5mL，攪 拌溶解lh，于超凈臺中過濾除菌，得11%BSA的PBS母液。取455yL該母液加45yL的PBS緩沖溶 液混勻，即得10%BSA的PBS溶液0.5mL。
[0029]陽性藥(鹽酸二甲雙胍)溶液:精密稱取0.00190g鹽酸二甲雙胍粉末于IOmL容量瓶 中，加高糖DMEM培養(yǎng)基溶解并定容至IOmU于超凈臺中用0.22yL微孔濾膜過濾除菌，即得濃 度為150yg/mL的鹽酸二甲雙胍溶液。
[0030] 0. lmol/L棕櫚酸母液的配制：稱取0.05128g棕櫚酸顆粒，加入2mL無水乙醇，40°C 水浴溶解，于超凈臺中用〇. 22μπι微孔濾膜過濾除菌，即得。
[0031 ] 11%BSA溶液的配制：稱取0.5501g BSA于IOmL燒杯中，加入PBS緩沖溶液5mL，磁力 攪拌211，于超凈臺中用0.22以111微孔濾膜過濾除菌，即得含11%854的?85溶液。
[0032] I %FBS、10%BSA，3 · 5mmol/L棕櫚酸誘導(dǎo)液的配制：取1 · 82mL 11 %BSA溶液，加入 20yL FBS，90yL PBS，混合均勻，逐滴加入70yL 0.1mmol/L的棕櫚酸母液，渦旋使混合均勻， 即得2mL所需溶液。因有絮狀沉淀生成，誘導(dǎo)液需現(xiàn)用現(xiàn)配，加樣時并注意隨時振搖。
[0033] 1%FBS、10%BSA溶液的配制：取455yL 11%BSA溶液，加入5yL FBS，40yL PBS緩沖 溶液，混合均勻，即得0.5mL所需溶液。
[0034]含ΙθΛιοΙ/L的胰島素和1%FBS的低糖培養(yǎng)基:胰島素注射液的規(guī)格為IOml中含有 400IU的胰島素，28000IU相當(dāng)于Ig的胰島素，則按如下公式計算配置ΙθΛιοΙ/L的胰島素母 溶液所需胰島素注射液的體積。
[0035]胰島素注射液的體積=所配制體積X所配制濃度+胰島素注射液的濃度 [0036]取8μ1的胰島素于一鹽水瓶中，加19.992mL的低糖培養(yǎng)基，混勻，得胰島素濃度為 10一V)l/L;取該溶液ImL至IOOmL容量瓶中，加 ImL血清，再用低糖培養(yǎng)基定容至100mL，過 0.22μπι濾膜除菌，即得所需溶液100mL。
[0037]實驗方法及結(jié)果
[0038]實施例1:知母皂苷N對高糖誘導(dǎo)的HUVEC損傷模型細(xì)胞活力和NO分泌量的影響實 驗
[0039] 本實驗采用造模與給藥同時進(jìn)行的方法給藥，具體方法如下：
[0040] 培養(yǎng)瓶內(nèi)孵育細(xì)胞長至90 %融合時，倒掉培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍;將細(xì)胞以0.25 % 的胰蛋白酶消化約Imin，倒掉胰酶，加入含10 %血清的培養(yǎng)基終止消化，倒掉培養(yǎng)基，加入 新的含10%FBS的培養(yǎng)基4mL，輕輕吹打細(xì)胞；進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞稀釋至3 X IO4ceIls/ mL，接種于96孔板中，每孔接種200yL。
[0041 ] 將接種細(xì)胞后的96孔板置于5 %⑶2、37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至90 % 融合時，換用含1 % (v/v)FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使細(xì)胞同步化。將同步化后細(xì)胞分 為：空白對照組：含1 % (V/ V) FB S的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型對照組：用葡萄糖濃度為 33mmol/L的并含有1%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);給藥組：用葡萄糖濃度為33mmol/L的并含有 I %FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的同時給予不同樣品的藥液。培養(yǎng)72h后，將含藥培養(yǎng)液取出，每 孔加入新鮮的培養(yǎng)基180yL，再加入20yL 5mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后將孔內(nèi)液體吸除， 每孔中加入200yL DMSO并振搖IOmin，于492nm下檢測每孔的吸光值，結(jié)果見表1和表2。 [0042]按照如下公式計算濃度為0.25mg/mL時，知母皂苷N對HUVEC損傷模型細(xì)胞活力的 增加率，結(jié)果見表1。
[0044] 表1知母皂苷N對高糖誘導(dǎo)的HUVEC損傷模型細(xì)胞活力的增加率(mean土sd，n = 6)
[0046] 結(jié)果顯示:知母皂苷N對高糖誘導(dǎo)的HUVEC損傷模型細(xì)胞活力有明顯的增強(qiáng)作用。
[0047] 知母皂苷N對高糖誘導(dǎo)的HUVEC損傷模型NO分泌量的影響：按照上述的方法消化細(xì) 胞，鋪板，造模并給藥72h，給藥結(jié)束后每孔取40yL培養(yǎng)基，將培養(yǎng)液取出，4000rpm離心 IOmin，取上清液按照試劑盒說明書的方法測定NO含量。按照如下公式計算知母阜苷N對 HUVEC細(xì)胞活力的增加率，結(jié)果見表2。
[0049] 表2知母皂苷N對高糖誘導(dǎo)的HUVEC損傷模型NO分泌量的影響（mean土 sd，n = 6)
[0050] 注 ##P〈0 · 05vs ·空白組;*P〈0 · 05vs ·模型組，**P〈0 · 05vs ·模型組。
[0051] 由表2可知，與空白組比較模型組的細(xì)胞NO分泌能力顯著降低，說明造模成功。結(jié) 果顯示:知母皂苷N能夠顯著增加 HUVEC損傷模型的NO分泌能力。
[0052] 實施例2:知母皂苷N對RIN細(xì)胞胰島素分泌的影響實驗
[0053] 分組與給藥：取對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)0.25 %胰蛋白酶消化后吹打成單個細(xì)胞懸 液，血球計數(shù)板計數(shù)，加入1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞的濃度為I X IO5ceIlsAiL左右。將調(diào)整好濃 度的細(xì)胞加入到96孔培養(yǎng)板中，每孔200yL，將細(xì)胞分為空白對照組、陽性對照組和1-9給藥 組，每組設(shè)立6個平行孔，細(xì)胞置于37 °C、5 % CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0054] 細(xì)胞培養(yǎng)24小時后，吸棄原培養(yǎng)液，空白對照組加入新的細(xì)胞培養(yǎng)液，陽性對照組 加入含Ιμπιο I /L格列本脲的培養(yǎng)液，各給藥組分別加入含0.25mg/mL的不同樣品藥液的細(xì)胞 培養(yǎng)液200yL。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，吸出培養(yǎng)液，備用。
[0055]采用ELISA法測定胰島素含量：
[0056] (1).將樣品室溫下解凍，3000rpm離心10min，取上清液，待用。
[0057] (2).將胰島素測定試劑盒取出，室溫平衡20min，取出所需板條。
[0058] (3).設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50yL。
[0059] (4).待測樣品孔先加入樣品10yL，再加樣品稀釋液40yL，空白孔不加。
[0060] (5).除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體 IOOyU用封板膜封住反應(yīng)孔，37°C恒溫孵育60min。
[0061 ] (6) ·每孔加入底物A、B各50yL，37 °C避光恒溫孵育15min。
[0062] (7) ·每孔加入終止液50yL，15min內(nèi)，在450nm處檢測各孔的OD值。
[0063] (8).根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其吸光值計算標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖1。
[0064] 根據(jù)圖1得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算每孔中胰島素的含量，并按照如下公式計算藥物對 RIN細(xì)胞胰島素分泌量的增加率：
[0066] 表3知母阜苷N對RIN細(xì)胞胰島素分泌量的影響(mean 土 sd，n = 6)
[0068]注:*P〈0 · 05vs ·空白組;**P〈0 · 01 vs ·空白組。
[0069] 結(jié)果顯示，知母皂苷N能夠顯著增加 RIN細(xì)胞胰島素的分泌能力。
[0070] 實施例3:知母皂苷N對棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型葡萄糖消耗量的 影響實驗
[0071] 造模及給藥:培養(yǎng)瓶內(nèi)孵育細(xì)胞長至80 %-90 %融合時，倒掉培養(yǎng)基，用I3BS清洗2 遍;將細(xì)胞以〇 . 25 %的胰蛋白酶消化約Imin，胰酶倒掉，加入含10 %血清的培養(yǎng)基終止消 化，倒掉培養(yǎng)基，加入新的含10%FBS的培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞;進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞稀釋 至8 X 104ce 11 s/mL，接種于96孔板中，每孔接種200yL，周圍每孔加入200yL的D-Hank ' s溶 液。
[0072] 待96孔板中的細(xì)胞長至80 %融合時，加誘導(dǎo)液進(jìn)行造模。具體操作方法，吸除各孔 的培養(yǎng)基，再按細(xì)胞分組情況加入不同培養(yǎng)基、藥液和造模劑。細(xì)胞各組造模劑和藥液加法 如下：
[0073] 空白組：180yL高糖DMEM和20yL含 1 %FBS、10 %BSA溶液。
[0074] 模型組：180yL高糖DMEM和20yL含I %FBS、10%BSA和3.5mmol/L棕櫚酸的誘導(dǎo)液。
[0075] 陽性藥組：160yL高糖DMEM，20yL 150yg/mL鹽酸二甲雙胍藥液以及20yL 1%FBS、 10%BSA和3.5mmol/L組成的棕櫚酸誘導(dǎo)液。
[0076] 樣品組：160yL高糖DMEM，20yL 0.5mg/mL樣品液以及20yL 1%FBS、10%BSA和 3.5mmol/L組成的棕櫚酸誘導(dǎo)液。
[0077] 待孵育12h后，將含藥培養(yǎng)液取出，用PBS清洗1次，每孔加入新鮮的含l(T9m〇l/L胰 島素和1%FBS的低糖培養(yǎng)基200yL，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)12h后，每孔取20yL細(xì)胞培養(yǎng)液用于測培 養(yǎng)液中葡萄糖含量。
[0078] 葡萄糖消耗量的測定：按照試劑盒說明書測定各孔中葡萄糖的含量，并按照如下 公式計算葡萄糖消耗量：
[0079] 葡萄糖消耗量(mmol) =C〇h XV-Cm X V
[0080] 式中：Coh表示消耗前培養(yǎng)液中葡萄糖含量；
[0081 ] C12h表示消耗12h后培養(yǎng)液中葡萄糖含量；
[0082] V表示消培養(yǎng)基體積。
[0083]實驗結(jié)果見下表4。
[0084]表4知母阜苷N對胰島素抵抗模型葡萄糖消耗量的影響(mean 土 sd，n = 6)
[0086] 注:##P〈0 · 01 vs ·空白組；*P〈0 · 05vs ·模型組，**P〈0 · 01 vs ·模型組。
[0087] 實驗結(jié)果顯示，知母皂苷N能夠顯著性促進(jìn)HepG2細(xì)胞對葡萄糖的消耗量，具有改 善胰島素抵抗的潛在作用。<