β-葡萄糖苷酶磁性分子印跡材料及其在知母皂苷BII轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種β-葡萄糖苷酶磁性分子印跡材料，以β-葡萄糖苷酶為模板分子，聚乙烯-乙烯醇為交聯(lián)劑，通過聚乙烯-乙烯醇相轉(zhuǎn)化法制備。制備方法簡(jiǎn)單，避免了繁瑣的直接聚合方法，制備過程可控，水解效率明顯提高。本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)化知母皂苷BII的方法，其使用所述的β-葡萄糖苷酶磁性分子印跡聚合物水解知母皂苷BII為知母皂苷AⅢ。
【專利說明】β -葡萄糖苷酶磁性分子印跡材料及其在知母皂苷BI I轉(zhuǎn) 化中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高分子聚合物材料，具體地涉及識(shí)別β -葡萄糖苷酶的磁性分子 印跡聚合物。
[0002] 本發(fā)明還涉及該高分子印跡聚合物材料的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0003] β -葡萄糖苷酶（EC 3. 2. L 21) ( β -glucosidase)，屬于水解酶類，又稱β -D-葡 萄糖苷水解酶，別名龍膽二糖酶、纖維二糖酶和苦杏仁苷酶。它可催化水解結(jié)合于末端非還 原性的β-D-糖苷鍵，同時(shí)釋放出配基與葡萄糖體。
[0004] β -葡萄糖苷酶廣泛存在于自然界中，它可以來源于植物、微生物，也可來源于 動(dòng)物。β -葡萄糖苷酶按其底物特異性可以分為三類：第一類是能水解烴基-β -葡萄糖 苷或芳香基-β -葡萄糖苷的酶，此類β -葡萄糖苷酶能水解的底物有纖維二糖、對(duì)硝基 苯-β -D-葡萄糖苷等；第二類是只能水解烴基-β -葡萄糖苷的酶，這類β -葡萄糖苷酶 能水解纖維二糖等；第三類是只能水解芳香基-β -葡萄糖苷的酶，這類酶能水解對(duì)硝基 苯-β -D-葡萄糖苷等類似物。
[0005] 分子印跡技術(shù)（molecular imprinting technology,ΜΙΤ)是近十幾年來才發(fā)展起 來的一門邊緣科學(xué)技術(shù)，它結(jié)合了高分子化學(xué)、生物化學(xué)等學(xué)科，是模擬抗體-抗原相互作 用的一種新技術(shù)，具有選擇性識(shí)別位點(diǎn)的性質(zhì)。在合適的溶劑中模板分子與功能單體依靠 分子間作用力形成主客體配合物，再加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，引發(fā)聚合形成穩(wěn)定的高分子聚 合物，即分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers, MIPs),被廣泛用來選擇性富 集復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)分子。MIPs現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于色譜分離、抗體和受體模擬物、固相萃取、生 物傳感器等領(lǐng)域，分子印跡技術(shù)已擴(kuò)大到環(huán)境的分析甚至反應(yīng)介質(zhì)的領(lǐng)域中，也可用應(yīng)用 于生物遙感、生物分離以及靶向藥物等領(lǐng)域。
[0006] 蛋白質(zhì)的成功印跡使得MIPs可有效識(shí)別大分子物質(zhì)。一般來說，通過酶聯(lián)免 疫吸附試驗(yàn)（ELISA)，天然抗體可以用來定量蛋白質(zhì)在MIPs中的吸附量。由于抗體只識(shí) 別特定結(jié)構(gòu)（抗原決定基），由此可以認(rèn)為許多具有特定結(jié)構(gòu)的目標(biāo)蛋白質(zhì)毫無(wú)損傷的 與MIPs結(jié)合。這樣，印跡蛋白質(zhì)在大多數(shù)情況下便可保持其生物活性，例如當(dāng)與β-葡 萄糖苷酶結(jié)合時(shí)便保持其催化活性。然而，在MIPs的制備過程中可能會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生變 性從而影響MIPs整體的活性。例如，近期研究發(fā)現(xiàn)，二甲亞砜（DMSO)可以使溶解酵素失 活(Voets, I. K. , Cruz, ff. A. , Moitzi, C. , Lindner, P. , Schurtenberger, [J]. Phys. Chem. B 2010, 114, 11875-11883.)。海登發(fā)明了胰蛋白酶MIPs，固定于石英晶體監(jiān)控器芯片上用于 監(jiān)測(cè)天然的和變性的胰蛋白酶。因此，固定酶的分子印跡材料的酶活性研究是合理并且必 要的。
[0007] 葡萄糖苷酶催化水解產(chǎn)生葡萄糖在生物資源【技術(shù)領(lǐng)域】非常重要。研究葡萄糖苷酶 的固定化對(duì)于工業(yè)應(yīng)用中減少酶的消耗有著十分重要的意義。通常情況下，運(yùn)用生物材料 固定葡萄糖苷酶對(duì)于酶活性有較大影響，并且在酶的補(bǔ)充過程影響葡萄糖生產(chǎn)操作的連續(xù) 性?，F(xiàn)有酶固定化方式主要運(yùn)用溫度敏感的細(xì)胞膜、天然大分子聚合物、殼聚糖材料、羥磷 灰石、纖維素纖維、玻璃微球、氧化鋯以及最新發(fā)現(xiàn)的藻朊酸鹽等。由于300?400nm級(jí)的 磁性殼聚糖微球可以降低分散的濃度梯度以及提高水解速率，磁性殼聚糖微球也已經(jīng)用于 固定化酶來提高酶的催化效能。
[0008] 目前，磁性納米顆粒結(jié)合MIPs應(yīng)用于大分子靶向物質(zhì)的相關(guān)研究工作已有報(bào)道。 如已經(jīng)成功制備了白蛋白、溶解酵素、血紅蛋白和核糖核酸酶等磁性MIPs，干涉吸附試驗(yàn)使 用非目標(biāo)蛋白質(zhì)等。并且許多文獻(xiàn)已報(bào)道MIPs的可重復(fù)性研究，但是卻沒有對(duì)其重復(fù)利用 的活性作深入探討。在分子印跡過程中可能會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的變性從而使其失去原有功 能，或者是使用的溶劑，或者是功能單體，聚合物以及模板之間分子間強(qiáng)作用力的影響。鑒 于此種情況，抗原決定基也一直是與印跡蛋白反應(yīng)，因此，印跡分子蛋白應(yīng)該具有一定催化 活性。
[0009] Fe3O4磁性納米粒子具有特殊的磁導(dǎo)向性、超順磁性及表面可連接生化活性功能基 團(tuán)，可以有效地利用磁性納米粒子的磁性和分子印跡的特異識(shí)別性來進(jìn)行目標(biāo)分子的快速 磁分離。在外加磁場(chǎng)下，含有磁性的核殼結(jié)構(gòu)分子印跡納米球，可對(duì)目標(biāo)物實(shí)現(xiàn)快速磁分離 等特性，因此，在磁性粒子表面進(jìn)行分子印跡，合成磁性分子印跡聚合物核殼微球，使其兼 具良好的超順磁性和高選擇吸附性兩大優(yōu)點(diǎn)。
[0010] 中藥知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodel ides Begs.的干燥根莖，具 有清熱瀉火、滋陰清肺、生津潤(rùn)燥等功效。知母皂苷B II為中藥知母中提取出來的含兩個(gè)糖 鏈的水溶性皂苷，以知母皂苷AIII為母核的知母皂苷B II的含量很高，2010年版《中國(guó)藥典》 一部規(guī)定，知母藥材中知母皂苷B II的含量>3%，文獻(xiàn)報(bào)道藥材中知母皂苷B II含量多在 5%左右，最高可達(dá)10. 25%，但知母皂苷A III在知母藥材中含量較低（約0. 3% )。
[0011] 藥理研究表明，知母皂苷B II具有抑制血栓形成、改善大腦缺血再灌注損傷引起 的記憶及學(xué)習(xí)功能障礙及對(duì)原代大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，而知母皂苷A III具有抗血 小板聚集、抗老年癡呆、抗腫瘤和降糖等作用。尤其在抗腫瘤方面，知母皂苷A III表現(xiàn)出很 強(qiáng)的藥理活性，對(duì)結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌等均有抑制作用。可見知母皂苷A III的藥理活性 要比知母皂苷B II的高。
[0012] β -葡萄糖苷酶（beta glycosidase)，屬于水解酶類，又纖維二糖酶。它的特性 是可水解結(jié)合于末端、非還原性的β-D-糖苷鍵，同時(shí)釋放β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基。但 是用β -葡萄糖苷酶水解知母皂苷B II，得到的產(chǎn)物不易與β -葡萄糖苷酶分離。
[0013] 英文縮寫：
[0014] 1.麗IPs磁性分子印跡聚合物；2.麗IPs磁性非分子印跡聚合物；3. EVAL乙烯/乙 烯醇共聚物；4. SDS十二烷基硫酸鈉；5. MNP磁性納米Fe3O4 ;6. SEM掃描電鏡圖；7. TEM透射 電鏡圖。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明提供一種磁性分子印跡聚合物（MMIPs)，經(jīng)改進(jìn)后的聚乙烯-乙烯醇印跡 的β_葡萄糖苷酶的活性用水解水楊苷來表征，并進(jìn)行重吸附。為了能夠使固定酶的印跡 聚合物與反應(yīng)物和產(chǎn)物快速分離，用磁性粒子包覆在分子印跡聚合物上。
[0016] 本發(fā)明還提供應(yīng)用上述β -葡萄糖苷酶磁性分子印跡聚合物水解轉(zhuǎn)化知母皂苷 BII的方法。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種β -葡萄糖苷酶磁性分子印跡材料，以β -葡萄糖 苷酶為模板分子，聚乙烯-乙烯醇為交聯(lián)劑，通過聚乙烯-乙烯醇相轉(zhuǎn)化法制備。
[0018] 所述的β -葡萄糖苷酶磁性分子印跡聚合物，優(yōu)選地，以下述方法制備：
[0019] 1)制備Fe304磁性納米粒子，并用油酸改性。
[0020] 2)在聚乙烯-乙烯醇交聯(lián)劑存在下，將β -葡萄糖苷酶分子固定于Fe3O4磁性納 米粒子上。
[0021] 所述的β -葡萄糖苷酶磁性分子印跡聚合物，其中所述制備方法包括：
[0022] a)制備Fe304磁性納米粒子；
[0023] b)將獲得的Fe3O4磁性納米粒子用油酸進(jìn)行表面改性；
[0024] c)在聚乙烯-乙烯醇交聯(lián)劑存在下，將β -葡萄糖苷酶分子固定于Fe3O4磁性納 米粒子上；
[0025] d)重吸附并在磁場(chǎng)條件下分離獲得β -葡萄糖苷酶磁性分子印跡聚合物。
[0026] 所述的β -葡萄糖苷酶磁性分子印跡聚合物，更優(yōu)選地，以下述方法制備：
[0027] V)在乙二醇中溶解Fe3O4WH2O形成黃色溶液，在上述溶液中加入乙酸鈉和聚乙二 醇2000, 200°C下反應(yīng)，至反應(yīng)完成后，用無(wú)水乙醇和去離子水分別洗滌后干燥后得Fe3O4磁 性納米粒子；
[0028] vi)將步驟i)的磁性納米粒子加熱加入油酸對(duì)Fe3O4磁性納米粒子進(jìn)行改性，反應(yīng) 完成后將溶液冷卻至室溫，用蒸餾水反復(fù)洗滌油酸包裹的Fe 3O4直至pH = 7,然后在200°C 真空下干燥，即得黑色的油酸改性的Fe3O4磁性納米粒子；
[0029] vii)取以DMSO為溶劑的聚乙烯-乙烯醇澄清溶液，將β -葡萄糖苷酶溶解在上 述溶液中，然后加入步驟ii)制備的Fe3O4磁性納米粒子，室溫下攪拌混勻；每次取0. 5mL含 有酶的DMS0/EVAL溶液分散在IOmL的分散劑中，所述分散劑組成為：用4mL的去離子水和 6mL的異丙醇組成水-異丙醇混合液為分散劑，可得磁性分子印跡聚合物；
[0030] viii)用0. 1 %的SDS溶液和去離子水洗步驟iii)獲得的磁性分子印跡聚合物， 在pH = 4. 8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中進(jìn)行重吸附，然后在磁場(chǎng)條件下分離獲得固定 β-葡萄糖苷酶的磁性分子印跡聚合物。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種轉(zhuǎn)化知母皂苷BII的方法，其使用所述的β-葡 萄糖苷酶磁性分子印跡聚合物水解知母皂苷BII為知母皂苷A III。
[0032] 所述的方法，優(yōu)選的水解反應(yīng)溫度為55°C，時(shí)間為2小時(shí)。
[0033] 本發(fā)明將β -葡萄糖苷酶與Fe3O4磁性納米粒子結(jié)合，形成β -葡萄糖苷酶磁性 分子印跡聚合物，在制備MMIPs中使用聚乙烯-乙烯醇為交聯(lián)劑，并進(jìn)行重吸附過程，制備 方法簡(jiǎn)單，避免了繁瑣的直接聚合方法，制備過程可控。重吸附后去除了對(duì)水解有影響的溶 齊U，水解效率明顯提高。使用本發(fā)明的β_葡萄糖苷酶磁性分子印跡聚合物可有效將知母 皂苷BII水解轉(zhuǎn)化為知母皂苷A III。
[0034] 附圖簡(jiǎn)述
[0035] 圖1為固定β -葡萄糖苷酶的MMIPs水解水楊苷過程示意；
[0036] 圖2為固定β -葡萄糖苷酶的麗IPs (a)和麗IPs (b)的掃描電子顯微鏡照片；
[0037] 圖3為磁性納米Fe3O4 (MNP) (a)、固定β -葡萄糖苷酶的MMIPs (b)和MNIPs (c)的 透射電子顯微鏡照片；
[0038] 圖4為紅外光譜圖：(a)油酸改性后的Fe3O4磁性納米粒子，（b)麗IPs和（c) MMIPs ;
[0039] 圖5為葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0040] 圖6(a)牛白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，（b) β-葡萄糖苷酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線，（C)麗IPs對(duì)β-葡 萄糖苷酶和牛白蛋白的吸附量；
[0041] 圖7為β -葡萄糖苷酶MMIPs水解水楊苷的重復(fù)性水解率；
[0042] 圖8為知母皂苷A III和B II的結(jié)構(gòu)式；
[0043] 圖9知母皂苷BII樣品的轉(zhuǎn)化率；
[0044] 圖10為β -葡萄糖苷酶磁性分子印跡聚合物水解的最佳溫度；
[0045] 圖11為β -葡萄糖苷酶磁性分子印跡聚合物水解的最佳反應(yīng)時(shí)間
[0046] 圖12為固定β -葡萄糖苷酶MMIPs的重復(fù)使用及其對(duì)催化知母皂苷B II水解性 能的影響。

【具體實(shí)施方式】 [0047] 儀器與試劑
[0048] 所有儀器與配制試劑原料均為商購(gòu)。
[0049] 知母皂苷B II，知母皂苷AIII :上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)100420,純度 >98%。
[0050] DNS試劑：準(zhǔn)確稱取酒石酸鉀鈉300. Og完全溶于500mL蒸餾水中，標(biāo)記為A試液。 準(zhǔn)確稱取氫氧化鈉16. Og完全溶于250mL蒸餾水中，標(biāo)記為B試液。準(zhǔn)確稱取3, 5-二硝基 水楊酸10. Og完全溶于B試液中，標(biāo)記為C試液。將C試液和A試液混合用蒸餾水定容至 IOOOmL,標(biāo)記為DNS試劑。DNS試劑用棕色瓶放置7天后，用細(xì)紗布過濾蔽光保存。
[0051] 醋酸-醋酸鈉緩沖液（〇· lmol. L, pH = 4. 8):溶液A -量取冰醋酸6mL,定容至 IOOOmL,制成0. Imol Γ1醋酸溶液；溶液B-稱取8. 2g醋酸鈉，溶解后容至IOOOmL,制成 0. Imol IZ1醋酸鈉溶液。使用是以A:B = 4:6的比例混合,低溫冷藏備用。
[0052] 葡萄糖對(duì)照品溶液：精密稱取70°C干燥至恒重的葡萄糖0. 2000g，用去離子水溶 解并定容至IOOmL,即得0. 2%的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0053] 知母皂苷水解樣品的制備：取四份0. 5%知母皂苷各5mL分別加入到放置了未洗 去葡萄糖苷酶的MMIPs、MNIPs、重吸附葡萄糖苷酶的MMIPs及不含酶的磁性納米粒子的燒 杯中，并置于55°C下，水解20min，水浴蒸干后，甲醇復(fù)溶，定容至12. 5mL，用于皂苷成分的 分析。
[0054] 知母皂苷B II的對(duì)照品溶液：取5mg的知母皂苷B II定容至IOmL的容量瓶中，即 得0. 5mg/mL的對(duì)照品溶液。
[0055] β -葡萄糖苷酶水解樣品的制備：稱取知母阜苷B II 5mg，一定量的β -葡萄糖苷 酶12U，加入IOmL醋酸-醋酸鈉緩沖液緩沖液，于55°C反應(yīng)3h，85°C水浴加熱5min，滅活。 水浴蒸干后，甲醇復(fù)溶，定容至12. 5mL，用于皂苷成分的分析。
[0056] Ehrlish試劑：對(duì)鹽酸二甲氨基苯甲醒試劑（Ig對(duì)二氨基苯甲醒+30mL乙醇+30mL 濃鹽酸）。
[0057] 3-葡萄糖苷酶的活力測(cè)定：取0.51^酶液，加入0.511^0.5%的水楊苷（溶劑為 pH = 4. 8緩沖溶液）于55°C下保存20min，然后加入ImL DNS試劑混合于沸水中保存5min， 冷卻后加蒸餾水至10mL，在510nm下測(cè)其吸光度值。以加熱滅活的酶按同樣方法處理作空 白（酶活單位：每Imin產(chǎn)生1 μ mol葡萄糖所需酶量為1U)。
[0058] 實(shí)施例1、β -葡萄糖苷酶磁性分子印跡材料的制備和性能測(cè)定
[0059] 1.磁性分子印跡微球的制備
[0060] I. 1磁性Fe3O4的制備
[0061] 在40mL的乙二醇中溶解1.35g Fe304.6H20形成黃色溶液，在上述溶液中加入 3. 60g乙酸鈉和0. IOg聚乙二醇2000,攪拌30min，繼而轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯襯底的全自動(dòng)不 銹鋼高壓反應(yīng)釜中。將反應(yīng)釜密封并在200°C下反應(yīng)8h。反應(yīng)完成后，用無(wú)水乙醇和去離 子水分別洗滌6次。后在真空干燥箱中60°C烘干12h。干燥后得產(chǎn)物。
[0062] 1. 2磁性納米粒子的表面改性處理
[0063] 將磁性納米粒子加熱到60°C時(shí)，逐滴加入油酸對(duì)Fe3O4磁性納米粒子進(jìn)行改性，攪 拌反應(yīng)lh，反應(yīng)停止后，溶液冷卻至室溫，用蒸餾水反復(fù)洗滌油酸包裹的Fe 3O4直至pH = 7， 然后在200°C真空下干燥，即得黑色的油酸改性的Fe3O4磁性納米粒子。
[0064] 1.3酶的固定化
[0065] 取 20mL 以 DMSO 為溶劑的 EVAL 澄清溶液（EVAL/DMSO = I. Owt % )，將 lmg/mL 的 β -葡萄糖苷酶溶解在上述溶液中，然后加入25mg磁性納米粒子，室溫下攪拌混勻。然后， 每次取0. 5mL的EVAL溶液分散在在IOmL的分散劑水-異丙醇混合液中（用4mL的去離子 水和6mL的異丙醇）。非印跡磁性分子的制備與上述步驟相同，只是在酶的固定化中不加入 β-葡萄糖苷酶。
[0066] I. 4MIPs重新吸附β -葡萄糖苷酶
[0067] β -葡萄糖苷酶的去除：用0. 1 %的SDS溶液和去離子水各洗三次。
[0068] 重新吸附：重吸附在pH = 4. 8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中進(jìn)行，在30min時(shí)達(dá)到 最大吸附，然后在磁場(chǎng)條件下分離MMIPs。將所制得的材料于低溫下凍干。
[0069] 2.分子印跡材料的性能檢測(cè) [0070] 2. 1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定
[0071] 分別吸 0· 2% 的葡萄糖溶液 0,0· 2,0· 4,0· 6,0· 8,1. OmL 于試管 1，2, 3, 4, 5, 6 號(hào)中， 再加2. OmL DNS試劑，用蒸餾水將每支試管加水到10. OmL，混合后在沸水中煮沸20min，冷 卻后用蒸餾水稀釋至25. OmL。以空白為參比溶液，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)510nm下測(cè)定吸光 度值。
[0072] 2. 1麗IPs的水解性能檢測(cè)
[0073] 2. 2. 1 β -葡萄糖苷酶-MMIPs的性能檢測(cè)
[0074] 取0. 5%水楊苷IOmL分別加入到盛有重吸附β -葡萄糖苷酶的麗IPs及麗IPs、 MMIPs (未脫除模板）、MMIPs (脫除模板）和MNIPs各IOmg的5個(gè)50mL具塞三角瓶中，并 置于55°C保持20min。經(jīng)過磁性分離后，分別加入ImL DNS試劑，混勻并置于沸水中顯色 20min后，冷卻，加蒸餾水至25mL，在510nm下測(cè)定其吸光度值。
[0075] 2. 3對(duì)β -葡萄糖苷酶的選擇性
[0076] 分別取用pH = 4. 8的緩沖溶液配制的濃度均為lOOmg/L的β -葡萄糖苷酶和牛 白蛋白的溶液各10. OmL，分別加入一定量洗去模板的MMIPs顆粒，室溫下震蕩12h，加入磁 場(chǎng)分離后，用紫外-可見分光光度計(jì)分別測(cè)量上層清液的吸光度。
[0077] 2. 4重吸附利用率測(cè)定
[0078] 將重吸附的麗IPs按2. 2. 1水解步驟反復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)量每次的吸光度，計(jì)算出水解 率。
[0079] 3.結(jié)果和討論
[0080] 3. 1水解過程
[0081] β-葡萄糖苷酶的 MMIPs 對(duì)水楊苷（2_ (Hydroxymethyl) phenyl-beta-D-glucopyranoside)的水解過程如圖1所示。左上方燒杯為水楊苷溶液，下 方燒杯內(nèi)為β-葡萄糖苷酶-MMIPs (MNP為磁性納米粒子，MMIPs為固定β-葡萄糖苷酶的 MMIPs)。將固定β-葡萄糖苷酶的MMIPs加入水楊苷溶液中，MMIPs表面吸附的酶催化溶 液中水楊苷發(fā)生水解反應(yīng)，1分子的水楊苷生成1分子的葡萄糖和1分子水楊酸。
[0082] 3. 2磁性材料表征
[0083] 3. 2. ISEM
[0084] 圖2為固定β-葡萄糖苷酶的麗IPs以及麗IPs的掃描電鏡圖（SEM)。固定β-葡 萄糖苷酶的麗IPs (圖2a)表面相對(duì)于麗IPs (圖2b)表面更為均勻，主要是在制備麗IPs 的過程中，由于酶分子的作用使得乙烯/乙烯醇聚物包覆于磁球表面并形成均勻的空穴。
[0085] 3. 2. 2TEM
[0086] 圖3為MNP、麗IPs和麗IPs的透射電鏡圖（TEM)。從圖3a可以看出，磁性Fe3O 4 粒子基本呈球形且大小較為均勻，經(jīng)測(cè)量其平均粒徑大約在500nm以下；圖3b和從圖3c整 個(gè)微球中未出現(xiàn)明顯的分相，說明麗IPs與麗IPs均有有較高的Fe 3O4含量，并且麗IPs和 MNIPs中的MNP能夠被EVAL所完全包覆，若干MNP成聚集狀態(tài)。
[0087] 3. 2. 3FTIR
[0088] 圖4a為油酸改性后的Fe3O4磁性納米粒子的紅外圖譜。Fe 3O4的吸收峰在580CHT1 附近，但由于納米粒子的尺寸效應(yīng)，基團(tuán)頻率發(fā)生位移。572. 53CHT1處應(yīng)是Fe3O4中的Fe-O 的伸縮及彎曲振動(dòng)而引起的特征峰。從圖中可知磁性印跡聚合物具有Fe3O4的特征吸收峰， 存在磁性微粒；3435. 41CHT1附近對(duì)應(yīng)的寬吸收帶是羧基O-H伸縮振動(dòng)的吸收峰，2921. 45 和2851. 76CHT1對(duì)應(yīng)為油酸分子中CH2-的伸縮振動(dòng)吸收峰，2025. 02CHT1處的強(qiáng)吸收峰和 2050CHT1處的弱吸收峰為油酸中碳碳雙鍵的伸縮振動(dòng)。由此可以證明，油酸成功的包覆在 Fe3O4磁性納米粒子表面。
[0089] 圖4b為麗IPs的紅外圖譜，圖4c為固定β-葡萄糖苷酶的麗IPs的紅外圖譜。對(duì) 比可見，圖4c在3422. 41CHT1處有一寬吸收帶且較圖4a和圖4b的出峰位置藍(lán)移，很可能是 由羧基的O-H伸縮振動(dòng)及聚乙烯-乙烯醇的羥基伸縮振動(dòng)重疊導(dǎo)致出峰位置藍(lán)移。另外，在 1065. 99CHT1處的吸收峰是由聚乙烯-乙烯醇中的C-O伸縮振動(dòng)所形成的，由此推斷在MNP 表面存在聚乙烯-乙烯醇分子。
[0090] 3. 3葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立
[0091] 圖5所示為葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)吸附曲線，由圖可知，吸光度隨葡萄糖濃度呈線性變化， 其中吸光度A與葡萄糖濃度c (g/mL)的關(guān)系式為A = 26. 157c-0. 0659,其相關(guān)系數(shù)R = 0. 989 〇
[0092] 3· 4磁性印跡材料水解性能檢測(cè)
[0093] 重吸附β -葡萄糖苷酶的麗IPs和麗IPs、麗IPs以及麗IPs的水解率如表1所示， 可知,重吸附β-葡萄糖苷酶的MMIPs對(duì)水楊苷的水解率最高，為66. 4%，重吸附β-葡萄 糖苷酶的麗IPs和麗IPs水解率均在20 %以下，麗IPs的水解率在10 %左右。由此可見，重 吸附的麗IPs的水解效能最高，而在制備麗IPs的過程中由于β -葡萄糖苷酶溶解在DMSO 中，其水解活性僅與重吸附β -葡萄糖苷酶的MNIPs相當(dāng)，表明DMSO能破壞β -葡萄糖苷 酶的結(jié)構(gòu)，從而使其失去催化水解活性。
[0094] 表1、MMIPs及MNIPs的吸光度和水解率
[0095]

【權(quán)利要求】
1. 一種β-葡萄糖苷酶磁性分子印跡聚合物，以β-葡萄糖苷酶為模板分子，聚乙 烯-乙烯醇為交聯(lián)劑，通過聚乙烯-乙烯醇相轉(zhuǎn)化法制備。
2. 權(quán)利要求1所述的β-葡萄糖苷酶磁性分子印跡聚合物，其中以下述方法制備： 1) 制備Fe304磁性納米粒子，并用油酸改性。 2) 在聚乙烯-乙烯醇交聯(lián)劑存在下，將β -葡萄糖苷酶分子固定于油酸改性的Fe304磁 性納米粒子上。
3. 權(quán)利要求2所述的β-葡萄糖苷酶磁性分子印跡聚合物，其中所述制備方法包括： a) 制備Fe304磁性納米粒子； b) 將獲得的Fe304磁性納米粒子用油酸進(jìn)行表面改性； c) 在聚乙烯-乙烯醇交聯(lián)劑存在下，將β -葡萄糖苷酶分子固定于Fe304磁性納米粒 子上； d) 重吸附并在磁場(chǎng)條件下分離獲得β-葡萄糖苷酶磁性分子印跡聚合物。
4. 權(quán)利要求3所述的β-葡萄糖苷酶磁性分子印跡聚合物，其中以下述方法制備： i) 在乙二醇中溶解Fe304 · 6Η20形成黃色溶液，在上述溶液中加入乙酸鈉和聚乙二醇 2000, 200°C下反應(yīng)，至反應(yīng)完成后，用無(wú)水乙醇和去離子水分別洗滌后干燥后得Fe304磁性 納米粒子； ii) 將步驟i)的磁性納米粒子加熱加入油酸對(duì)Fe304磁性納米粒子進(jìn)行改性，反應(yīng)完 成后將溶液冷卻至室溫，用蒸餾水反復(fù)洗滌油酸包裹的Fe 304直至pH = 7,然后在200°C真 空下干燥，即得黑色的油酸改性的Fe304磁性納米粒子； iii) 取以DMSO為溶劑的聚乙烯-乙烯醇澄清溶液，將β-葡萄糖苷酶溶解在上述溶液 中，然后加入步驟ii)制備的Fe30 4磁性納米粒子，室溫下攪拌混勻；每次取0.5mL含有酶的 DMSO/EVAL溶液分散在10mL的分散劑中，所述分散劑組成為：用4mL的去離子水和6mL的 異丙醇組成水-異丙醇混合液為分散劑，可得磁性分子印跡聚合物； iv) 用0. 1 %的SDS溶液和去離子水洗步驟iii)獲得的磁性分子印跡聚合物，在pH = 4. 8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中進(jìn)行重吸附，然后在磁場(chǎng)條件下分離獲得固定β-葡萄糖苷 酶的磁性分子印跡聚合物。
5. -種轉(zhuǎn)化知母皂苷ΒΙΙ的方法，其特征在于使用權(quán)利要求1所述的β-葡萄糖苷酶 磁性分子印跡聚合物水解知母皂苷ΒΙΙ為知母皂苷Α III。
6. 權(quán)利要求5所述的方法，其中水解反應(yīng)溫度為55°C，時(shí)間為2小時(shí)。
【文檔編號(hào)】B01J20/30GK104263717SQ201410458154
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月9日
【發(fā)明者】宋興良, 高振珅 申請(qǐng)人:臨沂大學(xué)