條sgRNA靶序列。klenow1、klenow2和klenow3是發(fā)明人經(jīng)過多次模擬和試驗確定的，目標基因序列上的這三個位置的至少之一都能使其對應(yīng)的CRISPR系統(tǒng)高成功率的獲得目標缺陷型菌株。

上述構(gòu)建DNA聚合酶I缺陷型菌株的方法，步驟簡單、敲除效率高、特異性好，可以很好的對菌株的基因組進行編輯，通過利用CRISPR系統(tǒng)對宿主菌株，例如大腸桿菌中的DNA聚合酶I序列的至少一部分進行編輯，即利用對多次篩選確定出的Klenow片段基因序列上的特定位置——klenow1、klenow2和klenow3中的至少之一進行切割，使菌株突變成DNA聚合酶I缺陷。通過該方法的利用CRISPR系統(tǒng)來獲得DNA聚合酶缺陷型菌株，耗時短，成功率高，且CRISPR系統(tǒng)構(gòu)建好后，目標缺陷型菌株容易獲得。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述klenow1為SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第33-52位，所述klenow2為SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第371-390位，所述klenow3為SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第1049-1068位。klenow1、klenow2和klenow3是發(fā)明人多次模擬和試驗確定的，目標基因序列上的這三個位置的至少之一都能使利用的CRISPR系統(tǒng)高成功率的獲得目標缺陷型菌株。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述方法包括以下步驟：(1)基于所述靶序列，獲得能夠與所述靶序列結(jié)合的雙鏈DNA序列；(2)構(gòu)建以獲得所述CRISPR系統(tǒng)，所述CRISPR系統(tǒng)包括sgRNA表達質(zhì)粒和Cas9表達質(zhì)粒，其中，構(gòu)建所述sgRNA表達質(zhì)粒包括，將(1)中的雙鏈DNA序列連接到sgRNA-載體1上，以獲得所述sgRNA表達質(zhì)粒，構(gòu)建所述Cas9表達質(zhì)粒包括，將Cas9連接到載體2上，以獲得所述Cas9表達質(zhì)粒；(3)利用(2)中的CRISPR系統(tǒng)染所述菌株的感受態(tài)細胞，以獲得所述DNA聚合酶I缺陷型菌株。較佳的，所述sgRNA-載體1所使用的載體1和所述載體2具有不同的復(fù)制起始子，這樣，利于避開共轉(zhuǎn)染兩個質(zhì)粒時兩個質(zhì)粒之間的競爭，避免感受態(tài)細胞中只存留一個質(zhì)粒。

較佳的，載體1和載體2是不同的。在本發(fā)明的一個實施例中，其中的一個可以為PSB1A2和PSB1C3中的一個，另一個為PSB2K3，因為PSB1A2和PSB1C3的復(fù)制起始子都是pMB1，而PSB2K3的復(fù)制起始子與它們不同。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述菌株為大腸桿菌，包括但不限于XL-10和DH5a。在篩選聚合酶突變體時，一般需要把菌株本身的聚合酶給突變掉，而大腸桿菌的聚合酶I和要篩選的聚合酶klenow片段結(jié)構(gòu)功能相似，并且實驗證明失活聚合酶I后大腸桿菌細胞不會死亡，只會生長緩慢，因此可以選用大腸桿菌。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，能夠與klenow1結(jié)合的雙鏈DNA序列的互補的兩條鏈分別為SEQ ID NO：2和3，能夠與klenow2結(jié)合的雙鏈DNA序列的兩條鏈分別為SEQ ID NO：4和5，能夠與klenow3結(jié)合的雙鏈DNA序列的兩條鏈分別為SEQ ID NO：6和7。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施例，能夠與klenow1結(jié)合的雙鏈DNA序列的兩條鏈分別為SEQ ID NO：8和9，能夠與klenow2結(jié)合的雙鏈DNA序列的兩條鏈分別為SEQ ID NO：10和11，能夠與klenow3結(jié)合的雙鏈DNA序列的兩條鏈分別為SEQ ID NO：12和13。其中，SEQ ID NO：8和9分別對應(yīng)于SEQ ID NO：2和3——在SEQ ID NO：2的左側(cè)加上TAGC、在其右側(cè)加上G堿基即為SEQ ID NO：8，在SEQ ID NO：3的左側(cè)加上AAAC四個堿基，在其右側(cè)加上一個G堿基即為SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：8和9退火形成的雙鏈DNA序列相較于SEQ ID NO：2和3帶有BspQI酶切位點；類似的，SEQ ID NO：10和11分別對應(yīng)于SEQ ID NO：4和5——在SEQ ID NO：4的左側(cè)加上TAGC、在其右側(cè)加上G堿基即為SEQ ID NO：8，在SEQ ID NO：5的左側(cè)加上AAAC四個堿基，在其右側(cè)加上一個G堿基即為SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：10和11退火形成的雙鏈DNA序列相較于SEQ ID NO：4和5帶有BspQI酶切位點；類似的，SEQ ID NO：12和13分別對應(yīng)于SEQ ID NO：6和7——在SEQ ID NO：6的左側(cè)加上TAGC、在其右側(cè)加上G堿基即為SEQ ID NO：12，在SEQ ID NO：7的左側(cè)加上AAAC四個堿基，在其右側(cè)加上一個G堿基即為SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：12和13退火形成的雙鏈DNA序列相較于SEQ ID NO：6和7帶有BspQI酶切位點。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在進行步驟(1)時，分別基于靶序列klenow1、klenow2和klenow3，設(shè)計合成能夠分別與klenow1、klenow2和klenow3結(jié)合的雙鏈DNA序列SEQ ID NO：2和3、SEQ ID NO：4和5以及SEQ ID NO：6和7；而考慮到后續(xù)需要通過酶切連接的方式將雙鏈DNA序列插入到sgRNA質(zhì)粒骨架或者sgRNA-載體1上去，因此分別在SEQ ID NO：2、4和6的左側(cè)加上TAGC，右側(cè)加上G堿基，分別在SEQ ID NO：2、4和6各自的反向互補序列左側(cè)需加上AAAC四個堿基，右側(cè)加上一個G堿基，即相應(yīng)獲得SEQ ID NO：8和9、SEQ ID NO：10和11以及SEQ ID NO：12和13，磷酸化各鏈，以期退火形成的雙鏈DNA序列帶有BspQI酶切位點，幫助將SEQ ID NO：2、4和6分別插入到sgRNA質(zhì)粒骨架上。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，也可以在序列的左右兩端加上其它堿基，使得退火形成的序列具有相對應(yīng)的酶切位點，較佳的，所利用的酶的酶切位點和識別位點相同。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，提供一種DNA聚合酶I缺陷型菌株，其利用上述本發(fā)明任一實施例的方法構(gòu)建獲得。DNA聚合酶I缺陷型菌株可以用來作為聚合酶突變體篩選的宿 主細胞。相較于市面上現(xiàn)有的DNA聚合酶I缺陷型菌株，例如Addgene公司的JS200溫度敏感型DNA聚合酶I缺陷菌株，本發(fā)明這一方面的菌株不易老化，Pol I缺陷型基因型不易丟失，能很好的作為宿主細胞。

根據(jù)本發(fā)明的的一個實施例，提供一種sgRNA表達質(zhì)粒，該sgRNA表達質(zhì)粒包含能夠結(jié)合上述本發(fā)明任一實施例的方法中的靶序列的序列，即其sgRNA靶序列為能結(jié)合klenow1、klenow2和klenow3中的至少之一。在本發(fā)明的一些實施例中，構(gòu)建該sgRNA表達質(zhì)粒，包括：基于所述靶序列，獲得能夠與所述靶序列結(jié)合的雙鏈DNA序列；將雙鏈DNA序列連接到sgRNA-載體1上，以獲得所述sgRNA表達質(zhì)粒。sgRNA-載體1由sgRNA質(zhì)粒骨架或者說sgRNA序列和載體連接構(gòu)成，可以預(yù)先連接獲得保存，可以在構(gòu)建該表達質(zhì)粒時同時獲得，也可以通過市售獲得。該sgRNA表達質(zhì)粒可用于編輯宿主細胞靶序列區(qū)域，使宿主細胞的DNA聚合酶I突變。在本發(fā)明的一個實施例中，載體1為PSB1C3。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，提供一種CRISPR系統(tǒng)，其包括上述本發(fā)明的實施例中的sgRNA表達質(zhì)粒，任選的還包括Cas9表達質(zhì)粒。sgRNA表達質(zhì)?？蓞⒄丈鲜鰧嵤├@得。在本發(fā)明的一個實施例中，Cas表達質(zhì)粒是由Cas9組蛋白連接在PSB1A2載體或者PSB2K3載體上構(gòu)成的。CRISPR系統(tǒng)能夠用于編輯宿主細胞中的DNA聚合酶I，使宿主突變，獲得DNA聚合酶I缺陷型菌株。因為該CRISPR系統(tǒng)以質(zhì)粒的形式存在，后續(xù)可以很方便獲得缺陷型菌株。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，提供上述本發(fā)明實施例的CRISPR系統(tǒng)在構(gòu)建DNA聚合酶I缺陷型菌株中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，提供一種用于構(gòu)建DNA聚合酶I缺陷型菌株的試劑盒，其包括上述本發(fā)明上述實施例中的CRISPR系統(tǒng)，任選的還包括宿主細胞，例如大腸桿菌。利用本發(fā)明這一方面的試劑盒構(gòu)建得的缺陷型菌株，不易老化，Pol I缺陷型基因型不易丟失，能很好的作為聚合酶突變體篩選的宿主細胞。

以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的構(gòu)建DNA聚合酶I缺陷型菌株的方法、CRISPR系統(tǒng)、sgRNA表達質(zhì)粒、試劑盒等進行詳細的描述。下面示例，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多個”的含義是兩個或兩個以上。

除另有交待，以下實施例中涉及的未特別交待技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照《分子克隆實驗指南》第三版或者相關(guān)產(chǎn)品說明書進行，未特別交待的試劑、序列、載體和細胞等也均為可商業(yè)獲得的。未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公職的常規(guī)方法，所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出 現(xiàn)時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內(nèi)容相同。

實施例一

構(gòu)建DNA聚合酶I缺陷型菌株的方法，一般包括：

1.sgRNA靶序列設(shè)計及雙鏈DNA序列合成

根據(jù)DNA聚合酶I不同區(qū)域的DNA序列設(shè)計sgRNA靶序列，每個區(qū)域設(shè)計一條sgRNA靶序列。sgRNA靶序列要求：長度為20bp，在PAM序列上游；如果靶序列在基因序列上，sgRNA靶序列需要選擇反義鏈；靶序列上的種子序列(靠近3’端的12bp)必須不能和基因組上其他位置的序列完全一致；靶序列最好選擇基因上面-35到1/10基因全長區(qū)域內(nèi)的位置來獲得最好的工作效率。

2.CRISPR系統(tǒng)構(gòu)建

2.1sgRNA組件構(gòu)建

sgRNA組件的質(zhì)粒上靶序列區(qū)域可以通過酶切連接置換掉。因此在合成靶序列時，左右兩端要加上合適的酶切位點。

在收到合成的靶序列后，合成的單鏈序列要進行磷酸化處理，然后進行退火處理。然后通過酶切連接，將靶序列插入到sgRNA質(zhì)粒骨架上。

2.2Cas9組件構(gòu)建

將Cas9組件通過酶切連接換到合適的載體上，以便能完成和sgRNA組件的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化。

3.CRISPR系統(tǒng)轉(zhuǎn)化XL-10感受態(tài)細胞，檢測CRISPR系統(tǒng)的工作效率

sgRNA組件和Cas9組件共轉(zhuǎn)化DH5a和XL-10感受態(tài)細胞，通過對Cas9表達量的調(diào)控來檢測CRISPR系統(tǒng)的工作效率。

4.測序驗證缺陷型菌株是否成功構(gòu)建

利用上述CRISPR系統(tǒng)能夠快速、有效、高精度的獲得DNA聚合酶I缺陷型大腸桿菌菌株。該方法步驟簡單、敲除效率高、特異性好，可以很好的對大腸桿菌的基因組進行編輯，且因為CRISPR系統(tǒng)以質(zhì)粒的形式存在，后續(xù)可以很方便獲得缺陷型菌株。

實施例二

1.sgRNA靶序列設(shè)計及合成

因為想要用缺陷型大腸桿菌作為宿主細胞來篩選聚合酶突變體，因此需要把大腸桿菌本身的聚合酶給突變掉。大腸桿菌的聚合酶I和要篩選的聚合酶結(jié)構(gòu)功能相似，并且實驗證明失活聚合酶I后細胞不會死亡，只會生長緩慢，因此考慮突變大腸桿菌聚合酶I。

從klenow fragment的前中部分分別選取了三個位置作為靶序列，標記為klenow1、 klenow2、klenow3。

klenow片段全場1818bp，klenow片段DNA序列如下所示：5’-GTGATTTCTTATGACAACTACGTCACCATCCTTGATGAAGAAACACTGAAAGCGTGGATTGCGAAGCTGGAAAAAGCGCCGGTATTTGCATTTGATACCGAAACCGACAGCCTTGATAACATCTCTGCTAACCTGGTCGGGCTTTCTTTTGCTATCGAGCCAGGCGTAGCGGCATATATTCCGGTTGCTCATGATTATCTTGATGCGCCCGATCAAATCTCTCGCGAGCGTGCACTCGAGTTGCTAAAACCGCTGCTGGAAGATGAAAAGGCGCTGAAGGTCGGGCAAAACCTGAAATACGATCGCGGTATTCTGGCGAACTACGGCATTGAACTGCGTGGGATTGCGTTTGATACCATGCTGGAGTCCTACATTCTCAATAGCGTTGCCGGGCGTCACGATATGGACAGCCTCGCGGAACGTTGGTTGAAGCACAAAACCATCACTTTTGAAGAGATTGCTGGTAAAGGCAAAAATCAACTGACCTTTAACCAGATTGCCCTCGAAGAAGCCGGACGTTACGCCGCCGAAGATGCAGATGTCACCTTGCAGTTGCATCTGAAAATGTGGCCGGATCTGCAAAAACACAAAGGGCCGTTGAACGTCTTCGAGAATATCGAAATGCCGCTGGTGCCGGTGCTTTCACGCATTGAACGTAACGGTGTGAAGATCGATCCGAAAGTGCTGCACAATCATTCTGAAGAGCTCACCCTTCGTCTGGCTGAGCTGGAAAAGAAAGCGCATGAAATTGCAGGTGAGGAATTTAACCTTTCTTCCACCAAGCAGTTACAAACCATTCTCTTTGAAAAACAGGGCATTAAACCGCTGAAGAAAACGCCGGGTGGCGCGCCGTCAACGTCGGAAGAGGTACTGGAAGAACTGGCGCTGGACTATCCGTTGCCAAAAGTGATTCTGGAGTATCGTGGTCTGGCGAAGCTGAAATCGACCTACACCGACAAGCTGCCGCTGATGATCAACCCGAAAACCGGGCGTGTGCATACCTCTTATCACCAGGCAGTAACTGCAACGGGACGTTTATCGTCAACCGATCCTAACCTGCAAAACATTCCGGTGCGTAACGAAGAAGGTCGTCGTATCCGCCAGGCGTTTATTGCGCCAGAGGATTATGTGATTGTCTCAGCGGACTACTCGCAGATTGAACTGCGCATTATGGCGCATCTTTCGCGTGACAAAGGCTTGCTGACCGCATTCGCGGAAGGAAAAGATATCCACCGGGCAACGGCGGCAGAAGTGTTTGGTTTGCCACTGGAAACCGTCACCAGCGAGCAACGCCGTAGCGCGAAAGCGATCAACTTTGGTCTGATTTATGGCATGAGTGCTTTCGGTCTGGCGCGGCAATTGAACATTCCACGTAAAGAAGCGCAGAAGTACATGGACCTTTACTTCGAACGCTACCCTGGCGTGCTGGAGTATATGGAACGCACCCGTGCTCAGGCGAAAGAGCAGGGCTACGTTGAAACGCTGGACGGACGCCGTCTGTATCTGCCGGATATCAAATCCAGCAATGGTGCTCGTCGTGCAGCGGCTGAACGTGCAGCCATTAACGCGCCAATGCAGGGAACCGCCGCCGACATTATCAAACGGGCGATGATTGCCGTTGATGCGTGGTTACAGGCTGAGCAACCGCGTGTACGTATGATCATGCAGGTACACGATGAACTGGTATTTGAAGTTCATAAAGATGATGTTGATGCCGTCGCGAAGCAGATTCATCAACTGATGGAAAACTGTACCCGTCTGGATGTGCCGTTGCTGGTGGAAGTGGGGAGTGGCGAAAACTGGGATCAGGCGCACTAA-3’(SEQ ID NO：1)。

klenow1片段距離其起始密碼子約30bp，sgRNA靶序列為5’-CTTTCAGTGTTTCTTCATCA-3’(SEQ ID NO：2)，反向互補序列為5’-TGATGAAGAAACACTGAAAG-3’(SEQ ID NO：3)；klenow2片段距離起始密碼子約370bp，靶序列為5’-GGCAACGCTATTGAGAATGT-3’(SEQ ID NO：4)，反向互補序列為5’-ACATTCTCAATAGCGTTGCC-3’(SEQ ID NO：5)；klenow3片段距離起始密碼子約1048bp，靶序列為5’-AATGTTTTGCAGGTTAGGAT-3’(SEQ ID NO：6)，反向互補序列為5’-ATCCTAACCTGCAAAACATT-3’(SEQ ID NO：7)。因為后續(xù)需要通過酶切連接的方式將靶序列oligo插入到sgRNA質(zhì)粒骨架上去，因此sgRNA靶序列左側(cè)需要加上TAGC，右側(cè)加上G堿基，反向互補序列左側(cè)需加上AAAC四個堿基，右側(cè)加上一個G堿基，即對應(yīng)獲得5’-TAGCCTTTCAGTGTTTCTTCATCAG-3’(SEQ ID NO：8)，反向互補序列為5’-AAACTGATGAAGAAACACTGAAAGG-3’(SEQ ID NO：9)；klenow2片段距離起始密碼子約370bp，靶序列為5’-TAGCGGCAACGCTATTGAGAATGTG-3’(SEQ ID NO：10)，反向互補序列為5’-AAACACATTCTCAATAGCGTTGCCG-3’(SEQ ID NO：11)；klenow3片段距離起始密碼子約1048bp，靶序列為5’-TAGCAATGTTTTGCAGGTTAGGATG-3’(SEQ ID NO：12)，反向互補序列為5’-AAACATCCTAACCTGCAAAACATTG-3’(SEQ ID NO：13)。這樣后期經(jīng)退火后可以組成BspQI酶切位點，幫助將sgRNA靶序列oligo插入到sgRNA質(zhì)粒骨架上。

2.CRISPR系統(tǒng)構(gòu)建

通過以下構(gòu)建得的sgRNA表達質(zhì)粒和Cas9表達質(zhì)粒各自的質(zhì)粒圖譜分別如圖1和圖2所示。

2.1sgRNA組件構(gòu)建

2.1.1合成的靶序列oligo和反向互補序列磷酸化處理、退火處理

反應(yīng)體系為：

55℃反應(yīng)30min后，將PCR管放于80℃水浴中10min，終止磷酸化反應(yīng)，然后放置于室溫進行退火，使PCR管溫度恢復(fù)至室溫，完成退火處理。其中的sgRNA-Primer-F為SEQ ID NO：8、10或12，相應(yīng)的sgRNA-Primer-R為SEQ ID NO：9、11或13。

2.1.2sgRNA質(zhì)粒骨架BspQI酶切

sgRNA質(zhì)粒骨架連在PSB1C3載體(來自iGEM，氯霉素抗性)上，所有來自iGEM的載體都有EcoRI、PstI、SpeI、XbaI四個通用酶切位點，以便DNA插入片段在不同的載體上進行切換。而sgRNA質(zhì)粒骨架上靶序列的位置有BspQI酶切位點，方便將不同的上步退火得的靶序列連入該質(zhì)粒骨架上。

反應(yīng)體系為：

BspQI 2ul

10xCutsmart Buffer 2ul

pSB1C3-sgRNA cassette 1ug

ddH₂O 補充至20ul

50℃反應(yīng)2h。1％瓊脂糖膠跑電泳(150V，30min)，EB染色10min，切膠回收。

2.1.3靶序列oligo連接入上步的酶切開的sgRNA質(zhì)粒骨架

通過T4 DNA ligase的作用將靶序列oligo連接到PSB1C3-sgRNA質(zhì)粒骨架上。

反應(yīng)體系為：

2x Rapid ligation buffer 10ul

T4 DNA ligase 1ul

PSB1C3-sgRNA質(zhì)粒骨架 10ng

靶序列oligo 50ng

ddH₂O 補足至20ul

20℃反應(yīng)2h。

2.1.4連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞

從-80℃冰箱拿出DH5a感受態(tài)細胞(100ul)，置于冰上10min。然后向感受態(tài)細胞中加入10ul連接產(chǎn)物，輕輕混勻，置于冰上靜置30min。然后42℃熱擊90s，再置于冰上5min，后在超凈臺內(nèi)加入800ul SOC無抗培養(yǎng)基。37℃，200rpm培養(yǎng)45min，使細胞恢復(fù)。然后取100ul，涂氯霉素平板。平板置于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

2.1.5提質(zhì)粒，送樣測序

從平板上挑單菌落，置于5ml氯霉素液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm過夜培養(yǎng)，sgRNA表達質(zhì)粒小提，送樣測序。

2.2Cas9組件構(gòu)建

Cas9組件連接在PSB1A2載體(來自iGEM，氨芐抗性)上，而PSB1A2和PSB1C3的復(fù)制起始子都是pMB1，如果將兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化的話，因為它們使用相同的復(fù)制機制， 可能會引起質(zhì)粒之間的競爭，而導(dǎo)致感受態(tài)細胞中只存留一個質(zhì)粒。因此考慮將Cas9組件連接到PSB2K3載體上(來自iGEM，卡那抗性，P1及F’復(fù)制起始子)。

2.2.1PSB1A2-Cas9骨架及PSB2K3載體酶切

載體骨架反應(yīng)體系：

PSB2K3 1ug

SpeI 3ul

PstI 2ul

NEB 2.1 2ul

ddH₂O 補足至20ul

PSB1A2-Cas9酶切體系：

PSB1A2-Cas9 1ug

PstI 2ul

XbaI 1.5ul

NEB2.1 2ul

ddH₂O 補足至20ul

37℃反應(yīng)2h。1％瓊脂糖膠跑電泳(150V，30min)，EB染色10min，切膠回收。

2.2.2Cas9組件連接PSB2K3載體

反應(yīng)體系為：

2xRapid ligation buffer 10ul

T4 DNA ligase 1ul

PSB2K3 10ng

Cas9 30ng

ddH₂O 補足至20ul

20℃，反應(yīng)2h。

2.2.3連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞

從-80°冰箱拿出DH5a感受態(tài)細胞(100ul)，置于冰上10min。然后向感受態(tài)細胞中加入10ul連接產(chǎn)物，輕輕混勻，置于冰上靜置30min。然后42℃熱擊90s，再置于冰上5min，后在超凈臺內(nèi)加入800ul SOC無抗培養(yǎng)基。37℃，200rpm培養(yǎng)45min，使細胞恢復(fù)。然后取100ul，涂卡那抗性平板。平板置于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

2.2.4提質(zhì)粒，送樣測序

從平板上挑單菌落，置于5ml卡那霉素液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm過夜培養(yǎng)，質(zhì)粒小提，送樣測序。測序結(jié)果如預(yù)期。

3.CRISPR系統(tǒng)轉(zhuǎn)化XL-10感受態(tài)細胞，檢測CRISPR系統(tǒng)的工作效率

配制Kan/Chl雙抗板，Kan終濃度為50ug/ml，Chl終濃度為17ug/ml。

共轉(zhuǎn)化體系：

陰性對照：PSB1C3質(zhì)粒，PSB2K3-J04450質(zhì)粒

陽性對照：PSB1C3&PSB2K3-J04450質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化

實驗組1：PSB2K3-Cas9&PSB1C3-klenow1共轉(zhuǎn)化

實驗組2：PSB2K3-Cas9&PSB1C3-klenow2共轉(zhuǎn)化

實驗組3：PSB2K3-Cas9&PSB1C3-klenow3共轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化時質(zhì)粒各轉(zhuǎn)50ng，從-80°冰箱拿出XL-10感受態(tài)細胞(100ul)，置于冰上10min。然后向感受態(tài)細胞中加入50ng質(zhì)粒，輕輕混勻，置于冰上靜置30min。然后42℃熱擊90s，再置于冰上5min，后在超凈臺內(nèi)加入800ul SOC無抗培養(yǎng)基。37℃，200rpm培養(yǎng)45min，使細胞恢復(fù)。然后取100ul，涂卡那/氯霉素雙抗性平板，涂板時，實驗組的平板上加上終濃度為0.1mM的IPTG，以及aTc來啟動PSB2K3載體的高拷貝復(fù)制(PSB2K3載體上有兩個復(fù)制起始子，在一般情況下，受F’起始子調(diào)控，產(chǎn)生低拷貝質(zhì)粒，而在IPTG的誘導(dǎo)下，P1起始子被啟動，產(chǎn)生高拷貝質(zhì)粒)以及解除對Cas9組件的抑制(Cas9組件本身受PLtetO-1啟動子調(diào)控，此啟動子受TetR抑制子的抑制，在aTc存在的情況下，TetR不能再抑制PLtetO-1啟動子，Cas9組件被表達)。平板置于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

實驗結(jié)果如圖3和圖4所示，圖3顯示對照組的菌落生長情況。圖3A顯示陰性對照無菌落長出，圖3A的左圖為PSB1C3質(zhì)粒陰性對照，圖3A的右圖為PSB2K3-J04450質(zhì)粒陰性對照；圖3B顯示陽性對照菌落生長情況，由圖3B可看出陽性對照有大量菌落長出，說明抗性板正常，質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化效率正常。圖4顯示實驗組菌落生長情況，圖示顯示實驗組也有菌落長出，只是相較陽性對照，菌落極小，說明CRISPR系統(tǒng)發(fā)揮作用，菌落生長受到限制，生長緩慢。圖4A-C分別對應(yīng)實驗組1-3，圖4A-C的右圖分別為左圖的局部放大，對比圖4A、4B和4C，可看出和klenow1、klenow2相比，klenow3的菌落雖然不及陽性對照菌落大小，但是比klenow1、klenow2菌落都大，說明它對DNA聚合酶I的作用小于klenow1/klenow2。

4.測序驗證缺陷型菌株是否成功構(gòu)建

對各實驗組的菌株的目標區(qū)域進行測序。

測序結(jié)果證明了各實驗組獲得的菌株均為DNA聚合酶I缺陷型菌株。

圖5-7分別顯示各測序結(jié)果與參考序列(原始序列)的比對結(jié)果。圖5顯示實驗組1獲得的菌株的klenow1區(qū)域的測序序列與原始序列(DNA Pol I區(qū)域)的比對情況。圖6顯 示實驗組2獲得的菌株的klenow2區(qū)域的測序序列與原始序列(DNA Pol I區(qū)域)的比對情況。圖7顯示實驗組3獲得的菌株的klenow3區(qū)域的測序序列與原始序列(DNA Pol I區(qū)域)的比對情況。圖5-7中顯示的每兩行序列比對，上邊一行是測序結(jié)果，下邊一行是DNA Pol I原始序列，帶下劃線標記的位點表示突變位點，這些單核苷酸個位點的突變編碼終止密碼子，使菌株失去全部或部分DNA Pol I酶功能。

實施例三

sgRNA表達質(zhì)粒。可參照實施例二中的2.1構(gòu)建獲得該sgRNA表達質(zhì)粒。

實施例四

可用于構(gòu)建DNA聚合酶I缺陷型菌株的試劑盒，該試劑盒包括CRISPR系統(tǒng)。CRISPR系統(tǒng)參照實施例二構(gòu)建。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。