專利名稱：原花青素在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物藥學(xué)領(lǐng)域，涉及中藥肉桂水提物中的原花青素在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來中國已成為全球糖尿病發(fā)病率高速增長的地區(qū)之一，糖尿病患者總?cè)藬?shù)位居世界第一。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟估計，我國2007年糖尿病患病人數(shù)約為3980萬，2025年時將達(dá)到5930萬。糖尿病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅我國國民健康和生活質(zhì)量的重大慢性疾病。糖尿病分為I型和2型，其中2型糖尿病(T2DM)人數(shù)占糖尿病患者總數(shù)的90%以上，2型糖尿病的病理特征之一為由胰島β細(xì)胞分泌的胰島淀粉樣多肽(human isletamyloid polypeptide, hIAPP)的錯誤折疊和形成淀粉樣聚集。這種淀粉樣多肽聚集會破壞膜島 β 細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)(參見 L. Haataja, T. Gurlo, C. J. Huang, and P. C. Butler,Islet amyloid in type 2 diabetes, and the toxic oligomer hypothesis. EndocrRev 2008; 29 (3) : 303-316.)，誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡，損傷β細(xì)胞的功能，被認(rèn)為是2型糖尿病的重要致病原因之一(參見 Westermark P, Wernstedt C，O’Brien TD, Hayden Dff,Johnson KH. Islet amyloid in type 2 human diabetes mellitus and adult diabeticcats contains a novel putative polypeptide hormone. Am J Pathol 1987; 127 (3):414-417.)。此外，在2型糖尿病中晚期患者中，hIAPP的聚合物還可能通過打斷β細(xì)胞間的耦合、誘導(dǎo)β細(xì)胞的凋亡等機理，導(dǎo)致β細(xì)胞功能的損傷，加重糖尿病的病情。肉桂作為一種傳統(tǒng)中藥，已列入中國藥典。在抗菌抗炎、抗腫瘤和治療糖尿病中有廣泛應(yīng)用。研究表明肉桂水提物可以抑制阿爾茲海默病中聚集蛋白A-beta的聚集。本發(fā)明研究了肉桂水提物對2型糖尿病中胰島淀粉樣多肽聚集性的影響，并且鑒定了其活性成分。

發(fā)明內(nèi)容
肉桂作為一種傳統(tǒng)中藥在抗菌抗炎、抗腫瘤和治療糖尿病中有廣泛應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)中藥肉桂水提物能夠有效抑制2型糖尿病中胰島淀粉樣多肽的聚集，降低其聚集過程中對β細(xì)胞產(chǎn)生的毒性，并且鑒定出其中的有效成分為原花青素。為肉桂或者肉桂原花青素在制備治療2型糖尿病藥物中奠定了基礎(chǔ)。所以本發(fā)明提供了原花青素在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。同時本發(fā)明還提供了一種治療糖尿病的藥物，其中含有原花青素作為活性成分。該治療糖尿病的藥物可以按醫(yī)藥行業(yè)現(xiàn)有技術(shù)來制備，比如，取原花青素適量，以乳糖、淀粉和糊精為稀釋劑，羧甲基淀粉鈉(CMS-Na)為崩解劑，乙醇為潤濕劑，硬脂酸鎂為潤滑劑經(jīng)過篩，混勻，壓片制成原花青素片劑。


圖1，實施例I用反相高效液相色譜鑒定肉桂水提物成分。圖2，實施例2 hIAPP和肉桂水提物、原花青素共浴的硫磺素?zé)晒夤庾V實驗。圖3，實施例2 hIAPP和肉桂酸、肉桂醛、香豆素共浴的硫磺素?zé)晒夤庾V實驗 圖4，hIAPP和化合物共浴孵育12小時后在透射電鏡下觀察到的形態(tài)。圖5,光催化交聯(lián)實驗,用20%的Tricine-Urea凝膠電泳分離并用銀染方法分析結(jié)果O圖6，各種肉桂水提物對羧基熒光素泄露的影響。圖7，肉桂水提物或原花青素對紅細(xì)胞溶血率的影響。圖8，肉桂水提物或原花青素對細(xì)胞存活率的影響。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實驗，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明保護(hù)的范圍，下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實驗指南(第二版);D. L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實驗指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明所用的肉桂酸(C9H8O2)、肉桂醛(C9H8O )、香豆素(C9H6O2)和原花青素(C3tlH26O12)均訂購于阿拉丁試劑有限公司(中國)；胰島淀粉樣多肽訂購于金絲瑞公司(美國)，其它本發(fā)明所涉及到試劑均訂購于奧德里奇-西格瑪公司(美國)。實施例I.反相高效液相色譜(reverse phase high performance liquidchromatography)鑒定肉桂水提物。具體操作采用Apollo C18色譜柱(250X4.6 mm, 5 μ m)，柱溫為40°C。流動相為60%乙腈，等梯度洗脫，流速為lml/min。檢測波長為280 nm。結(jié)果如圖I所示，原花青素，肉桂酸，香豆素，肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間分別為2.09 min, 3.87 min, 4.56 min 和 5. 77 min (見圖 1A，1B，IC 和 1D)，通過和肉桂水提物的各個峰的半保留時間對比得知，肉桂水提物中的主要成分為原花青素、肉桂酸、肉桂醛和香豆素(見圖1E)。實施例2.硫磺素突光光譜實驗(Thioflavin-T fluorescence assay)
具體操作將胰島淀粉樣多肽(hIAPP)溶解于六氟異丙醇(HFIP)并超聲2分鐘，用25 mM PBS (50 mM NaCl，pH7. 4)將其溶解稀釋為含1% HFIP終濃度為13 μ M的溶液。在25°C下分別與肉桂水提物、原花青素、肉桂酸、肉桂醛和香豆素共水浴，每兩小時取點，用日立2700熒光分析儀進(jìn)行分析，檢測體系包含25 mM PBS (50 mM NaCl, pH 7.4)和26 μ M硫磺素(Thioflavin-T),激發(fā)和發(fā)射波長分別為450 nm和482 nm,波長掃描60 s,記錄數(shù)據(jù)分析。結(jié)果如圖2、圖3所示，hIAPP隨著孵育的時間增加逐漸開始聚集，同時熒光信號強度隨著hIAPP的聚集而增強。當(dāng)加入肉桂水提物后，熒光信號強度隨著肉桂水提物濃度的上升而下降(見圖2)。相同地，加入原花青素后，熒光信號強度隨著原花青素的濃度升高而降低，當(dāng)原花青素與hIAPP的摩爾濃度達(dá)到2:1時，熒光信號強度幾乎完全被抑制(見圖
2)。然而當(dāng)加入近飽和濃度的肉桂酸、肉桂醛和香豆素時，熒光信號強度與只有hIAPP時相似(見圖3)。該實驗說明肉桂水提物和原花青素均能有效地抑制hIAPP的聚集，而肉桂酸、肉桂醛和香豆素不能抑制hIAPP的聚集。實施例3.透射電鏡實驗(Transmission electronic microscopy)
具體操作取實施例2中孵育12小時的樣品在透射電鏡下觀察其形態(tài)。結(jié)果如圖4所示，hIAPP單獨孵育12小時后呈現(xiàn)細(xì)長的纖維狀形態(tài)(見圖4A)。當(dāng)hIAPP分別和O. 26 μ g/ml的肉桂水提物、I. 3 μ M的原花青素共同孵育12小時后呈現(xiàn)短小的纖維狀形態(tài)(見圖4B，4D)，當(dāng)hIAPP和分別和26 μ g/ml的肉桂水提物、26 μ M的原花青素共同孵育12小時后沒有觀察到典型的纖維狀形態(tài)(見圖4C，4E)。說明肉桂水提物和原花青素對hIAPP的聚集有抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性。當(dāng)hIAPP分別和近飽和濃度的肉桂 酸、肉桂醛、香豆素共同孵育時，仍可以觀察到大量的細(xì)長的纖維狀形態(tài)(見圖4F-H)，說明肉桂酸、肉桂醛和香豆素不能抑制hIAPP的聚集。
實施例4.未修飾蛋白的光催化交聯(lián)實驗(Photo-induced cross-linking ofunmodified proteins assay)
具體操作將hIAPP溶解于HFIP并超聲2分鐘，用25 mM PBS (50 mM NaCl, pH7. 4)將其溶解稀釋為含1% HFIP終濃度為41 μ M的溶液，分別和肉桂水提物、原花青素在交聯(lián)劑的作用下在暗箱中用白熾光照射5 s促進(jìn)交聯(lián)，加入上樣緩沖液97°C變性10分鐘，用20%的Tricine-Urea凝膠電泳分離并用銀染方法分析結(jié)果。結(jié)果如圖5所示，hIAPP在光處理5 s后形成了較多的多聚體(見圖5第2條帶)。在加入了肉桂水提物多聚物呈現(xiàn)劑量依賴性地減少(見圖5第3、4、5條帶，肉桂水提物濃度分別為0.82 Pg/ml、8. 2 Pg/ml和82 Pg/ml);同樣地，在加入原花青素后多聚物也呈現(xiàn)劑量依賴性地減少(見圖5第6、7、8條帶，原花青素的濃度分別為4. I μΜ、41 μΜ和82 μΜ)。該實驗說明肉桂水提物和原花青素對hIAPP的毒性聚集有抑制作用。實施例5.羧基突光素泄露實驗(dye leakage assay)
具體操作利用 2-01eoyl-l-palmitoyl-sn-glycerol-3-phospho-rac (1-glycerol)sodium salt (POPG)制作包裹有羧基熒光素的POPG脂質(zhì)膜(模擬生物膜)，加入hIAPP和肉桂水提物或原花青素以檢測其對hIAPP毒性的影響。結(jié)果如圖6所示，0. 5 μ M的hIAPP能夠顯著地破壞模擬生物膜，造成了 95%的POPG脂質(zhì)膜熒光泄露，當(dāng)肉桂水提物或原花青素存在時，破膜率顯著性地降低。實施例6.紅細(xì)胞溶血實驗(Hemolysis assay)
具體操作hIAPP和肉桂水提物或原花青素與人紅細(xì)胞共同在37°C下孵育5小時，上清在540 nm下測吸光度值，計算溶血率，通過比較溶血率得出肉桂水提物和原花青素對hIAPP毒性的影響。結(jié)果如圖7所示，單獨15 μ M的hIAPP存在時紅細(xì)胞溶血率達(dá)到94%，加入肉桂水提物或原花青素后，紅細(xì)胞溶血率呈現(xiàn)劑量依賴性地降低。實施例7.細(xì)胞毒性實驗(MTT assay)
具體操作將大鼠胰腺腫瘤β-細(xì)胞(INS-1細(xì)胞)以5Χ105 cells/ml的密度平鋪在培養(yǎng)皿上，37°C和5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24小時，換含15 μ M的hIAPP和肉桂水提物或原花青素的培養(yǎng)基，再孵育24小時。加入塞唑藍(lán)(MTT)進(jìn)一步孵育4 h后在570nm下的吸光度。結(jié)果如圖8所示，加入15 μ M的hIAPP后細(xì)胞存活率與對照組相比顯著降低。加入肉桂水提物或原花青素后，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)劑量依賴性地上升。前期研究表明，胰島淀粉樣多肽在體內(nèi)的聚集與2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系。這一聚集過程會破壞胰島β細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)(參見L. Haataja, T. Gurlo, C. J.Huang, and P. C. Butler, Islet amyloid in type 2 diabetes, and the toxic oligomerhypothesis. Endocr Rev 2008; 29 (3): 303-316·),誘導(dǎo) β 細(xì)胞凋亡，損傷 β 細(xì)胞的功能。本發(fā)明通過以上實驗發(fā)現(xiàn)肉桂水提物可以有效抑制hIAPP的聚集，其四種主要成分為原花青素、肉桂酸、肉桂醛和香豆素，其中原花青素可以有效抑制hIAPP的聚集。認(rèn)為肉桂水提物中抑制hIAPP聚集的有效活性成分為原花青素。hIAPP的毒性實驗證實肉桂水提物和原花青素可以有效地降低hIAPP在聚集過程中產(chǎn)生的毒性，并有效提高大鼠胰腺腫瘤β-細(xì)胞(INS-1細(xì)胞)在hIAPP存在條件下的存活率。這些結(jié)果表明肉桂水提物中的原花青素以抑制胰島淀粉樣多肽聚集為靶點，在制備治療2型糖尿病藥物中具有極大地應(yīng)用價值。人體內(nèi)的胰島淀粉樣多肽的濃度在pM級別(參見Young A. Tissue expressionand secretion of amyl in. Adv Pharmacol 2005; 52:19-45.),原花青素在體內(nèi)的濃度可以達(dá)到 MM 級別(R. R. Holt, S. A. Lazarus, M. C. Sullards, Q. Y. Zhu, D. D.Schramm, J. F. Hammer stone, C. G. Fraga, Η. H. Schmitz, and C. L. Keen, Procyanidin dimer B2 [epicatechin-(4beta-8)-epicatechin] in human plasma after theconsumption of a flavanol-rich cocoa. Am J Clin Nutr 2002; 76 (4): 798-804.；R. Rajbhandar i, N. Peng, R. Moore, A. Arab shah i, J. M. ffyss, S. Barnes, and J. K.Prasain, Determination of cranberry phenolic metabolites in rats by liquidchromatography-tandem mass spectrometry. J Agric Food Chem 2011; 59 (12):6682-6688)，在實驗中原花青素和胰島淀粉樣多肽的摩爾濃度達(dá)到2:1時可以抑制該多肽的聚集。因此，以原花青素為抗糖尿病藥物的主要成分，在體內(nèi)僅僅需要PM級別就能達(dá)到很好的治療效果。所以本發(fā)明不僅提供了原花青素在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用，同時還提供了一種治療糖尿病的藥物，其中以原花青素作為活性成分，藥學(xué)上可接受的輔料作為載體，t匕如以乳糖、淀粉和糊精為稀釋劑，羧甲基淀粉鈉(CMS-Na)為崩解劑，乙醇為潤濕劑，硬脂酸鎂為潤滑劑。
權(quán)利要求
1.原花青素在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。
2.一種用于治療糖尿病的藥物，其中含有原花青素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物，其中還含有乳糖、淀粉和糊精為稀釋劑，羧甲基淀粉鈉為崩解劑，乙醇為潤濕劑，硬脂酸鎂為潤滑劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及中藥肉桂水提物中的原花青素在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。胰島淀粉樣多肽在體內(nèi)發(fā)生聚集，這一聚集過程會破壞胰島β細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡，損傷β細(xì)胞的功能，被認(rèn)為是2型糖尿病的重要致病原因之一。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)中藥肉桂水提物中的原花青素能夠有效抑制2型糖尿病中胰島淀粉樣多肽的聚集，同時逆轉(zhuǎn)其聚集過程中對β細(xì)胞產(chǎn)生的毒性，從而保護(hù)β細(xì)胞。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)肉桂原花青素能夠以抗胰島淀粉樣多肽聚集為靶點，在制備治療2型糖尿病藥物中具有極大的應(yīng)用價值。
文檔編號A61K31/353GK102940624SQ20121050244
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者黃昆, 焦麗華, 朱俊銘, 鄭凌 申請人:武漢百奧京生物醫(yī)藥有限公司, 武漢生物技術(shù)研究院