知母皂苷n在制備防治糖尿病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及知母皂苷N在制備防治糖尿病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病，古稱消渴癥，即消瘦煩渴之意，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)它是一種常見的內(nèi)分泌疾 病，是由于人體內(nèi)胰島素絕對或相對缺乏而引起的血中葡萄糖濃度升高，進(jìn)而糖大量從尿 中排出，并出現(xiàn)多飲、多尿、多食、消瘦、頭暈、乏力等癥狀。進(jìn)一步發(fā)展則引起全身各種嚴(yán)重 的急、慢性并發(fā)癥，威脅身體健康。糖尿病通常分為1型糖尿病和2型糖尿病兩種。在糖尿病 患者中，II型糖尿病占了大多數(shù)。糖尿病患者如得不到很好地控制，進(jìn)一步發(fā)展則引起全身 各種嚴(yán)重的急、慢性并發(fā)癥，可導(dǎo)致眼、腎、神經(jīng)、皮膚、血管和心臟等組織、器官的慢性并發(fā) 癥，以致最終發(fā)生失明、下肢壞疽、尿毒癥、腦中風(fēng)或心肌梗死，嚴(yán)重威脅身體健康。
[0003] 糖尿病是一種常見病，隨著人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率在逐年增加。近 年來，我國糖尿病患病率顯著升高，患者人數(shù)達(dá)9000多萬。
[0004] 糖尿病的治療是一個漫長的過程，其治療方法有很多種，包括糖尿病中醫(yī)治療，西 醫(yī)治療，胰島素治療等。目前國內(nèi)常用的口服降糖藥物分為促胰島素分泌劑類、胰島素增敏 劑、糖苷酶抑制劑和高糖損傷修復(fù)劑等，如格列本脲、二甲雙胍類、阿卡波糖和羥苯磺酸 鈣等。合成的各類型藥物或療效有限，或毒副作用明顯，近年來，中藥在糖尿病的臨床治療 中顯示出很大優(yōu)勢。但現(xiàn)有中成藥或大多有效成分不清，或作用機(jī)理不明了，急待開發(fā)出有 效成分明確、作用機(jī)理清楚、質(zhì)量穩(wěn)定可控的中藥制劑。
[0005] 中藥知母清熱瀉火，生津潤燥，主要具有抗菌、抗病毒、解熱、降血糖等作用。到目 前為止，已有了知母皂苷BII、知母皂苷All I和芒果苷抗糖尿病方面的活性，對知母皂苷N的 活性報道較少，Yokosuka等在其文章 【Steroidal glycosides from the underground parts of Yucca glauca and their cytotoxic activities.Phytochemistry.2014 (101): 109-115】中報道了它對HL-60細(xì)胞和A549細(xì)胞毒作用；尚未見知母皂苷N[分子式為 C45H76O3q，分子量為936，化學(xué)名為(25S) -26-0-f3-D-吡喃葡糖基-22-羥基-5β-呋留-2β，3β， 26-三醇-3-0-?Η)_吡喃葡糖基-(1-2)-?Η)-吡喃半乳糖苷]治療糖尿病方面的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供知母皂苷N在制備防治糖尿病藥物中的應(yīng)用。經(jīng)體內(nèi)、外藥 理試驗，所得知母皂苷N具有多種不同途徑的顯著性降糖作用。
[0007] 為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 知母皂苷N在制備防治糖尿病藥物中的應(yīng)用。
[0009] 所述的藥物為能夠提高高糖損傷細(xì)胞的細(xì)胞活力和NO分泌量的藥物。
[0010] 所述的藥物為能夠提高機(jī)體胰島素的分泌能力的藥物。
[0011]所述的藥物為能夠提高機(jī)體葡萄糖消耗量，改善胰島素抵抗作用的藥物。
[0012]所述的藥物為能夠抑制α-葡萄糖苷酶的活性的藥物。
[0013] 所述的藥物包括知母皂苷N和藥學(xué)上可接受的載體或者常規(guī)食用輔料。所述藥物 劑型為口服劑型。
[0014] 所述的知母皂苷N可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)公開的方法(例如，馬百平，知母中的 兩種新呋留皂苷，藥學(xué)學(xué)報，2006,41(6):527-532)進(jìn)行制備，也可以采用其他方法自行制 備。
[0015] 本發(fā)明采用上述方法提取得到的知母皂苷N首先進(jìn)行體內(nèi)、體外藥效實驗:知母皂 苷N對高糖誘導(dǎo)的HUVEC損傷模型細(xì)胞活力和NO分泌量的影響實驗，結(jié)果表明知母皂苷N對 高糖誘導(dǎo)的HUVEC損傷模型細(xì)胞活力有明顯的增強(qiáng)作用，對NO分泌量有顯著性的提高作用； 知母皂苷N對RIN細(xì)胞胰島素分泌的影響實驗，結(jié)果顯示知母皂苷N能顯著增加 RIN細(xì)胞胰島 素的分泌能力，其作用與格列本脲相當(dāng)；知母皂苷N對棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗 模型葡萄糖消耗量的影響實驗，結(jié)果顯示知母皂苷N能限制性地促進(jìn)HepG2細(xì)胞對葡萄糖的 消耗量，具有改善胰島素抵抗的作用;體外α-葡萄糖苷酶抑制實驗，觀察該化合物對α-葡萄 糖苷酶抑制率來得出其抑制效果，結(jié)果表明，知母皂苷N體外抑制α-葡萄糖苷酶的活性作用 顯著。體內(nèi)試驗:結(jié)果表明知母皂苷N對四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠具有顯著性降糖作用。
[0016] 本發(fā)明的有益效果：
[0017] 該發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)該化合物在體內(nèi)外表現(xiàn)出了很好的防治糖尿病活性，有可能成為 未來治療糖尿病的有效藥物。
【附圖說明】
[0018] 圖1為大鼠胰島素 ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。
[0020] 實驗材料
[00211 細(xì)胞株:RIN-m5F大鼠胰島瘤細(xì)胞(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué) 細(xì)胞中心）；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC，來源ATCC); !fepG2人肝癌細(xì)胞(來源ATCC)。
[0022] 試藥:4-硝基酚-α-D吡喃葡萄糖苷(alfa aesar，批號：110906);α-葡萄糖苷酶（日 本TCI，批號：120527);阿卡波糖片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：117893); 1640培養(yǎng)基 (Gibco，批號：1229728);高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，批號：991030);格列本脲(天津太平洋制 藥有限公司，批號：110706);大鼠胰島素 ELISA試劑盒(Merckmili pore，批號：1311756);胰 蛋白酶(Amresco，批號：27250018) ;FBS(Thermo Fisher，批號：NVM0344);MTT(Ameresco,批 號：M21128) ;DMS0(Solarbio,批號：302A034);青霉素（Solarbio，批號：119A031);鏈霉素 (Solarbio，批號：423A054)Na 2HP〇4 · 12H20(南京化學(xué)試劑有限公司，批號：090902);KH2PCk (南京化學(xué)試劑有限公司，批號：090922 ); NaCl (南京化學(xué)試劑有限公司，批號： 09060310494) ;KC1(南京化學(xué)試劑有限公司，批號:060960239);阿卡波糖片(北京拜耳醫(yī)藥 保健有限公司，批號：117893);羥苯磺酸鈣(利君制藥有限公司，批號：1202023);鹽酸二甲 雙胍(京豐制藥有限公司，批號：120915);知母(產(chǎn)地河北，購于中國中藥材配送網(wǎng)，經(jīng)鑒定 為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge ·的干燥根莖）；知母阜苷N(自制，純度 為 95%)。
[0023]儀器：HERA?Cell 1?50型細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Electron Corporation，USA) ;RT_ 6000型酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科技有限公司）；超凈工作臺（蘇州艾可林凈化設(shè)備有限公 司）；⑶IC XDS-IB型倒置光學(xué)顯微鏡(重慶光電儀器有限公司）；BS124S型萬分之一電子天 平（Sartorius，USA); YXQ · SG41 · 280型高壓滅菌鍋(上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司）； 79-1型磁力攪拌器(深圳國華儀器有限公司）；0412-1型離心機(jī)(上海醫(yī)療器械有限公司）； 微量移液器(Thermo Electron Corporation，USA);96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Caster公司）。
[0024] 知母皂苷N的制備過程：
[0025] 取知母藥材2.0千克，以20升90% (v/v)乙醇回流提取三次，每次回流2小時，過濾， 合并濾液。回收乙醇，減壓濃縮至5L，再加水15L稀釋濃縮液，至體積濃度為0.1 g生藥/mL，溶 液進(jìn)行過濾，濾液待上樣。將預(yù)先處理好的大孔吸附樹脂HP20(北京綠百草科技發(fā)展有限公 司）裝柱（5L)，放置平衡后，濾液上樣。上樣之后依次用6倍柱體積(6BV)的水洗脫除雜，用 6BV的30%(v/v)乙醇洗脫除雜、用6BV的50%(v/v)乙醇洗脫，最后用3BV的95%(v/v)乙醇 洗脫下柱，經(jīng)檢測知母皂苷N主要集中于50% (v/v)乙醇部分，此部分洗脫液回收乙醇，濃縮 至小體積，真空干燥得知母皂苷N粗樣品146g。
[0026] 取粗樣品其中140g溶解于200ml水溶液，通入50% (v/v)甲醇平衡好的ODS柱(5L)， 用50 %甲醇（20000ml)洗脫，收集洗脫液，每份1000 mL，HPLC檢測各份純度，將8-15份合并， 回收甲醇，濃縮至小體積，干燥得知母皂苷N 5.8g。產(chǎn)品收率為知母藥材的0.29 %，HPLC檢 測純度為95%。知母皂苷N的結(jié)構(gòu)鑒定:利用質(zhì)譜和核磁等手段進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果如下： HR-ESI-MS(negative mode)m/z:935.4959[M-H] - (calcd.935.4852) ,1H-MffiHOOMHz, C5D5N)55.27(lH,d,J = 7.7Hz,Glc 1H) ,4.94(lH,d ,J = 7.6Hz ,gal 1-H) ,4.80(lH,d J = 7.7Hz，Glc 1-H)，1.02(3H，d，J = 5.9Hz，27-CH3)，0.95(3H，s，19-CH3)，0.85(3H，s，）·其中δ 5.27(d，J = 7.7Hz，lH)，4.94(d，J = 7.6Hz，lH)，4.80(d，J = 7.7Hz，lH)為 3 個六碳糖端基質(zhì) 子的信號。13C-NMR中δ1〇5.9,104.9,103.0,分別為3個六碳糖的端基碳的信號。δ11〇.4,是連 有羥基的C-22的特征信號。
[0027]主要相關(guān)誘導(dǎo)液和陽性藥的配制：
[0028] 10%BSA的I3BS溶液:稱取0.5502g的BSA于IOmL容量瓶中，加入PBS緩沖溶液