專利名稱：咖倫賓在制備用于治療2型糖尿病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及咖倫賓的新的醫(yī)療用途，具體涉及咖倫賓在制備用于 治療2型糖尿病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是臨床常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，是繼心腦血管 疾病和腫瘤之后嚴(yán)重危害人類健康的第三大慢性疾病。目前在全球范圍內(nèi)糖尿病的發(fā)病率 呈上升趨勢，其中又以2型糖尿病居多。糖尿病可引發(fā)心、腦、腎、血管等多器官并發(fā)癥，致 死致殘率極高，因此積極防治糖尿病有著十分重要的意義。目前用于治療2型糖尿病的化學(xué)藥物雖有較好療效，但是副作用及其毒副反應(yīng)也 較多，促使人們不斷尋找更加安全有效的治療藥物。我國中醫(yī)藥學(xué)具有悠久的歷史，早在公 元前400多年就有中草藥治療糖尿病的記載，近年來從中藥中篩選治療糖尿病的有效成分 受到廣泛關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種新的治療2型糖尿病的藥物，使其具有降糖作用良好、 能改善糖耐量、降低血脂、增加對胰島素的敏感性等特點(diǎn)。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供的這種治療2型糖尿病的藥物是咖倫賓。咖倫賓，英文名稱Columbin，又稱古倫賓，異名黃藤內(nèi)酯。是由防己科植物金果欖 Tinospora capiltopies Gagnep的干燥塊根中提取得到的呋喃二萜類化合物。在傳統(tǒng)中 醫(yī)中，金果欖具有清熱解毒、利咽止痛的功效，用于治療急性咽喉炎、扁桃體炎等。1896年 Hilger Albert首次由植物Apoth kit的古倫仆根中得到咖倫賓。上海藥物研究所率先從 金果欖中提取純化出咖倫賓的高純度結(jié)晶，并進(jìn)行了理化性質(zhì)的測定和結(jié)構(gòu)鑒定。本發(fā)明從金果欖藥材中提取純化得到咖倫賓，并對得到的產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定。金 果欖，英文名稱Tinospora Root，拉丁名稱Radix Tinosporae，為防己科植物青牛膽 Tinospora sagittata (Oliv. )Gagnep.或金果攬 Tinospora capiIlipesGagnep.的干燥塊 根(參見《中國藥典》2005年版一部，150頁)。青牛膽分布在秦嶺以南至南嶺山脈，金果欖 主要分布在南嶺山脈及南至中南半島(參見《中國中藥資源志要》，384頁)。植物形態(tài)(云南省藥物研究所發(fā)布)金果欖，又名圓角金果欖、圓葉金果欖。常綠 纏繞藤本。塊根卵圓形、橢圓形、腎形或圓形，常數(shù)個相連，表皮土黃色。莖圓柱形，深綠色， 粗糙有紋，被毛。葉互生，葉柄長2 3. 5厘米，略被毛；葉片卵形至長卵形，長6 9厘米， 寬5 6厘米，先端銳尖，基部圓耳狀箭形，全緣，上面綠色，無毛，下面淡綠色，被疏毛?；?近白色，單性，雌雄異株，成腋生圓錐花序，花序疏松略被毛，總花梗長6 9厘米，苞片短， 線形；雄花具花萼2輪，外輪3片披針形，內(nèi)輪3片倒卵形，外側(cè)均被毛；花瓣6，細(xì)小，與花 萼互生，先端截形，微凹，基部漸狹，雄蕊6，花藥近方形，花絲分離，先端膨大；雌花萼片與 雄花相同，花瓣較小，匙形，退化雄蕊6，棒狀，心皮3。核果球形，紅色?；ㄆ? 5月。果期9 11月。生于疏林下或灌木叢中，有時亦生于山上巖石旁邊的紅壤地中。分布廣東， 廣西、貴州等地。青牛膽纏繞藤本。根深長，塊根黃色，形狀不一。小枝細(xì)長，粗糙有槽紋，節(jié)上被 短硬毛。葉互生，具柄；葉片卵狀披針形，長7 13厘米，寬2. 5 5厘米，先端漸尖或鈍， 基部通常尖銳箭形或戟狀箭形，全緣；兩面被短硬毛，脈上尤多?；▎涡?，雌雄異株，總狀花 序；雄花多數(shù)，萼片橢圓形，外輪3片細(xì)??；花瓣倒卵形，基部楔形，較萼片短；雄蕊6，分離， 直立或外曲，長于花瓣，花藥卵圓形，退化雄蕊長圓形，比花瓣短；雌花4 10朵，小花梗較 長；心皮3或4枚，柱頭裂片乳頭狀。核果紅色，背部隆起，近頂端處有時具花柱的遺跡?；?期3 5月。果期8 10月。生于灌木林下石隙間。分布廣西、湖南、湖北、四川、貴州等 地。廣西地區(qū)尚有覆瓦葉金果欖，功效相同。金果欖性狀呈不規(guī)則圓塊狀，長5 10cm，直徑3 6cm。表面棕黃色或淡褐色， 粗糙不平，有深皺紋。質(zhì)堅(jiān)硬，不易擊碎、破開，橫斷面淡黃白色，導(dǎo)管束略呈放射狀排列，色 較深。氣微，味苦(參見《中國藥典》2005年版一部，150頁)。本實(shí)驗(yàn)使用的藥材金果欖購自湖北省恩施州咸豐縣藥材公司?？愘e(Columbin)是防己科植物金果欖Tinospora capiltopies feign印的干燥 塊根中提取得到的呋喃二萜類化合物，上海藥物研究所率先從金果欖中提取純化出咖倫賓 的高純度結(jié)晶，并進(jìn)行了理化性質(zhì)的測定和結(jié)構(gòu)鑒定。咖倫賓的理化性質(zhì)咖倫賓純品為白色針晶，味苦，常溫穩(wěn)定。mp 1950C (甲 醇結(jié)晶)，旋光度為[α 1+52. 50 (吡啶)。分子式為C2tlH22O6,分子量為358. 38。不 溶于水，Ig咖倫賓可溶于30mL丙酮、50mL乙酸乙酪、75mL甲醉，易異構(gòu)化為異 咖 倫 賓(參 見 Choudhury M. K, et al. Structural elucidation of coIumbin, aditerpene isolatedfrom the rhizomes of Artistolochia albida. Indian Journal ofPharmaceutical Sciences (1997),59(1),34-37.禾口 Swaminathan K, et al. Structure ofcolumbin, a diterpenoid furanolactone from Tinospora cordifolia Miers. ActaCrystallographica, Section C :Crystal Structure Communications (1989), C 45(2) ,300-3.)?？愘e已被確認(rèn)為是一個具有呋喃環(huán)二萜類內(nèi)酯的化合物，結(jié)構(gòu)見

圖1。咖倫賓具有呋喃環(huán)的共軛雙鍵結(jié)構(gòu)和兩個羰基結(jié)構(gòu)、一個C = C雙鍵，紫外光譜中 共軛雙烯在λ max 215 270 ( ε 2500 30000)有最大吸收，而含有α，β -不飽和羰基功 能團(tuán)則在λ max220 250( ε 10000 17500)有最大吸收。咖倫賓的提取工藝文獻(xiàn)使用的是熱提法，用乙醚提取咖倫賓(參見朱任宏等.金 果欖中的植物及堿中性物質(zhì).化學(xué)學(xué)報1955，21 :168)，參照文獻(xiàn)方法，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中增加 了用甲醇重結(jié)晶步驟。本發(fā)明具體按以下方法提取咖倫賓金果欖粉碎為金果欖粗粉^g(約100目)，用乙醚浸泡48h，乙醚提取液過濾后 37°C常壓蒸餾濃縮得浸膏，浸膏加入甲醇中(約為粗品量的20 25倍)，水浴64°C加熱溶 解完全，趁熱抽濾，濾液置冰水浴中池，析出結(jié)晶，抽濾，少量甲醇洗滌，干燥，稱重，然后測 定收率。合并提純的提取物，稱重為40. 6g，收率為40. 6g/5000g = 0.812%。產(chǎn)物的鑒定1、化學(xué)法將約Img按上述本發(fā)明提取方法制得的提純品加入約IOmL水中，超聲波震蕩30min，不溶解；加入3滴0. IM的NaOH溶液，邊加邊震蕩，溶解；加入3滴0. IM的 H2SO4溶液震蕩，有沉淀析出。試驗(yàn)現(xiàn)象符合內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的二萜的溶解特性(參見姚新生等， 《天然藥物化學(xué)》第四版，243頁)。熔點(diǎn)測定本實(shí)驗(yàn)用X4型顯微熔點(diǎn)儀來測定熔點(diǎn)。顯微鏡下可見提純品為針狀結(jié) 晶，測定熔點(diǎn)為183 185°C (文獻(xiàn)值m.p. 183 184°C )，與文獻(xiàn)描述相符(參見李泓波 等.江西青牛膽的化學(xué)成分.天然藥物研究與開發(fā)，2005，17 O) :125-127)。2、紫外光譜甲醇溶解提純品QOO μ g.mL—1)，進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果顯示紫外最 大吸收波長為218nm，與文獻(xiàn)描述相符(參見^feng Zhang, et al. Characterization of isoquinoline alkaloids, diterpenoids and steroids in the Chineseherb Jin-Guo-Lan(Tinospora sagittata and Tinospora capillipes)byhigh-performance liquid chromatography/electrospray ionization with mu11 i stagemas s spectrometry. Rapid Commu. Mass Spectrom. 2006 ；20 :2328-2342), B 2。圖 2 為咖倫賓 提純品的紫外吸光度-波長曲線圖，掃描儀器為756PC紫外可見分光光度計(jì)(掃描型)；掃 描條件是最小波長200nm，最大波長600nm，掃描間隔Inm ；峰高下限0. 0100。最大吸收波長 為218nm，吸光度為1. 22M，符合咖倫賓紫外吸收特征以及文獻(xiàn)的描述。3、色譜法用薄層色譜法檢驗(yàn)提純品，對照品(含量> 99% )由本室提供，展開劑 為氯仿甲醇-7 3，顯色劑為5%的硫酸。結(jié)果顯示，提純品展開后僅有一個點(diǎn)，且和對照 品Rf值相同。HPLC方法使用島津Siimadzu 10A高效液相色譜儀，紫外檢測波長為217nm， 流動相為甲醇乙腈水-20 20 60，提純品和對照品濃度為70 μ g.mL、分別對其進(jìn) 行HPLC分析。結(jié)果顯示，提純品與對照品色譜行為一致，沒有明顯雜質(zhì)峰。典型色譜圖見 圖3和圖4。4、質(zhì)譜法使用儀器為LCQ型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(離子阱檢測器，美國 Finnigan公司產(chǎn)品)。流動相為甲醇水-90 10 (V/V)，流速為5 μ L. mirT1 ；提純品溶 于甲醇，濃度為200 μ g.mL—1，進(jìn)樣量10 μ L。質(zhì)譜條件離子源為電噴霧離子源(ESI)； 檢測方式為正離子檢測；碰撞氣氦氣；鞘氣氮?dú)猓?單位，流速為0. 75L. mirT1 ；輔助 氣氮?dú)?，流速?. 15L. mirT1 ；離子源噴射電壓4. 5kV ；毛細(xì)管溫度300°C，電壓19V ；掃 描質(zhì)量范圍100 800。ESI-MSm/z結(jié)果一級質(zhì)譜圖中準(zhǔn)分子離子峰為359[M+H]+， 其他主要碎片峰為315 [M-CO2] +和376 [M+HNj + ；對準(zhǔn)分子離子峰359 [M+H] +進(jìn)行二級 質(zhì)譜掃描，主要碎片離子峰為m/z 313，經(jīng)比較均與文獻(xiàn)一致(參見Yufeng Zhang, et al.Characterization of isoquinoline alkaloids, diterpenoids and steroids in the Chineseherb Jin-Guo-Lan(Tinospora sagittata and Tinospora capillipes) byhigh-performance liquid chromatography/electrospray ionization with multistagemass spectrometry. Rapid Commu. Mass Spectrom. 2006 ;20 :2328-2342)。質(zhì)譜 掃描圖見圖5，圖6。含量測定使用島津Siimadzu 10A紫外高效液相色譜儀，流動相為乙腈 水-40 60，檢測波長為217nm。將對照品和本發(fā)明提純品用甲醇溶解配制成2. 24 μ g. πιΓ1, 分別重復(fù)進(jìn)樣五次，計(jì)算各自平均峰面積。相對含量=SeZSi = 170932/180145 = 98.7% (SE, S1分別為本發(fā)明提純品和對照品平均峰面積)，色譜圖見圖7和圖8。從化學(xué)法看出本發(fā)明提純物為含內(nèi)酯環(huán)的二萜類化合物，熔點(diǎn)測定其熔點(diǎn)為183 185°C，紫外光譜顯示最大吸收為218nm，色譜法顯示提純品與對照品的色譜行為一 致，質(zhì)譜掃描ESI-MS m/z為359 [M+H]+、315 [M-CO2]+、376 [Μ+HNj+，以上結(jié)果均符合文獻(xiàn)對咖 倫賓特征的描述。表明本發(fā)明提取方法得到的提純物即為咖倫賓，其相對含量為98. 7%?？愘e對2型糖尿病大鼠的降糖作用實(shí)驗(yàn)資料本發(fā)明實(shí)驗(yàn)通過高糖高脂喂飼聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠 模型，觀察咖倫賓對2型糖尿病大鼠的降糖作用。1.藥物及配制咖倫賓按上述的本發(fā)明方法從金果欖粉末中提取制備得到，其相對含量 98. 7 %，用2 %吐溫-蒸餾水配成5mg/ml、10mg/ml的混懸溶液使用。二甲雙胍(深圳市中聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品)，用生理鹽水配成40mg/ml的混懸液使用。2.動物造模及分組Sprague Dawley(SD)大鼠(n = 80)，雌雄各半，體重200士20g，購自華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。清潔級飼養(yǎng)，自由攝食、攝水，室溫控制在20-29°C，12小時光照 周期。用高糖高脂飼料喂養(yǎng)3個月，聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司產(chǎn)品)30mg/ kg腹腔注射，建立實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型(參見K. Srinivasan，B. Viswanad et al. Combination of high-fat diet-fed and low-dosestreptozotocin-treated rat A model for type 2diabetes and pharmacological screening. Pharmacological Research, 2005, 52 :313-320)。以空腹血糖(FBG)彡11. lmmol/L為造模成功。將大鼠按血糖隨機(jī)分為5組正常 對照組、模型對照組、咖倫賓低劑量組、咖倫賓高劑量組和陽性對照(二甲雙胍)組，灌胃給 藥，每天1次，連續(xù)給藥4周。具體分組如下
分組給藥
正常對照組蒸餾水(5ml/kg)
模型對照組蒸餾水(5ml/kg)
二甲雙胍組二甲雙胍200mg/kg 咖倫賓低劑量組 咖倫賓25mg/kg
咖倫賓高劑量組咖倫賓50mg/kg3.測定指標(biāo)及方法(1) 一般指標(biāo)各組動物每10天稱量體重1次，每2周測空腹血糖1次。(2)葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)第4周末次給藥前，大鼠禁食10h，不禁水。末次給藥后池， 眼眶靜脈叢采血測定血糖值(作為Oh血糖)。然后各組大鼠用50%葡萄糖液(2. 0g/kg) 灌胃，眼眶采血，分離血清，依照葡萄糖氧化酶(G0D-P0D)法測定0.5、1、池血糖水平。
(3)血脂測定空腹采血后按照試劑盒方法，分別檢測血清中總膽固醇(TC)、甘油 三酯(TG)、游離脂肪酸(FFA)。(4)血清Ins檢測及胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index, ISI)計(jì)算 大鼠第4周末次給藥后2h,眼眶靜脈叢采血，按照胰島素放射免疫分析試劑盒方法，測定 血清中insulin含量及空腹血糖(FBG)，按文獻(xiàn)方法求算ISI，即FBG與FINS (空腹胰島素 值)乘積倒數(shù)的自然對數(shù) ISI = [In 1/(FBG^FINS)](參見 S. Inchiostro. Measurement of insulin sensitivity in Type 2diabetes mellitus comparison between KITT and HOMA-% S indices and evaluation of theirrelationship with the components of the insulin resistance syndrome. DiabeticMedicine, 2004, 22 :39-44.)。(5)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11. 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。4.結(jié)果(1)動物體重變化模型對照組、咖倫賓低劑量組、咖倫賓高劑量組、二甲雙胍組 動物體重在給藥期間均有下降趨勢，但與正常對照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。表1.給藥期間各組大鼠體重的比較(gJ士s)
權(quán)利要求
1.咖倫賓在制備用于治療2型糖尿病藥物中的應(yīng)用。
2.一種用于治療2型糖尿病的藥物制劑，其特征在于含有有效量的咖倫賓和藥學(xué)上可 接受的載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于治療2型糖尿病的藥物制劑，其特征在于它是片劑、膠囊 或注射劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的治療2型糖尿病的藥物，該治療2型糖尿病的藥物是咖倫賓，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證實(shí)，咖倫賓具有良好的降糖作用，能改善糖耐量，降低血脂，增加對胰島素的敏感性，可以作為藥物用于2型糖尿病的治療。
文檔編號A61P3/10GK102091066SQ20091027317
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者文小平, 柯徐, 袁世英, 趙剛, 陳匯, 顧世芬 申請人:華中科技大學(xué)