本發(fā)明涉及海洋殼寡糖單體分離純化研究領域，具體地說是一種基于分子印跡技術的殼四糖單體分離提取方法。

背景技術：

寡糖(oligosaccharides)及糖綴合物是生物體內重要的信息物質，在生命過程的細胞識別、信號傳導和受體調節(jié)過程中扮演著極其重要的角色。殼寡糖(Chitooligosaccharides, COS)是由海洋甲殼質經脫乙?；⒔到庖院蟮玫降漠a物，一般是由3-10個氨基葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵連接而成。殼寡糖分子量低能溶于水，且具有優(yōu)于殼聚糖的生物活性，在保健品、生物化工材料以及食品等領域被廣泛利用。目前海洋殼寡糖單體的分離制備存在如下問題：(1) 純度低。由于殼寡糖分離純化工藝復雜，采用分步沉降法和膜分離法等常規(guī)分離方法，難以得到高純度的殼寡糖單體。因此，目前市售的海洋殼寡糖產品大部分都是低聚合度的殼寡糖混合物，制約了殼寡糖的高值化開發(fā)利用。(2) 產量小。目前所采用的凝膠色譜法、離子交換色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、醋酸纖維膜電泳法、高效液相色譜法和高效毛細管電泳、快速制備液相色譜儀和灌注層析等儀器分離方法只能制備少量的殼寡糖單體(通常在mg級水平)，難以實現殼寡糖單體的規(guī)?；蛛x制備。(3) 價格貴。目前市場上高純度海洋殼寡糖單體(聚合度n = 4~6)是以mg級包裝，價格昂貴。例如高純度的殼四糖至殼六糖單體，銷售價格1500~1600元/10mg左右。因此，高純度的不同聚合度殼寡糖單體的規(guī)?；苽洌蔀橹萍s其應用開發(fā)的技術瓶頸。尋找新的分離方法和技術，并實現其規(guī)模化制備是殼寡糖開發(fā)利用的難點問題之一。綜上所述，由于殼寡糖單體(n = 4~6)之間物理化學性質和化學結構的差異性非常小，常規(guī)的分離提取技術在其提取領域進行規(guī)?；茝V使用受到制約，因此，殼寡糖單體規(guī)模化分離提取困難，成為制約其應用開發(fā)的技術瓶頸。尋找新的分離方法和技術，并實現其規(guī)?；苽涫菤す烟菃误w開發(fā)利用的難點問題之一。

分子印跡聚合物（MIP）是一種基于分子印跡技術( MIT)的新的分離材料，主要用于復雜和預處理手續(xù)繁雜的生物或環(huán)境樣品的分離、提純和濃縮樣。MIP制備方便，是一種價格低廉的高效分離材料，易于實現具有克級 (甚至千克級) 的制備規(guī)模，成為對復雜體系分離提取新興的研究方向[1,2]。隨著MIT的不斷發(fā)展，近年來國內外科研工作者成功地將該技術用于海洋天然產物的分離提純。例如，國家海洋局第一海洋研究所的王小如課題組將MIT用于海洋微生物生物堿活性成分的分離提取，取得了很好的分離效果[3]。日本學者Takuya Kubo等人[4]將MIT用于海洋貝類毒素軟骨藻酸的色譜分離，從有毒貝類中提取貝類毒素軟骨藻酸。為探索糖的分離和測定新方法，國內外學者又將MIT拓展到糖化學研究領域。例如，Zhiliang Cheng[5] 、Yiqun Yang[6] 和Manju[7]等將MIT與電化學分析、熒光分析等技術相結合，用于單糖的分離和測定；美國的Parmpi[8]等利用MIT制備了MIP水凝膠，用于葡萄糖等單糖的分離和識別；法國的Sineriz[9]研究團隊，以葡萄糖-6-O-硫酸鹽為模板，研究了MIT在葡萄糖-6-O-硫酸鹽識別的應用；土耳其的Okutucu[10]等利用MIT合成了以非共價鍵識別模式的半乳糖MIP，用于葡萄糖、甘露糖、果糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖和棉子糖等三糖以下糖的選擇性識別，在糖的識別研究方面取得了很好的成果。MIT在糖化學領域的這些成功應用，為海洋殼寡糖單體的分離提供了重要的理論依據和技術支撐。綜觀國內外研究現狀，模板分子大部分是三糖(例如棉子糖)以下的單糖和雙糖，三糖以上寡糖的分離和識別的研究鮮見報道，而MIT在海洋殼寡糖的分離研究尚未見報。

技術實現要素：

本發(fā)明的技術任務是提供一種生產成本低、制備的殼四糖單體產品純度高的基于分子印跡技術的殼四糖單體分離提取方法。

本發(fā)明的技術任務是按以下方式實現的，該分離提取方法步驟如下：

1）布袋式過濾：將殼聚糖酶解液用布袋式過濾機進行過濾，并靜置澄清20min，除去殼聚糖酶解液中的顆粒雜質和不溶物；

2）納濾膜過濾：將布袋式過濾機過濾后的液體用納濾膜G5進行過濾，獲得平均分子量小于1000DA的殼寡糖混合組分透過液；

3）殼四糖分子印跡樹脂吸附：將殼寡糖混合組分透過液流過裝有殼四糖分子印跡樹脂的樹脂柱，利用殼四糖分子印跡樹脂選擇性吸附透過液中的殼四糖，實現殼四糖單體與其它殼寡糖組分的分離；

4）殼四糖分子印跡樹脂洗脫：殼四糖分子印跡樹脂吸附飽和后，用洗脫劑進行洗脫；

5）脫除鋅離子：將洗脫液用活性炭G-60處理后過濾，使得殼四糖和鋅離子分離，殼四糖被活性炭吸附；收集活性炭，然后用乙醇與去離子水的混合液將殼四糖洗脫下來，并用鹽酸溶液調節(jié)溶液pH值至2-4；

6）冷凍干燥：收集殼四糖洗脫液，經真空濃縮凍干后，得到殼四糖單體產品。

所述的步驟2）中殼四糖分子印跡樹脂的合成方法如下：

殼四糖分子印跡樹脂中各原料的重量配比為：主單體65-95份；配位單體5-15份；致孔劑5-9份；分散劑0.5-1.5份；引發(fā)劑0.05-0.3份；

將配位單體和引發(fā)劑按重量份配比溶于無水乙醇中，使得配位單體和引發(fā)劑在無水乙醇中的質量百分比濃度為10-20%，然后將混合液與主單體，致孔劑混合均勻；在強力攪拌下，將此混合體系緩慢加到含有分散劑的三口燒瓶中，通入氮除氧30 min；用恒溫水浴加熱至72-78℃，調控攪拌速度，聚合反應6h，然后升溫至80-90℃再繼續(xù)反應3h；冷至20-30℃后，將聚合物微球過濾、洗滌得到分子印跡樹脂微球；將制備的分子印跡樹脂微球裝入萃取器中，用無水乙醇萃取處理6h，除去致孔劑、引發(fā)劑和未反應的少量殘留單體，室溫涼干后，用洗脫劑溶液攪拌浸泡處理，洗脫掉印跡模板分子和鋅離子，再用去離子水洗至pH值至6-8，然后用0.01mol/L的鋅離子溶液配位平衡后，并在50-70℃真空干燥，制得殼四糖分子印跡樹脂微球。

所述的配位單體為N-[2-(二甲氨基)乙基]-N'-[(2-羥基-4-乙烯基苯基)]草酰胺雙核鋅-殼四糖，主單體為乙二醇二甲基丙烯酸酯，致孔劑為石油醚90-120，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈，分散劑為聚乙烯醇。

所述的洗脫劑為0.1 mol/L的鹽酸溶液。

所述的乙醇和去離子水的混合液中乙醇與去離子水的質量比為1:1。

本發(fā)明的一種基于分子印跡技術的殼四糖單體分離提取方法和現有技術相比，具有以下特點：

1）采用殼四糖分子印跡樹脂吸附工藝，高選擇性從殼聚糖酶解液中分離提取殼四糖單體的方法，與其它水溶性殼寡糖提取技術（專利申請?zhí)?01310660738；201310019782；201310270184）相比，實現了目標分離物殼四糖單體與其它殼寡糖組分的分離，所制備的殼四糖單體產品純度高。

2）采用殼四糖分子印跡樹脂吸附工藝，從殼聚糖酶解液中分離提取殼四糖單體的方法，與其它殼寡糖單體分離技術（專利申請?zhí)?01110068951；201210146042）制備水平相比，可實現千克級的規(guī)?；苽?。

3）采用殼四糖分子印跡樹脂吸附工藝，從殼聚糖酶解液中分離提取殼四糖單體的方法，分離提取工藝不僅簡單，而且制備產量大，殼四糖單體產品生產成本低，市場競爭力強。

附圖說明

附圖1為殼聚糖酶解產物的HPLC分析圖譜。

附圖2為自制殼四糖單體的HPLC圖譜。

附圖3為殼四糖單體標準品的MALDI-TOF-MS圖譜。

附圖4為自制殼四糖單體樣品的MALDI-TOF-MS圖譜。

具體實施方式

實施例1：

備料：取65kg乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）；5kg N-[2-(二甲氨基)乙基]-N'-[(2-羥基-4-乙烯基苯基)]草酰胺雙核鋅-殼四糖；5kg石油醚90-120；0.5kg聚乙烯醇（PVA）；0.05kg偶氮二異丁腈（AIBN）；

制備殼四糖分子印跡樹脂：將N-[2-(二甲氨基)乙基]-N'-[(2-羥基-4-乙烯基苯基)]草酰胺雙核鋅-殼四糖和偶氮二異丁腈按重量份配比溶于無水乙醇中，使得N-[2-(二甲氨基)乙基]-N'-[(2-羥基-4-乙烯基苯基)]草酰胺雙核鋅-殼四糖和偶氮二異丁腈在無水乙醇中的質量百分比濃度為10%，然后將混合液與乙二醇二甲基丙烯酸酯，石油醚90-120混合均勻；在強力攪拌下，將此混合體系緩慢加到含有聚乙烯醇的三口燒瓶中，通入氮除氧30 min；用恒溫水浴加熱至72℃，調控攪拌速度，聚合反應6h，然后升溫至80℃再繼續(xù)反應3h；冷至20℃后，將聚合物微球過濾、洗滌得到分子印跡樹脂微球；將制備的分子印跡樹脂微球裝入萃取器中，用無水乙醇萃取處理6h，除去石油醚90-120、偶氮二異丁腈和未反應的少量殘留單體，室溫涼干后，用0.1 mol/L的鹽酸溶液攪拌浸泡處理，洗脫掉印跡模板分子和鋅離子，再用去離子水洗至pH值至6，然后用0.01mol/L的鋅離子溶液配位平衡后，并在50℃真空干燥，制得殼四糖分子印跡樹脂微球，備用。

分離提取殼四糖單體方法步驟如下：

1）布袋式過濾：將質量百分比含量5%的殼聚糖酶解液100kg用布袋式過濾機進行過濾，并靜置澄清20min，除去殼聚糖酶解液中的顆粒雜質和不溶物；

2）納濾膜過濾：將布袋式過濾機過濾后的液體用納濾膜G5進行過濾，獲得平均分子量小于1000DA的殼寡糖混合組分透過液；

3）殼四糖分子印跡樹脂吸附：將殼寡糖混合組分透過液流過裝有100kg殼四糖分子印跡樹脂的樹脂柱，控制進樣流速30立升/小時，利用殼四糖分子印跡樹脂選擇性吸附透過液中的殼四糖，實現殼四糖單體與其它殼寡糖組分的分離；

4）殼四糖分子印跡樹脂洗脫：殼四糖分子印跡樹脂吸附飽和后，用25kg0.1 mol/L的鹽酸溶液進行洗脫，控制洗脫流速20立升/小時，收集到含殼四糖的洗脫液25公斤；

5）脫除鋅離子：將洗脫液用4kg活性炭G-60處理后過濾，使得殼四糖和鋅離子分離，殼四糖被活性炭吸附；收集活性炭，然后用10kg乙醇與去離子水的混合液將殼四糖洗脫下來，乙醇與去離子水的質量比為1:1,并用鹽酸溶液調節(jié)溶液pH值至2；

6）冷凍干燥：收集殼四糖洗脫液，經真空濃縮凍干后，得到1.2kg殼四糖單體產品, 殼四糖單體提取率1.2%，產品純度93.6%。

實施例2：

備料：取80kg乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）；10kg N-[2-(二甲氨基)乙基]-N'-[(2-羥基-4-乙烯基苯基)]草酰胺雙核鋅-殼四糖；7kg石油醚90-120；1kg聚乙烯醇（PVA）；0.15kg偶氮二異丁腈（AIBN）；

制備殼四糖分子印跡樹脂：將N-[2-(二甲氨基)乙基]-N'-[(2-羥基-4-乙烯基苯基)]草酰胺雙核鋅-殼四糖和偶氮二異丁腈按重量份配比溶于無水乙醇中，使得N-[2-(二甲氨基)乙基]-N'-[(2-羥基-4-乙烯基苯基)]草酰胺雙核鋅-殼四糖和偶氮二異丁腈在無水乙醇中的質量百分比濃度為15%，然后將混合液與乙二醇二甲基丙烯酸酯，石油醚90-120混合均勻；在強力攪拌下，將此混合體系緩慢加到含有聚乙烯醇的三口燒瓶中，通入氮除氧30 min；用恒溫水浴加熱至75℃，調控攪拌速度，聚合反應6h，然后升溫至85℃再繼續(xù)反應3h；冷至25℃后，將聚合物微球過濾、洗滌得到分子印跡樹脂微球；將制備的分子印跡樹脂微球裝入萃取器中，用無水乙醇萃取處理6h，除去石油醚90-120、偶氮二異丁腈和未反應的少量殘留單體，室溫涼干后，用0.1 mol/L的鹽酸溶液攪拌浸泡處理，洗脫掉印跡模板分子和鋅離子，再用去離子水洗至pH值至7，然后用0.01mol/L的鋅離子溶液配位平衡后，并在60℃真空干燥，制得殼四糖分子印跡樹脂微球，備用。

分離提取殼四糖單體方法步驟如下：

1）布袋式過濾：將質量百分比含量6%的殼聚糖酶解液100kg用布袋式過濾機進行過濾，并靜置澄清20min，除去殼聚糖酶解液中的顆粒雜質和不溶物；

2）納濾膜過濾：將布袋式過濾機過濾后的液體用納濾膜G5進行過濾，獲得平均分子量小于1000DA的殼寡糖混合組分透過液；

3）殼四糖分子印跡樹脂吸附：將殼寡糖混合組分透過液流過裝有100kg殼四糖分子印跡樹脂的樹脂柱，控制進樣流速30立升/小時，利用殼四糖分子印跡樹脂選擇性吸附透過液中的殼四糖，實現殼四糖單體與其它殼寡糖組分的分離；

4）殼四糖分子印跡樹脂洗脫：殼四糖分子印跡樹脂吸附飽和后，用25kg0.1 mol/L的鹽酸溶液進行洗脫，控制洗脫流速20立升/小時，收集到含殼四糖的洗脫液25公斤；

5）脫除鋅離子：將洗脫液用4kg活性炭G-60處理后過濾，使得殼四糖和鋅離子分離，殼四糖被活性炭吸附；收集活性炭，然后用10kg乙醇與去離子水的混合液將殼四糖洗脫下來，乙醇與去離子水的質量比為1:1,并用鹽酸溶液調節(jié)溶液pH值至3；

6）冷凍干燥：收集殼四糖洗脫液，經真空濃縮凍干后，得到1.3kg殼四糖單體產品, 殼四糖單體提取率1.3%，產品純度94.5%。

實施例3：

備料：取95kg乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）；15kg N-[2-(二甲氨基)乙基]-N'-[(2-羥基-4-乙烯基苯基)]草酰胺雙核鋅-殼四糖；9kg石油醚90-120；1.5kg聚乙烯醇（PVA）；0.3kg偶氮二異丁腈（AIBN）；

制備殼四糖分子印跡樹脂：將N-[2-(二甲氨基)乙基]-N'-[(2-羥基-4-乙烯基苯基)]草酰胺雙核鋅-殼四糖和偶氮二異丁腈按重量份配比溶于無水乙醇中，使得N-[2-(二甲氨基)乙基]-N'-[(2-羥基-4-乙烯基苯基)]草酰胺雙核鋅-殼四糖和偶氮二異丁腈在無水乙醇中的質量百分比濃度為20%，然后將混合液與乙二醇二甲基丙烯酸酯，石油醚90-120混合均勻；在強力攪拌下，將此混合體系緩慢加到含有聚乙烯醇的三口燒瓶中，通入氮除氧30 min；用恒溫水浴加熱至78℃，調控攪拌速度，聚合反應6h，然后升溫至90℃再繼續(xù)反應3h；冷至30℃后，將聚合物微球過濾、洗滌得到分子印跡樹脂微球；將制備的分子印跡樹脂微球裝入萃取器中，用無水乙醇萃取處理6h，除去石油醚90-120、偶氮二異丁腈和未反應的少量殘留單體，室溫涼干后，用0.1 mol/L的鹽酸溶液攪拌浸泡處理，洗脫掉印跡模板分子和鋅離子，再用去離子水洗至pH值至8，然后用0.01mol/L的鋅離子溶液配位平衡后，并在70℃真空干燥，制得殼四糖分子印跡樹脂微球，備用。

分離提取殼四糖單體方法步驟如下：

1）布袋式過濾：將質量百分比含量7%的殼聚糖酶解液100kg用布袋式過濾機進行過濾，并靜置澄清20min，除去殼聚糖酶解液中的顆粒雜質和不溶物；

2）納濾膜過濾：將布袋式過濾機過濾后的液體用納濾膜G5進行過濾，獲得平均分子量小于1000DA的殼寡糖混合組分透過液；

3）殼四糖分子印跡樹脂吸附：將殼寡糖混合組分透過液流過裝有100kg殼四糖分子印跡樹脂的樹脂柱，控制進樣流速30立升/小時，利用殼四糖分子印跡樹脂選擇性吸附透過液中的殼四糖，實現殼四糖單體與其它殼寡糖組分的分離；

4）殼四糖分子印跡樹脂洗脫：殼四糖分子印跡樹脂吸附飽和后，用25kg0.1 mol/L的鹽酸溶液進行洗脫，控制洗脫流速20立升/小時，收集到含殼四糖的洗脫液25公斤；

5）脫除鋅離子：將洗脫液用4kg活性炭G-60處理后過濾，使得殼四糖和鋅離子分離，殼四糖被活性炭吸附；收集活性炭，然后用10kg乙醇與去離子水的混合液將殼四糖洗脫下來，乙醇與去離子水的質量比為1:1,并用鹽酸溶液調節(jié)溶液pH值至4；

6）冷凍干燥：收集殼四糖洗脫液，經真空濃縮凍干后，得到1.4kg殼四糖單體產品, 殼四糖單體提取率1.4%，產品純度95.1%。

殼四糖單體的分析檢測實驗

1. 實驗儀器

Waters 公司的Breeze HPLC，301型蒸發(fā)光散色檢測器；Shodex公司的Asahipak NH2P-50 4E柱；

MALDI-TOF-MS檢測儀器為:Bruker 公司的Autoflex TOF MS；

2. 色譜條件

殼四糖及混合殼寡糖含量采用高效液相色譜法測定，測定方法如下：

HPLC分析條件的設定：色譜柱，Asahipak NH2P-50 4E柱(4.6mm ID × 250 mm/L，Shodex 公司)；流動相, φ = 75/25，流速1.0 mL/min；檢測器, 301型蒸發(fā)光散色檢測器，柱溫30 ℃。

3. HPLC分析結果

3.1 酶解產物的HPLC分析結果

圖1色譜圖結果表明，應用Shodex NH2P-50 4E氨基柱(Asahipak)在本試驗的條件下，基本可以將不同聚合度的殼寡糖分離開，從峰高和積分面積大致可以推算酶解產物中3-6糖占產物的絕大多數，其中4糖、5糖組分最多。

3.2 制備殼四糖單體的HPLC圖譜

自制的殼四糖的檢測結果見圖2。由圖2可見，在本實驗條件下，殼四寡糖單體出峰尖銳，峰型漂亮，雜質分次明顯。比較檢測結果，殼四糖純度高。

4.制備殼四糖單體的MALDI-TOF-MS圖譜

殼聚糖單體鹽酸化合物在質譜檢測中顯示的是丟失鹽酸鹽的分子式的分子量。圖3中殼四糖標準品帶4個鹽酸鹽，質譜(ESI正離子模式)顯示的是[662+H]+ (808-36.5*4 = 662), 即打印出來顯示的663。圖4中所分離得到的待測樣品顯示了與殼四糖標準品相同的分子量。

通過上面具體實施方式，所述技術領域的技術人員可容易的實現本發(fā)明。但是應當理解，本發(fā)明并不限于上述的幾種具體實施方式。在公開的實施方式的基礎上，所述技術領域的技術人員可任意組合不同的技術特征，從而實現不同的技術方案。