一種β?受體激動劑替代模板分子印跡聚合物微球及其制備方法與應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種β?受體激動劑替代模板分子印跡聚合物微球及其制備方法與應用。所述方法包括如下步驟：(1)將模板分子和甲基丙烯酸進行預聚合；模板分子為對羥基苯乙醇或?qū)αu基苯乙胺；(2)向預聚合后的體系中加入二乙烯基苯和偶氮二異丁腈，進行聚合反應得到聚合物；(3)用乙酸的甲醇溶液洗滌聚合物，即得β?受體激動劑替代模板分子印跡聚合物微球。本發(fā)明將利用分子印跡聚合物中的模板分子與激動劑空間構型相匹配、具有多重作用點的空穴，能對激動劑進行選擇性識別，因此具有了更好的包結絡合能力和化學穩(wěn)定性。本發(fā)明測試了分子印跡聚合物磁性微球?qū)Ζ?受體激動劑的吸附性能，并用HPLC/MS/MS對其吸附性能進行檢測，并將其應用與尿液中β?受體激動劑的測定。
【專利說明】
一種β-受體激動劑替代模板分子印跡聚合物微球及其制備方 法與應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種β-受體激動劑替代模板分子印跡聚合物微球及其制備方法與應 用。
【背景技術】
[0002] β-受體激動劑（簡稱，β-激動劑），在醫(yī)學或獸醫(yī)臨床上主要用于擴張支氣管和增 加肺通氣量，可治療支氣管哮喘。激動劑被大量的用于畜牧生產(chǎn)，以促進家畜生長和改善 肉質(zhì)。近些年由于一些養(yǎng)殖業(yè)主受經(jīng)濟利益的驅(qū)使，非法使用"瘦肉精"等激動劑，導致了 動物性食品中該類藥物殘留嚴重超標，消費者食用這類食品后會產(chǎn)生嚴重的毒副作用，至 今已發(fā)生了多起"瘦肉精"集體中毒和活豬供港受阻事件。這些事件的發(fā)生已導致我國畜產(chǎn) 品在國際上聲譽下降和消費者對肉類產(chǎn)品安全性的擔憂，造成了巨大的經(jīng)濟損失和政治影 響，"瘦肉精"等受體激動劑目前已成了困擾我國畜牧業(yè)健康發(fā)展的重大問題。因此建立 一種方便可靠的富集檢測激動劑及其類似物的方法極為重要。
[0003] 分子印跡技術是將要分離的目標分子與功能單體通過共價或非共價作用進行預 組裝與交聯(lián)劑共聚制備得到聚合物。除去目標分子后，聚合物中形成與目標分子空間互補 并具有預定的多重作用位點的"空穴"，對目標分子的空間結構具有"記憶"效應，能夠高選 擇性識別復雜樣品中的印跡分子。但同時也存在模板分子泄露的可能。尤其對于痕量分析， 殘留模板的泄露會直接影響分析結果的準確性，而尋找一個結構與模板分子相似的化合物 即具有相似的母體結構或相同的子官能團。作為替代模板分子可以解決模板分子溶解性能 差，價格高和泄露等問題。
[0004] 用替代模板分子制備的分子印跡聚合物對目標模板分子仍具有較好的選擇性。這 是因為替代模板分子印跡聚合物留下的三維空腔結構和作用位點。與模板分子仍具有一定 的匹配性，此外。替代模板分子還可以解決一些特殊的模板分子因溶解性差而難以制備分 子印跡聚合物的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種β_受體激動劑替代模板分子印跡聚合物微球及其制備 方法與應用，本發(fā)明制備的受體激動劑替代模板分子印跡聚合物微球，可以直接選擇性 分離富集多種受體激動劑，達到快速簡便的分離。
[0006] 本發(fā)明所提供的β_受體激動劑替代模板分子印跡聚合物微球的制備方法，包括如 下步驟：
[0007] (1)將模板分子和甲基丙烯酸進行預聚合；
[0008] 所述模板分子為對羥基苯乙醇或?qū)αu基苯乙胺；
[0009] (2)向所述預聚合后的體系中加入二乙烯基苯和2,2'_偶氮二異丁腈，進行聚合反 應，得到聚合物；
[0010] (3)用乙酸的甲醇溶液洗滌所述聚合物，即得所述β-受體激動劑替代模板分子印 跡聚合物微球。
[0011] 上述的制備方法中，步驟(1)中，所述預聚反應在乙腈中進行；
[0012] 所述預聚反應的溫度可為25°C~30°C，時間可為2~4小時，如在25°C下反應4小 時。
[0013] 上述的制備方法中，步驟(2)中，所述聚合反應在惰性氣氛下進行；
[0014] 所述聚合反應的溫度可為40~60°C，時間可為12~24小時，如在60°C下反應24小 時。
[0015]上述的制備方法中，所述模板分子、所述甲基丙烯酸、所述二乙烯基苯與所述偶氮 二異丁腈的質(zhì)量比可為1:4~10:5~20:0.1~0.4,具體可為1:5.8:6.7:0.14。
[0016]上述的制備方法中，所述乙酸的甲醇溶液中乙酸的質(zhì)量百分含量為5~20%，具體 可為5~10% ;
[0017] 采用所述乙酸的甲醇溶液洗滌所述聚合物，用于去除其中的所述模板分子。
[0018] 上述的制備方法中，所述洗滌步驟之后，所述方法還包括采用甲醇洗滌所述聚合 物的步驟，以除去其中的雜質(zhì)。
[0019]所述方法制備的β_受體激動劑替代模板分子印跡聚合物微球也是本發(fā)明的保護 范圍。
[0020] 本發(fā)明β-受體激動劑替代模板分子印跡聚合物微球可用于吸附β-受體激動劑；
[0021] 所述β-受體激動劑可為沙美特羅、異克舒令、克倫賽羅、拉貝特羅、萊克多巴胺、利 托君、溴布特羅、溴氯布羅、噴布特羅、馬噴特羅和異克倫潘特中至少一種。
[0022] 上述應用中，所述吸附可在PBS緩沖溶液或乙酸銨緩沖溶液中進行；
[0023]所述PBS緩沖溶液或所述乙酸銨緩沖溶液的pH值可為2~11.0,具體可為3~8或 6.5〇
[0024] 所述吸附的時間可為5~30min，具體可為5min。
[0025] 本發(fā)明所述β-受體激動劑替代模板分子印跡聚合物微球還可用于檢測尿液中的 β-受體激動劑。
[0026]本發(fā)明具有如下有益效果：
[0027] 本發(fā)明將利用分子印跡聚合物中的模板分子與激動劑空間構型相匹配、具有多重 作用點的空穴，能對激動劑進行選擇性識別，因此具有了更好的包結絡合能力和化學穩(wěn)定 性。本發(fā)明運用多種手段對于制得的分子印記微球進行表征，以表現(xiàn)所制備微球優(yōu)良的性 能，并對其吸附性能進行了測試。本發(fā)明測試了分子印跡聚合物磁性微球?qū)κ荏w激動劑 的吸附性能，并用HPLC/MS/MS對其吸附性能進行檢測，并將其應用與尿液中β-受體激動劑 的測定。
【附圖說明】
[0028] 圖1為本發(fā)明實施例1制備的分子印跡聚合物微球的掃描電鏡照片。
[0029]圖2為本發(fā)明實施例1制備的麗IP與麗IP對β-受體激動劑的吸附量。
[0030] 圖3為本發(fā)明實施例1制備的麗IP在不同pH值條件下對β-受體激動劑的吸附效果。
[0031] 圖4為本發(fā)明實施例1制備的麗IP對β-受體激動劑的吸附量隨吸附時間的變化。
[0032] 圖5為本發(fā)明實施例1制備的MMIP對尿液中β-受體激動劑的吸附量隨吸附時間的 變化。
【具體實施方式】
[0033] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0034] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0035]下述實施例中HPLC-MS/MS的檢測方法如下：
[0036] 1、LC_MS/MS 的條件：
[0037] a)色譜柱:Ci8 100mmX3.0mm，粒徑 1·7μηι。
[0038] b)柱溫：40 °C。
[0039] c)進樣量：10yL。
[0040] d)流動相及流速見表1。
[0041 ] 表1流動相及流速表
[0042]
[0043] 2、質(zhì)譜條件：
[0044] a)離子源:電噴霧離子源。
[0045] b)掃描方式:正離子模式。
[0046] c)檢測方式:多反應監(jiān)測。
[0047] d)脫溶劑氣、錐孔氣、碰撞氣均為高純氮氣及其他合適氣體，使用前應調(diào)節(jié)各氣體 流量以使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求。
[0048] e)毛細管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等電壓值應優(yōu)化至最佳靈敏度。
[0049] f)定性離子對、定量離子對及對應的錐孔電壓和碰撞能量見表2。
[0050] 表2 β-受體激動劑的定性、定量離子對及錐孔電壓、碰撞電壓的參考值
[0051]
[0052]
[0053] 實施例1、β_受體激動劑替代模板分子印跡聚合物微球(MMIP)的制備
[0054] 將對羥基苯乙胺0.138g、MMA 850mL(0.8024g)溶解于15mL乙腈中，超聲15min，25 °C放置4h，使模板分子與功能單體充分發(fā)生作用，然后加入二乙烯基苯lmL( 20mmol， 0.919g)、AIBN 20mg，超聲處理lOmin，使其充分溶解混合，向混合溶液中通入N22min后，密 封，于60 °C水浴聚合24h，得玻璃狀的固體聚合物(MIP)。將該聚合物粉碎、聚合物進行研磨， 再使用300目的篩子進行篩分，得到粒徑小于48μπι的聚合物;再使用質(zhì)量分數(shù)為5~20%乙 酸的甲醇溶液洗脫模板分子，再使用甲醇進行清洗，至清洗液中無雜質(zhì)，再在溫度為60°C下 進行干燥9h~12h，得到β-受體激動劑復合模板分子印跡聚合物。
[0055] 本實施例制備的分子印跡聚合物微球的掃描電鏡照片(5.0kv，5.6mm，10.0 k)如圖 1所示，可以看出，麗IP呈大小均勻的球狀，內(nèi)徑約為lym左右。
[0056] 本發(fā)明為了對比本發(fā)明ΜΜΙΡ的表征和吸附效果，制備了非分子印跡聚合物作為對 照，記為ΜΝΙΡ，制備方法基本與上述方法相同，不同之處在于:在制備方法中不加入模板分 子對羥基苯乙胺。
[0057] 實施例2、β_受體激動劑替代分子印跡聚合物微球吸附性能的研究
[0058] (1 )β_受體激動劑替代分子印跡聚合物微球的吸附選擇性
[0059] 分別準確配制100ng/mL的22種結構類似物的ρΗ8·0的PBS標準溶液，加入10mg的分 子印跡微球吸附相同時間后進行HPLC-MS/MS檢測。
[0060]吸附結果見表3,結果表明合成的分子印跡微球?qū)τ诳藗愄亓_、沙丁胺醇、氯丙那 林、西馬特羅、馬步特羅等激動劑的吸附效果最差，吸附率不足35%。而對苯乙醇胺A、拉貝 特羅、異克舒令和沙美特羅的吸附率可以達到99%以上，其它如萊克多巴胺，班布特羅等結 構類似物吸附效率相對偏低，但也可達50%以上。這可能是由于MMIP在吸附過程中優(yōu)先選 擇的是對羥基苯乙酮類的化合物，然后再根據(jù)空腔中的活性位點選擇其它化合物。本發(fā)明 中合成的分子印跡微球?qū)τ诙喾N激動劑藥物都有較高的吸附效率，這說明MMIP已經(jīng)可以于 用激動劑類藥物萃取和處理。
[0061 ]表3麗IP對于各種激動劑的吸附情況
[0062]
[0063] (2)分子印跡磁性微球與非分子印跡微球的比較
[0064]配制200yg/L的苯乙醇胺A、拉貝特羅、沙美特羅和萊克多巴胺的標準溶液，分別加 入10mg的MMIP和MNIP顆粒，以2mL pH6.5的PBS緩沖溶液吸附相同時間后，0.8mL 2%乙酸-水洗脫后進行HPLC/MS/MS檢測，吸附量如圖2所示，可以看出，MMIP吸附后的激動劑明顯多 于麗IP，大約為麗IP的2~4倍。
[0065] (3)MMIP的吸附溶液與實驗條件
[0066] 配制的100ng/mL標準溶液，分別以超純水、不同pH的roS緩沖溶液、0.1M鹽酸溶液 和0.1M氫氧化鈉溶液作溶劑，加入1 Omg制備的分子印記微球，吸附相同時間后進行HPLC/ MS/MS檢測。同時添加空白實驗，結果如圖3所示。
[0067]由圖3可以看出，本發(fā)明分子印記微球在pH3~8.0的PBS緩沖溶液中達到較好的吸 附效果，而在強酸或強堿條件下吸附效果較差。
[0068] (4)MMIP的洗脫溶液優(yōu)化條件
[0069] 取實施例1中制備的聚合物，加入2mL不同的洗脫溶液，漩渦混合，于搖床上搖動 30min，離心，上機檢測，進行不同種洗脫溶劑進行考察。結果發(fā)現(xiàn)用5~10wt%的乙酸或甲 酸的甲醇溶液均將MMIP上的目標分子全部洗脫下來;考慮到實際應用，因此選用5~10%甲 酸的甲醇溶液作為洗脫溶劑。
[0070] (5)分子印跡微球的吸附時間考察
[0071] 分別準確稱取1 Omg分子印記微球，在1ml，pH = 6 · 5，20ppb濃度的激動劑的PBS溶液 中，分別在搖床上以163r/min的速度常溫搖振吸附2、5、10、20、30和50min，再離心5min， 5000r/min取上清液，將吸附液氮氣吹干，用lml 0.1 %甲酸水溶液復溶，過0.22μπι水膜，最 后上機檢測，計算激動劑的吸附效率。
[0072] 結果如圖4所示，由圖4可以看出，該分子印記微球?qū)觿┪皆?min左右達到 飽和吸附，當吸附時間超過5min的時候，吸附量保持穩(wěn)定，因此吸附時間選擇5min為宜。
[0073]實施例4、MMIP對尿液中激動劑的方法應用
[0074] 1、吸附與洗脫時間實驗條件
[0075] (1)分子印記微球在尿液體系中的吸附效果
[0076] 取空白尿液樣品2mL，置于具塞離心管中，準確加入100ng/mL激動劑和2mL0.2mM乙 酸銨溶液，50μ?3-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，20yL激動劑內(nèi)標標準溶液和10mg分子印記 微球。渦旋混勻30s。反應30min，檢測其吸附能力，結果如表2所示。
[0077]由表2中的數(shù)據(jù)可以看出，雖然與PBS溶液體系相比，吸附能力有所下降，但是回收 率仍然能達到50%以上，結果表明，本發(fā)明制備的分子聚合物微球可以應用于尿液酶解體 系中，并且吸附效果較好。
[0078] 表4 MMIP在PBS溶液(pH值為6.5)和尿液中對于各種激動劑的吸附情況
[0079]
[0080]
[0081 ] (2)分子印記微球在尿液體系中的穩(wěn)定性
[0082] 取空白尿液樣品2mL，置于具塞離心管中，準確加入1 OOng苯乙醇胺A、拉貝特羅、沙 美特羅和萊克多巴胺標準溶液和2mL 0.2mM乙酸銨溶液，50μ?3-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯 酶，20yL激動劑內(nèi)標標準溶液和10mg分子印記微球。渦旋混勻30s。分別在搖床上以163r/ min的速度常溫搖振2h、4h、8h和16h，結果如圖5所不。結果表明：在16小時內(nèi)，所制備的分子 聚合物微球吸附量維持不變，吸附穩(wěn)定性好。
[0083] (3)分子印記在尿液中的洗脫條件的選擇
[0084] 洗脫實驗：溶液清除的分子印記材料，加入lmL 5 %甲酸的甲醇溶液，分別混合 3〇8、1111；[11、21]1；[11和51]1；[11，結果表明，該分子在5%甲酸甲醇洗脫效果良好，可以直接混合308， 便可進行處理。
[0085] 2、應用麗IP測定尿液中激動劑的方法
[0086] 稱取2~5mL樣品于50mL離心管中，準確加入2~5mL乙酸銨溶液(4.6)和50μLβ-葡 萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，20yL激動劑內(nèi)標標準溶液、20~50mg分子印記微球。37 °C水解 過夜(應大于16小時），然后于8000r/min離心5min，棄去上清液。加入2mL5%甲酸甲醇，漩禍 混合30s，收集上清液，用氮吹儀在50°C條件下吹干或用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，用1. OmL樣品稀釋 液溶解，過0.22μπι濾膜。用HPLC-MS/MS法測定，分別相應的氘代內(nèi)標物作為內(nèi)標以內(nèi)標法定 量。使用該方法測定尿液中11種激動劑回收率大于75%，相對偏差小于15%。
【主權項】
1. 一種β-受體激動劑替代模板分子印跡聚合物微球的制備方法，包括如下步驟： (1) 將模板分子和甲基丙烯酸進行預聚合； 所述模板分子為對羥基苯乙醇或?qū)αu基苯乙胺； (2) 向所述預聚合后的體系中加入二乙烯基苯和偶氮二異丁腈，進行聚合反應，得到聚 合物； (3) 用乙酸的甲醇溶液洗滌所述聚合物，即得所述β-受體激動劑替代模板分子印跡聚 合物微球。2. 根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(1)中，所述預聚反應在乙腈中進 行； 所述預聚反應的溫度為25°C~30°C，時間為1.0~4.0小時。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，所述聚合反應在惰性 氣氛下進行； 所述聚合反應的溫度為40~60 °C，時間為12~24小時。4. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的制備方法，其特征在于:所述模板分子、所述甲基 丙稀酸、所述二乙烯基苯與所述2,2'-偶氮二異丁腈的質(zhì)量比為1:4~10:5~10:0.1~0.4。5. 根據(jù)權利要求1-4中任一項所述的制備方法，其特征在于:所述乙酸的甲醇溶液中乙 酸的質(zhì)量百分含量為5~20% ; 所述洗滌步驟之后，所述方法還包括用甲醇清洗所述聚合物的步驟。6. 權利要求1-5中任一項所述方法制備的β-受體激動劑替代模板分子印跡聚合物微 球。7. 權利要求6所述β-受體激動劑替代模板分子印跡聚合物微球在吸附β-受體激動劑中 的應用； 所述受體激動劑為沙美特羅、異克舒令、克倫賽羅、拉貝特羅、萊克多巴胺、利托君、 溴布特羅、溴氯布羅、噴布特羅、馬噴特羅和異克倫潘特中至少一種。8. 根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于:所述吸附在PBS緩沖溶液或乙酸銨緩沖溶 液中進行； 所述吸附的時間為5~30min。9. 根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于:所述PBS緩沖溶液或所述乙酸銨緩沖溶液 的pH值為2~11.0。10. 權利要求6所述β-受體激動劑替代模板分子印跡聚合物微球在檢測尿液中β-受體 激動劑中的應用； 所述受體激動劑為沙美特羅、異克舒令、克倫賽羅、拉貝特羅、萊克多巴胺、利托君、 溴布特羅、溴氯布羅、噴布特羅、馬噴特羅和異克倫潘特中至少一種。
【文檔編號】C08F212/36GK106084115SQ201610409394
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】索德成, 王培龍, 蘇曉鷗, 李陽, 王瑞國, 張春艷
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所