專利名稱：一種防治糖尿病的風(fēng)輪菜有效部位的制備方法與藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥風(fēng)輪菜有效部位提取物的制備方法，以及該有效部位提取物的降 血糖、降血脂、保護(hù)胰島細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，及其在防治糖尿病、糖尿病引起的脂代 謝紊亂及糖尿病性心腦血管并發(fā)癥方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病是由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的一組代謝異常綜合癥。據(jù)WHO估計 1995 2025年，全球糖尿病發(fā)病率將增至3% 5%，預(yù)計達(dá)3億患者，患者年齡則從65歲 以上趨向45 54歲。糖尿病可分為胰島素依賴型糖尿病(Insulin Dependent Diabetes Mellitus, IDDM又稱1型)和非胰島素依賴型糖尿病(Noinsulin Dependent Diabetes Mellitus, NIDDM又稱2型)。糖尿病的主要危害在于它的血管并發(fā)癥，包括大血管病變和 微血管病變。糖尿病大血管并發(fā)癥主要是指腦血管、心血管和下肢血管的病變。糖尿病患 者并發(fā)心腦血管病的幾率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非糖尿病患者。目前的研究認(rèn)為糖尿病引起的大血管 病變是糖尿病患者致死致殘的主要原因。目前治療糖尿病的藥物主要有磺脲類，雙胍類、胰島素、a-葡萄糖苷酶抑制劑、噻 唑烷酮類等。這些藥會引起一些副作用如低血糖，肝毒性，乳酸性酸中毒及腹瀉。中藥治療 糖尿病具有明顯的優(yōu)勢，其治療糖尿病是多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點的綜合協(xié)調(diào)作用，其藥源 豐富、價格低廉、毒副作用小，所以從中藥篩選具有抗糖尿病藥物的前景是十分廣闊的。風(fēng)輪菜為唇形科風(fēng)輪菜屬植物風(fēng)輪菜(Clinopodium chinense (Benth.) 0. Kuntze)的全草，風(fēng)輪菜微苦、澀，涼。歸肝經(jīng)。風(fēng)輪菜為《中華人民共和國藥典》收載中 藥斷血流的原植物，具有清熱解毒、止血活血的功效。風(fēng)輪菜在福建民間用于治療糖尿病。 本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)風(fēng)輪菜具有降血糖作用，但尚未有針對風(fēng)輪菜有效部位提取物的制 備工藝、以及該有效部位提取物的降血糖、降血脂、保護(hù)胰島細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，及 其在防治糖尿病及糖尿病性心腦血管并發(fā)癥方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種從中藥風(fēng)輪菜中制備有效部位提取物的方法，以及該有效部位 提取物的降血糖、降血脂、保護(hù)胰島細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，及其在防治糖尿病及糖尿病 性心腦血管并發(fā)癥方面的應(yīng)用。1、風(fēng)輪菜有效部位提取物的制備方法(1)風(fēng)輪菜全草干燥粉碎；(2)乙醇或甲醇或丙醇及它們的含水物回流提取，或浸漬提取，提取液減壓濃縮；(3)將濃縮的提取物依次用石油醚、乙酸乙酯萃取3 4次；(4)乙酸乙酯提取物用大孔樹脂柱進(jìn)行柱層析；(5)水洗脫雜質(zhì)后，乙醇梯度洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮干燥，得提取物。上述制備方法的條件范圍為步驟(2)中乙醇或甲醇或丙醇的濃度為10 90%，提取方法為回流、浸漬；步驟(5)中乙醇梯度洗脫范圍為20 80%。2、風(fēng)輪菜有效部位提取物主要由總黃酮和萜類組成，黃酮的主要成分為香蜂草 苷、柚皮素、芹菜素、異櫻花素、木犀草素、金合歡素等；熊果酸為萜類的主要成分。其中總黃 酮含量的測定采用紫外分光光度法，以NaN02-Al(N03)3-Na0H顯色測定總黃酮含量，以蘆丁 計，黃酮類化合物的總含量不低于50%。本發(fā)明所述風(fēng)輪菜有效部位提取物可與常規(guī)輔助劑和/或賦型劑混合，制備成各 種劑型，用于預(yù)防或治療。針劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、糖衣丸劑、溶液劑等都為可供選擇的 藥物劑型。膠囊劑、片劑、顆粒劑、糖衣丸劑等劑型可以含有一種或多種常用賦型劑一填料和 增容劑如淀粉，微晶纖維等；粘合劑如羧甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮等；致濕劑如甘 油；崩解劑如碳酸鈣等；吸收劑如高嶺土等；潤滑劑如滑石粉等。藥用賦型劑可以是固體、半固體、液體等各種形態(tài)的，配方輔助劑可以是各種類型 的。溶液劑可以含有一般的溶劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑等，如水、乙醇、甘油、聚乙二
醇、苯甲酸芐酯等。膠囊劑、片劑、顆粒劑、糖衣丸劑、溶液劑等劑型可以用已知的常規(guī)方法制備，可以 將風(fēng)輪菜有效部位提取物與一種或多種賦型劑混合，制備劑型。3、風(fēng)輪菜有效部位提取物降血糖、降血脂和保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性3. 1風(fēng)輪菜有效部位提取物(CCE)對鏈脲佐菌素糖尿病小鼠血糖、膽固醇(TC)、 血清胰島素及胰島組織的影響隨機(jī)取出小鼠10只作為正常組，其余小鼠禁食16_17h后，尾靜脈注射鏈脲佐菌 素160mg/kg，注射后72h后眼眶后靜脈叢取血，分離血清，測定血糖，選空腹血糖> llmmol/ L的小鼠40只，隨機(jī)分為4組，分別按10ml/kg體重經(jīng)口給予CCE 50、100mg/kg，二甲雙胍 (Metformin) 200mg/kg以及等體積的0. 2% CMC-Na，每日一次，連續(xù)12天給藥。第6天末 次給藥后1. 5h (禁食5h)，小鼠眼眶后靜脈叢取血，分離血清，以葡萄糟氧化酶法測定血糖。 末次給藥后1. 5h (禁食5h)，小鼠摘眼球取血，分離血清，以試劑盒方法測定血糖、TC、血清 胰島素。分離小鼠胰腺，將胰腺浸泡在10%福爾馬林中固定、石蠟包埋，制片，HE染色，作組 織病理學(xué)檢查。血糖實驗結(jié)果如圖1所示，與正常組比較，模型組鏈脲佐菌素糖尿病小鼠血糖極 顯著升高(P < 0. 01)。與模型組比較，CCE 100mg/kg和二甲雙胍200mg/kg均可明顯降低 第6天糖尿病小鼠血糖(P<0.05) ；CCE 50mg/kg劑量組明顯降低第12天糖尿病小鼠的血 糖(P < 0. 05)，CCE 100mg/kg和二甲雙胍200mg/kg劑量組均可極明顯降低第12天糖尿病 小鼠的血糖(P < 0. 01)。TC實驗結(jié)果如圖2所示，與正常組相比，鏈脲佐菌素糖尿病小鼠的TC含量極明顯 升高(P<0.01)。與模型組相比，CCE 50mg/kg和二甲雙胍200mg/kg劑量組均明顯地降低 糖尿病小鼠的血清TC含量(P < 0. 05)，CCE 100mg/kg劑量組極明顯地降低糖尿病小鼠的 血清TC含量(P < 0.01)。胰島素的實驗結(jié)果如圖3所示，與正常組相比，模型組鏈脲佐菌素糖尿病小鼠的 血清胰島素含量極明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，CCE100mg/kg劑量組和二甲雙胍200mg/kg劑量組均明顯地回升糖尿病小鼠低下的胰島素含量(P < 0. 05)。鏈脲佐菌素糖尿病小鼠胰腺的組織病理學(xué)改變主要為內(nèi)分泌部胰島數(shù)量較正常 減少，體積縮小，存留的胰島組織結(jié)構(gòu)較正常松散，其內(nèi)細(xì)胞體積增大，胞界欠清，部分小鼠 胰腺外分泌部腺泡細(xì)胞有空泡變。CCE 50、100mg/kg和二甲雙胍200mg/kg能減輕胰島的病 變，具體表現(xiàn)藥物應(yīng)用后胰島數(shù)量增多、胰島體積增大，每個胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量有明顯改善， 提示藥物能改善鏈脲佐菌素所致的胰島病變。3. 2風(fēng)輪菜有效部位提取物(CCE)對a -葡萄糖苷酶的抑制作用以4-硝基酚-a-D-呋喃葡萄糖苷(PNP_G)為底物測定a-葡萄糖苷酶的活 性。將CCE (終濃度為10，30，60，90，120mg/L)或阿卡波糖(終濃度為100，300，600，900， 1200,1500mg/L)40u 1 與 a -葡萄糖苷酶(0. 35mg/ml) 30 yl 共同加 500 yl KH2P04 緩沖液 (67mmol/L,pH 6. 8)中，在 37°C水浴中孵育 lOmin后，加入底物PNP-G(0. 01mol/L)30u 1 以 啟動反應(yīng)。37°C反應(yīng)lOmin后，加入0. lmol/L Na2C03 1ml終止反應(yīng)。于405nm波長下測 定在酶作用下從PNP-G中釋放的對硝基苯(PNP)的0D值。酶活力單位定義為在37°C，pH 6. 8的條件下，lmin內(nèi)水解PNP-G釋放1 y mol PNP所需的酶量，計算抑制率。酶抑制試驗 重復(fù)3次，每次3個復(fù)管。對a-葡萄糖苷酶的抑制率用以下公式計算抑制率=(對照組 0D值-藥物組0D值)/對照組0D值X 100 %。結(jié)果如表1所示與對照組相比，CCE(30、60、90、120mg/L)、阿卡波糖(100,300, 600、900、1200、1500mg/L)均對a -葡萄糖苷酶有極顯著的抑制作用(P < 0. 01)。CCE、阿 卡波糖抑制a -葡萄糖苷酶的IC5(1分別為62. 3,666. 6mg/L。表1風(fēng)輪菜有效部位提取物(CCE)對a-葡萄糖苷酶的抑制作用(ids，n=9)
組別 濃度(mg/L) OD,i()5抑制率(％)
對照組 ——1.218±0.016二
CCE 101.184-1-0.039*2.8
300.86910.012**28.7
600.625±0.013**48.7
900.405^0.010**66.81200.337士0.005**72.4 阿卡波糖 1001.042士0.002 **14.4
3000.772:10.003"36.6
6000.607:10.015**50.1
9000.531 ±0.009**56.4
12000.493±0.006 :Mi59.5
15000.365:10.012**68.1*P < 0. 05，**P < 0. Olvs 對照組3. 3、風(fēng)輪菜有效部位提取物(CCE)對高糖損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用取對數(shù)生長期HUVEC消化成單細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(lX104cell/well)，培養(yǎng)24h后更換RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，將細(xì)胞分為6組，正常組為 HUVEC的自然培養(yǎng)，模型組為CCE與33mmol/L葡萄糖共培養(yǎng)，其余組為CCE(1、3、10、30mg/ L)與HUVEC及葡萄糖共培養(yǎng)，培養(yǎng)72h后，加入含0. 5 % MTT的培養(yǎng)基20 yl，再培養(yǎng)4h后， 棄培養(yǎng)液，加入150 ill DMS0原液，振蕩lOmin，待結(jié)晶完全溶解后，用酶聯(lián)免疫儀于570nm 波長處測定0D值。實驗重復(fù)3次，每次3個復(fù)孔。結(jié)果如圖4所示，與正常組比較，模型組HUVEC細(xì)胞A570值極明顯降低(P <0.01)。與模型組相比，CCE 3、10、30mg/L組的A570值明顯高于模型組(P < 0.01)?？?見CCE 3、10、30mg/L明顯提高高糖損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的存活率，對高糖所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷 具有保護(hù)作用。本發(fā)明所述，風(fēng)輪菜中有效部位提取物可用于制備預(yù)防和治療糖尿病、糖尿病引 起的脂代謝紊亂及糖尿病性心腦血管方面并發(fā)癥。。
四

圖1風(fēng)輪菜有效部位提取物(CCE)對鏈脲佐菌素糖尿病小鼠血糖的影響隨機(jī)取出小鼠10只作為正常組，其余小鼠禁食16_17h后，尾靜脈注射鏈脲佐菌 素160mg/kg，注射后72h后，選空腹血糖> llmmol/L的小鼠，隨機(jī)分為模型組、CCE 50、 100mg/kg，二甲雙胍200mg/kg，連續(xù)12天經(jīng)口給藥，每日一次。第6天和第12天，末次給 藥后1.5h (禁食5h)分別取血，測定空腹血糖，結(jié)果以表示。##P<0.01 vs Normal ；*P < 0. 05，**P < 0. Olvs Control (Student’ s_t test).圖2風(fēng)輪菜有效部位提取物(CCE)對鏈脲佐菌素糖尿病小鼠總膽固醇的影響隨機(jī)取出小鼠10只作為正常組，其余小鼠禁食16_17h后，尾靜脈注射鏈脲佐菌素 160mg/kg，注射后72h后，選空腹血糖> llmmol/L的小鼠，隨機(jī)分為模型組、CCE 50、100mg/ kg, 二甲雙胍200mg/kg，連續(xù)12天經(jīng)口給藥，每日一次。第12天，末次給藥后1. 5h (禁食5h) 取血，測定血清總膽固醇，結(jié)果以i:l:S表示。##P < 0. 01 vs Normal ；*P < 0. 05，**P < 0. 01 vs Control(Student， s_t test).圖3風(fēng)輪菜有效部位提取物(CCE)對鏈脲佐菌素糖尿病小鼠血清胰島素含量的影 響隨機(jī)取出小鼠10只作為正常組，其余小鼠禁食16_17h后，尾靜脈注射鏈脲佐菌素 160mg/kg，注射后72h后，選空腹血糖> llmmol/L的小鼠，隨機(jī)分為模型組、CCE 50、100mg/ kg，二甲雙胍200mg/kg，連續(xù)12天經(jīng)口給藥，每日一次。第12天，末次給藥后1.5h (禁食 5h)取血，用放射免疫法測定血清胰島素，結(jié)果以瓦ts表示。##P< 0.01 vs Normal ；*P<0. 05 vs Control(Student， s_t test).圖4 CCE對高糖損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用HUVEC單細(xì)胞懸液(1X104個/孔)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng) 基，將細(xì)胞分組正常組為HUVEC的自然培養(yǎng)，模型組為HUVEC與33mmol/L葡萄糖共培養(yǎng)， 其余組為CCE (1、3、10、30mg/L)與HUVEC及葡萄糖共培養(yǎng)，培養(yǎng)72h后，加入含0. 5 % MTT的 培養(yǎng)基20iU，再培養(yǎng)4h后，棄培養(yǎng)液，加入150iU DMS0原液，振蕩，待結(jié)晶完全溶解后，測 定0D值。圖中數(shù)據(jù)為3次實驗的平均值，每次實驗為3復(fù)孔。結(jié)果以表示。##P<0.01 vs Normal 廣*P < 0. 01 vs Control (Student，s_t test).五具體實施例方式下面結(jié)合實例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。但是，本發(fā)明不局限于所給出的這些實例。實施例1 風(fēng)輪菜有效部位提取物的制備取10kg干燥風(fēng)輪菜全草，粉碎成粗粉，加6倍體積的80%乙醇回流提取3次，合并 提取液，減壓濃縮，將濃縮液，依次用3倍量的石油醚、乙酸乙酯萃取4次，將乙酸乙酯提取 物用大孔樹脂柱進(jìn)行柱層析，水洗脫雜質(zhì)后，乙醇梯度洗脫(洗脫范圍為20 80% )，收集 乙醇洗脫液，減壓濃縮干燥，得風(fēng)輪菜有效部位提取物，得率為1. 5%。實施例2 膠囊劑的制備實施例1中的風(fēng)輪菜有效部位提取物65g，微晶纖維素135g，研磨混合10_30分 鐘，至均勻。將混勻的藥粉，灌裝于1號膠囊中，隨機(jī)抽樣每粒裝量控制在0. 2g，含風(fēng)輪菜有 效部位提取物為65mg。實施例3 片劑的制備實施例1中的風(fēng)輪菜有效部位提取物25g，微晶纖維素49g，研磨混合10-30分鐘， 至均勻止；加入硬脂酸鎂lg，充分混合；混合物用單沖壓片機(jī)壓成直徑6mm，重300mg的片 劑，每片含風(fēng)輪菜有效部位提取物為lOOmg。實施例4 顆粒劑的制備實施例1中的風(fēng)輪菜有效部位提取物20g，加玉米淀粉180克，混勻后，加適量乙醇 (60% )制成軟材，過12目篩，經(jīng)干燥后得顆粒劑，每1克顆粒劑含風(fēng)輪菜有效部位提取物 為 lOOmg。
權(quán)利要求
一種防治糖尿病的風(fēng)輪菜有效部位提取物，其特征在于該有效部位提取物是以風(fēng)輪菜為原料，經(jīng)粉碎、提取、減壓回收后得濃縮物，濃縮物經(jīng)萃取后得乙酸乙酯提取物，再經(jīng)大孔樹脂柱進(jìn)行柱層析而得到提取物粉末。
2.權(quán)利要求1所述的風(fēng)輪菜有效部位提取物的制備方法，其特征在于取干燥風(fēng)輪菜， 粉碎，乙醇或甲醇或丙醇及它們的含水物回流提取，或浸漬提取，提取液減壓濃縮，將濃縮 的提取物分散在水中，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取3 4次，乙酸乙酯提取物用大孔樹脂 柱進(jìn)行柱層析，水洗脫雜質(zhì)后，乙醇梯度洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮干燥，得提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的風(fēng)輪菜有效部位提取物的制備方法，其特征在于a)提取方法為回流、浸漬b)純化的柱材料為大孔樹脂，乙醇梯度洗脫范圍為20 80%。
4.權(quán)利要求1所述的風(fēng)輪菜有效部位提取物，其特征在于該提取物主要由總黃酮和 萜類組成，黃酮的主要成分為香蜂草苷、柚皮素、芹菜素、異櫻花素、木犀草素、金合歡素等； 熊果酸為萜類的主要成分，采用紫外分光光度法，以NaNO2-Al (NO3)3-NaOH顯色測定總黃酮 含量，以蘆丁計，黃酮類化合物的總含量不低于50%。
5.一種治療糖尿病的藥物組合物，其特征在于含有權(quán)利要求4的植物提取物，與一種 或多種輔助劑和/或賦形劑混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，其特征在于其被制備成各種劑型，針劑、膠囊劑、片 劑、顆粒劑、糖衣丸劑、溶液劑等都為可供選擇的藥物劑型。
7.根據(jù)權(quán)利要求2和3所述的風(fēng)輪菜有效部位提取物的制備方法，其所得到的風(fēng)輪菜 有效部位提取物能顯著降低糖尿病高血糖、降血脂，保護(hù)胰島細(xì)胞，抑制α -葡萄糖苷酶活 性，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的風(fēng)輪菜有效部位提取物的作用，其特征在于所述藥物用于預(yù) 防和治療糖尿病、糖尿病引起的脂代謝紊亂及糖尿病性心腦血管方面并發(fā)癥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防治糖尿病的風(fēng)輪菜有效部位提取物的制備方法和應(yīng)用。該有效部位提取物以風(fēng)輪菜(Clinopodium chinense(Benth.)O.Kuntze)為原料，經(jīng)粉碎、醇提取、減壓回收后礙到濃縮物，濃縮物經(jīng)石油醚、乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯提取物，再經(jīng)大孔樹脂純化而得到。該有效部位提取物主要由總黃酮和萜類組成，具有明顯的降低鏈脲佐菌素糖尿病小鼠的血糖，降低血清膽固醇含量，保護(hù)胰島細(xì)胞，抑制α-葡萄糖苷酶活性，和保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。可見，風(fēng)輪菜有效部位提取物具有良好的降血糖、降血脂、保護(hù)胰島細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，可用于防治糖尿病、糖尿病引起的脂代謝紊亂及糖尿病性心腦血管方面并發(fā)癥。
文檔編號A61P3/10GK101940616SQ20101026763
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者任燕利, 劉洋, 吳斐華, 梁敬鈺 申請人:中國藥科大學(xué)